Bu eser CIHR (MOP394808) ve CMCEWO bir Kanada Araştırma Başkanı bir hibe ile desteklenen NSERC bir Post-Yüksek Lisans Bursu layık görüldü.

Not: Bu protokol, çeşitli tek tabaka kaplama hücre / doku kültürü modelleri, ilaç tedavisi rejimleri ve etiketleme hedefleri ile geniş uyumludur. Böylece gerçek kullanımda, birçok özel parametreler deneysel tasarım göre değişir. Burada, bu kullanıcı tanımlı parametrelere başvurular genel bulunmaktadır. Örnek sonuçlar elde etmek için kullanıldığı haliyle örnek koşullar, italik olarak dahil edilmiştir. 1. Çözümler <ol><li> 0.1 M Tris-tamponlu hipertonik (300 mM), tuzlu su ve% 0.05 Polisorbat 20 karıştırarak yıkama tamponu hazırlayın; oda sıcaklığında, pH 7.4 ile yıkanır. </li><li> Bloklama tamponu hazırlayın. 0.05 M Tris-tamponlu hipertonik (300 mM) Salin% 0.05 polisorbat 20,% 3 bovin serum albumin (BSA) ve% 0.1 soğuk balık derisi jelatini ekleyin ve oda sıcaklığında pH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın. </li><li> 0.05 M Tris-tamponlu hipertonik (300 mM) Saline% 0.05 Polisorbat 20,% 1 BSA,% 0.1, soğuk balık derisi jelatini ekleyerek antikor seyreltici hazırlamak ve o 4 ° C&#39;de 7.4 pH ayarlamak Not: Tris tampon pH sıcaklığa bağlıdır. Bu sıcaklıkta bir değişiklik, solüsyonun pH değerinin, değişecektir. Tutarlılık için, bu tamponlar her zaman kullanılacak ısıda, pH ayarlı olmalıdır. </li></ol> 2. Hücre Kültürü Not: Uygun hücre kültürü protokolleri olarak kullanılan hücre tipi (lerine) dayalı olarak değişiklik gösterecektir. Bu prosedürler ayrı olarak optimize edilmelidir. Detaylı hücre kültürü yöntemleri 16 de dahil olmak üzere, kolaylıkla temin edilebilir. Benzer bir prosedür, önemli farklılıklar ile temsili sonuçlar elde etmek için kullanıldı: <ol><li> Yetişkin hayvanların Kültür arka kök gangliyon nöronları 12 tarif edildiği gibi. Kültür hücreleri yetişkin sinir büyüme ortamı kullanın. Yerine glutamat daha preplating ile glial hücre yoğunluğunu azaltın. Bu approximat büyüdü en az 30-60 plaka başına nöronların ve beraberindeki glial hücreler 12-yuvarlak cam lamelleri üzerinde yetiştirilen karışık nöron glial kültürü sonuçlarıely% 40 konflüansa. Bu glia aşırı büyümesi izin verilmesi halinde, birincil kültür nöronları çoğaltma olmayacak ve ko-kültive glia yardımıyla baskı plakasının itildiği olacağı unutulmamalıdır. Nöronlarını etkileyenler önlemek için, gliyal sayı fiziksel indirgeme kimyasal / farmakolojik yöntemler tercih edilir. Not: Bu protokolün amaçları için, ilgi hücreleri yetiştirilmektedir varsayalım onların deneysel-istenen devlet ve tek tabaka kaplama. Biz 24 yuvalı plakalar içinde 12 yuvarlak cam lameller üzerine kaplama en uygun olduğu fark. Tarif edilen tüm miktarlar ve prosedürleri, bir 24 yuvalı plakanın bir oyuk bir lamel için uygundur. </li></ol> Kültür Hücrelerinin 3. İlaç Tedavisi Not: Birden çok sıralı veya üst üste, ilaç tedavileri mümkündür. Belirli deney bağlıdır kullanılan maruziyet ilaçlar, dozları / konsantrasyonları ve süreleri. <ol><li> Orijinal büyüme ortamı çıkarın 16 </sup&gt; ve seçilen konsantrasyona (ler) de ilgi ilaç (lar) içeren ortamı ile değiştirin. Bu durumda, morfin, 10 uM tuzlu su içinde çözünür ya da kontrol olarak salin kullanmaz. Not: her bir bağımsız tekrarlanan (genellikle tek bir 24-çukurlu plaka kültür) aynı ortak kontrol koşulu içermesi önemlidir. Bu arası deneme değişkenlik düzeltir