1. צמיחה של פשתן בתנאים גרימת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 &quot;סירים מלאים באדמה firmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה זרעים לכל סיר נטועים ¼ אינץ עמוק באדמה firmed על הזרעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סירים הם להשקות אז עם 100 מ&quot;ל של פתרונות תזונה מתאימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא גרימת (ג) תנאי השליטה להשתמש כוח 1 / 10 ה Miracle-Gro מדי שבוע. מצב תזונתי גבוה (NPK הטיפול) היה נס כוח מלא לגדול להחיל שבועי. מזין נמוכה - צמחים רק מי ברז מיושם ברחבי הצמיחה שלהם. (Durrant 1971, Cullis 1980). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמחים גדלים תחת אור טבעי במהלך הקיץ. בחורף הם גדלו תחת אורות נתרן עם מחזור אור / חושך 16 / 8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרווחים שבועי עלים meristems נאספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החומר צמח הוא קפוא מהירה בחנקן נוזלי. </li></ol> תוצאות שלושת גנוטיפים לצמוח בשיעורים יחסית שונה בהתאם לתנאי (איור 1). לכן בתנאים לשלוט קו Pl גדל בצורה הטובה ביותר עם L להיות נמרצת יותר S (איור 1 א). תחת מזינים נמוכה (מים), S גדל יותר או L או Pl (איור 1b). תחת תזונתי גבוה (NPK) L גדל יותר Pl שרק גדל מעט טוב יותר מאשר S (איור 1 ג&#39;). השוואה בין כל השורות גדל פי שלושה טיפולים שונים מוצג באיור 1 ד - ו Pl גדל הטובה ביותר בתנאים הביקורת (איור 1d), L הטובה ביותר תחת תזונתי גבוה (איור 1e) ו-S דומה תחת מזין הן גבוהות ותנאים הביקורת (איור 1f). נתונים אלו מראים כי שלושת הקווים יכול להיות מובחן על בסיס הצמיחה שלהם תחת שלוש סביבות. יש לציין כי Pl גדל בתנאים הטובים ביותר תוך שליטה L גדל הטובה ביותר בתנאים NPK (תחת אשר היה מושרה). S גדל על זהה בכל שלושת התנאים, כלומר, הוא אינו מסוגל לנצל את התנאים תזונתי משופר, אך הוא מסוגל יותר לגדול בתנאים תזונתי נמוך מאוד. הפרמטרים צמיחה שרלוונטיות בידול של צמחים כוללים את גובה הצמח (הקשורים עם אורך זה internode, כלומר המרחק בין כל עלה), גודל העלה ואת מידת הסתעפות. עבור Pl בתנאים בקרה צמח גבוה עם ענפים ועלים ירוקים גדולים וכהים. תחת מזינים צמח נמוך הוא קצר מאוד, המרחק בין כל עלה גם הוא קצר מאוד העלים ירוק קטן וקל. העלים בקצה ירוקים כהים יותר מאלו למטה גזע. תחת מזינים גבוהה הצמח נראה דומה מאוד לזו בתנאים השליטה אלא גם את גזע הראשי יורה לוואי קצר יותר מאשר במפעלי שליטה. עבור genotroph הגדול הצמחים נראים דומים מאוד לאלה של Pl מלבד הגידול הנמרץ ביותר כי תחת מזינים גבוהה. שוב תחת חומרים מזינים צמח נמוך הוא קצר מאוד ויש לו עלים בצבע ירוק בהיר. Genotroph S גדל באופן דומה בכל שלושת סביבות למרות העלים ירוק בהיר תחת מזינים נמוכה. עם זאת, התנאים התזונתי נמוך genotroph S הרבה יותר נמרצת יותר משתי שורות Pl או L. 2. RNA ו-DNA עקירות מ meristems פשתן ועלים נעשים בנפרד. סך רוש RNA ערכת הכנה שימש עקירות RNA ו-DNA DNeasy Qiagen הצמח מכין ערכת שימש עקירות DNA. הפקת רנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 meristems בתוספת כמה עלים סביב מועברים מן cryovial אחסון לתוך צינור Eppendorf והניח לתוך חנקן נוזלי עד מוכן להיות הקרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חול סטרילית מתווסף צינור רקמות הקרקע באמצעות micropestle עד דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 תמוגה ul / חיץ מחייב מ רוש סך RNA ערכת הכנה נוסף ורקמות היא קרקע נוספת עד גושים לא גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמה הוא vortexed במשך 15 שניות כדי לסייע תמוגה ואז הסתחרר דקות 1 בסל&quot;ד 13,000 לאסוף חול וכל פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant מתווסף ספין עמודה שאר הוראות הכנה RNA ערכת הם אחריו כמו מכוונת. </li></ol> DNAse טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 / 10 נפח RNA מדגם של חיץ DNAse 10X הוא הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 יחידות של DNAse נוסף והתגובה היא מודגרות על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו - 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li></ol> Reverse Transcription <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Applied Biosystems RNA לערכה cDNA משמש לכל הכיוונים, התגובה מודגרות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ו - 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li></ol> CDNA משמש אז PCR או qPCR qPCR qPCR בוצעה באמצעות מערכת אחת ABI שלב. כל מבחני בוצעו בשלושה עותקים על כל סיבוב. הגן אקטין שימש לשלוט עותק המספרמשק הבית הכי זמין גן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד פריימר מתאים נוספה צינור כל 1μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CDNA היה מדולל לריכוז 9μl מתאימים שנוספו צינור אחד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10μl של SYBR כוח 2x גרין PCR MasterMix (ABI) וכן נוספה צינור אחד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוכנית הגברה התוכנית: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 דקות 95 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 מחזורים של 15sec ב 95 ° C, 1 דקות ב 60 ° C </li></ul> Denaturation צעד תרמי לאמת סגוליות ההגברה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמות הביטוי היחסי נקבעו על ידי הערך של 2 (CTunknown - CTactin). </li></ol> ה-DNA הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר AP1 מ Qiagen DNeasy הצמח DNA ערכת הכנה מתווסף 6 עלים עם חול סטרילי בתוך שפופרת microfuge. רקמה היא קרקע עם micropestle עד גושים לא גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוראות ערכת הן בעקבות ההנחיות. </li></ol> תוצאות הגברה PCR של ה-DNA שבודד יוצאת בשעה בתפקידים שונים לאורך גזע מוכיח כי המראה של LIS-1 מתרחשת כאשר הצמחים גדלים בתנאים גרימת (4). תוצאות qPCR מראים כי נוכחות של LIS-1 (או שינויים גנומיים אחרים הקשורים הזירוז) משפיע על הביטוי של גנים בסביבה הקרובה של LIS-1 (איור 2). ששת הגנים שמוצג באיור 2 הם כולם הביעו דיפרנציאלי עם ארבעה שיש ביטוי גבוה PL (ללא LIS-1) ושני שיש ביטוי גבוה S (אשר יש LIS-1) ב Pl ו-S. לוח 1 ו -2 הם שני הגנים הקרובים אל נקודת ההוספה של LIS-1. הביטוי של גנים אלה של ב genotroph גדול (אשר יש לו שינויים המושרה אבל אין LIS-1) ואת הביטוי בתנאי גידול שונים יהיה צורך לקבוע כל קשר סיבתי בין LIS-1 ואת השינויים ביטוי. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Pl, L ו-S גדל תחת שלושה משטרים שונים מזין. לוחות - שליטה ב - מזינים נמוכה ג - NPK. ד - Pl, דואר - S, ו - פאנלים ל ד - ו, משמאל לימין: מזינים נמוכה, מלאה NPK. D - Pl, e - L, F - ס <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="איור 2 האגודל" /> איור 2. Gene הביטוי סביב נקודת הכניסה של LIS-1. ג&#39;ין 1 (מעכבי צמיחה) הוא מיד 5 &quot;אל LIs1 ואת הגן 2 (קיפ הקשורות cyclin תלויי קינאז מעכב id 3&quot; של LIS-1. הגנים האחרים הם כל הזמן הפיגום זהה (~ 500KB) בנוי מ להשלים רצף הגנום פשתן. אנא <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">לחץ כאן כדי לראות דמות גדולה</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Amplifications PCR של DNAs שחולצו מן העלים של צמחים בודדים של סטורמונט Cirrus גדל בתנאים תזונתי נמוך. המוצרים PCR הופרדו על ג&#39;ל agarose-TBE 2%. האתר uninserted מוצג בלוח, שני קצוות של האתר מוכנס מוצגים לוחות B ו-C דגימות עלים 1-6 בודדו במרווחים שבועי עם מדגם 1 להיות הראשונה לאחר הזריעה.

<ol>
	<li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum.">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax.">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li><li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmentally+induced+adaptive+(?)+insertion+event+in+flax.">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פשתן נראה הגנום יציב מטבעו. מספר זנים מסחריים סיבי פשתן הפך במהירות לא אחידה כאשר גדל במשך כמה דורות. התצפיות זהה לא נראה נכון גם לגבי זני שמן פשתן. לכן נראה שיש קשר בין הבחירה באיכות סיבים וחוסר יציבות הגנום. המושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן זוהו במקור דרך החקירה של תצפיות אגרונומית הצמיחה של היבול סיבים. תצפיות אלה הדיר של וריאציות פנוטיפי ו גנומית ספציפית מעלה את השאלה כיצד ולחץ סביבתי יכול להשפיע על חבילה של rearrangements גנומית שעלול להתרחש. המראה חוזרות ונשנות של LIS-1 בתגובה בסביבות מסוימות עולה בקנה אחד עם מוטציה זו להיות במישרין או בעקיפין שנבחר. הצמיחה של קווי המושרה על ידי טיפולים שונים גם מצביע על ביצועים משופרים בתנאים גרימת הרלוונטיים. שינויים בביטוי קשור גם עם נוכחותם של LIS-1 שוב מציין כי הכניסה הזאת להשפיע על ביצועי הצמח. מצגת וידאו מספק פורום התבוננות שינויים צמח פנוטיפי בצורה בלתי אפשרי להעביר דרך החומר המודפס המסורתי.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי פשתן של מגוון המקורי Cirrus סטורמונט מצוין Pl ואת genotrophs L ו ס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 &quot;סירים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתילה בקרקע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Miracle-Gro </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתרן בלחץ גבוה אורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנקן נוזלי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרגמה pestles </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropestles וצינורות microfuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Thermocycler </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה ציוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה דיגיטלית ההתקנה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> StepOne qPCR מודול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Qiagen DNeasy הצמח DNA ערכת הכנה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Applied Biosystems RNA לערכה cDNA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוש סך RNA ערכת הכנה </li></ul>

environmentally induced heritable changes in flax

כמה זנים פשתן להגיב ללחץ תזונתי על ידי שינוי הגנום שלהם שינויים אלה יכולים לעבור בתורשה דרך דורות רבים. קשור גם שינויים אלה הם גנטי תורשתי פנוטיפי 1,2 וריאציות. סטורמונט מגוון פשתן Cirrus (PL), כאשר גדל פי שלושה תנאים מזין שונים יכולים להישאר ועין מתנהלת (בתנאים שליטה), או להיות שונה ביציבות אל גם את genotroph גדול או קטן על ידי צמיחה בתנאים תזונתי גבוה או נמוך בהתאמה. הקווים וכתוצאה מגידול ראשוני תחת כל התנאים האלה מופיעים לגדול יותר כאשר גדל בתנאים זהים בדורות הבאים, בעיקר את הקו Pl גדל הטובה ביותר תחת טיפול הבקרה המצביע על כך הצמחים הגדלים תחת שני החומרים המזינים גבוה ונמוך נמצאים תחת הלחץ. אחד השינויים גנומית המשויכים אינדוקציה של תורשתי שינויים היא הופעתו של אלמנט הכניסה (LIS-1) 3, 4 בעוד הצמחים גדלים תחת הלחץ מזין. בהתייחס לאירוע זה הכניסה, סטורמונט מגוון פשתן Cirrus (PL), כאשר גדל פי שלושה תנאים מזין אחר יכול להישאר ללא שינוי (בתנאים שליטה), יש הכניסה מופיעים כל הצמחים (תחת מזינים נמוך) ויש להם זה מועבר לדור הבא, או לקבל את הכניסה (או חלקים ממנו) מופיעים אבל לא להיות מועבר מדור לדור (תחת מזינים גבוהה) 4. תדירות הופעתם של הכניסה זה עולה, כי היא תחת סלקציה חיובית, שגם היא עולה בקנה אחד עם התגובה גידול הדורות הבאים. עלים או meristems שנקטפו בשלבים שונים של צמיחה המשמשים לבידוד דנ&quot;א רנ&quot;א. RNA משמש לזיהוי וריאציה בביטוי הקשורים סביבות גידול שונים ו / או לא הוא נוכחות / היעדרות של LIS-1. ה-DNA בודד משמש כדי לזהות אותם צמחים אשר הכניסה התרחש.

Watch this Scientific Journal Video about Environmentally Induced Heritable Changes in Flax at JoVE.com

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

גידול כמה סוגים פשתן תחת תוצאות מתח מזין וריאציה גנומית בתוך משנה של הגנום ושונות פנוטיפי. הכניסה מורכבים באתר מסוים מזוהה עם צמיחה תחת משטרי תזונה שונים עם שינויים בביטוי הגנים סביב באתר זה.

מושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

environmentally-induced-heritable-changes-in-flax

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  Case Western Reserve University. גידול כמה סוגים פשתן תחת תוצאות מתח מזין וריאציה גנומית בתוך משנה של הגנום ושונות פנוטיפי. הכניסה מורכבים באתר מסוים מזוהה עם צמיחה תחת משטרי תזונה שונים עם שינויים בביטוי הגנים סביב באתר זה.

Video: Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

שינויים במורפולוגיה בלוטת החלב ואת הסיכון לסרטן השד אצל חולדות

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

שיווי משקל ניטור שינויים ב-RNA על ידי מבנה &#39;Peroxidative&#39; ו &#39;חמצוני &quot;footprinting רדיקלי הידרוקסיל

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

טרנספורמציה הפרחוני-Dip של פשתן (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) כדי ליצור progenies טרנסגניים עם שיעור שינוי גבוה

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

מעקב אחר שינויים בהשפעת סמים בסחר פוסט-הפנמת קולטן על ידי ניתוח Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

מושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video