çoğaltır arasında veri normalleşmesini, izin verecektir. </li><li> 48 saat süre ile 16 orijinal büyüme koşulları hücreleri inkübe edin. </li><li> Daha sonra ilaç tedavileri için, tekrar 3.1 adımları ve Deltorphin 1 uM ile 3.2 SNC80 1 uM ya da araç ve 60 dakika 12 boyunca inkübe edin. Su içinde Deltorphin II çözünmezler ve su içinde 1 mM&#39;ye seyreltilmiş 40 uM HCI ve sonikasyon, 10 mM&#39;de SNC80 çözünür. Not: Bu protokol, seçtikleri büyüme ortamı içinde arzu edilen konsantrasyona (ler) eritilebilir olduğu ilaç (lar) gibi çözünebilir edilmiştir varsayar. Için uygun prosedürlerbu çözündürme, söz konusu ilacın bağlı olarak değişecektir ve ayrı olarak optimize edilmelidir. </li><li> Yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça üç defa hücreleri yıkayın. (Yıkama tamponu ile bu durumda) arzu edildiği gibi hafifçe taze çözelti ile iyi bir doldurma, kuyudan sıvının aspire, daha sonra derhal, yavaşça her yıkama yapın. </li></ol> 4. Tespit ve İmmünositokimya Not: Belirli etiketleme hedefleri deney ile değişecektir. Tartışıldığı gibi bizim kullanmak, biz, delta opioid reseptörleri (DOR) ve Rab5, Rab 11 ve LAMP1 etiketli. spesifik antikorlar, belirli bir deney bağlıdır kullanılır. Optimum etiketleme koşulları spesifik antikor kullanılır (ler) bağlıdır. Bu konunun bir çok dolgun bir tartışma altındadır. <ol><li> 37 ° C &#39;de 10 dakika boyunca ~ 0.1 M fosfat tamponlu salin içinde 300 ul% 4 paraformaldehid daldırma hücreleri saptamak. Not: Önemli olan bu% 4 paraformaldehit taze nedeniyle önceden dondurulmuş paraformaldehit kullanımından kaynaklanan otofloresansı için hazırlıklı olun. </li><li> 3.3&#39;de tarif edildiği gibi, yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça 3 kez hücreleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat süre ile blokaj tamponu ul 300 hücreleri inkübe edin. </li><li> 4 ° C &#39;de 48 saat süre ile, antikor seyreltici 300 ul primer antikorlar ile inkübe hücreleri. Bizim Kullanım sırasında, birincil DOR karşı antikorların (tavşan anti Dor) ve on: Rab5 (fare anti-Rab5), Rab 11 (fare anti-Rab11) ve LAMP1 (keçi anti-LAMP1). </li><li> 3.3&#39;de tarif edildiği gibi, yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça üç defa hücreleri yıkayın. </li><li> Farklı fluorophores konjüge edilmiş sekonder antikor ile inkübe hücreleri oda sıcaklığında 1 saat için antikor seyreltici 300 ul (aşağıdaki tartışmaya bakınız). Bu ve takip eden tüm adımlarda ışık hücreleri korur. Temsili sonuçlar elde etmek için, yeşil yayan fluorofor-konjuge anti-tavşan ve eith kullanmaker kırmızı yayan fluorofor konjuge edilmiş anti-fare ya da kırmızı yayan fluorofor-konjuge anti-keçi. </li><li> 3.3&#39;de tarif edildiği gibi, yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça 3 kez hücreleri yıkayın. </li><li> ~ Plakayı tutan, iyi her 45o yıkama tamponu ~ 1 ml bırakarak 24 kuyucuğu 12-yuvarlak lamelleri çıkarın ve ince forseps kullanılarak kuyu zemin kapalı lamel kolu. lamel kolayca forseps kullanılarak kaldırılabilir yerden, iyi duvara dinlenmek için gelecek. </li><li> Mikroskop üzerinde, lamelleri, hücre tarafı aşağı monte montaj orta, anti-solma slaytlar. </li></ol> 5. Mikroskop Ayarları <ol><li> Yüksek büyütmeli objektif (100X) kullanarak, ilk Epifloresans kullanarak görüntülü edilecek bir temsilci hücreyi bulun. </li><li> Örneğin kullanılan her floroforun algılama, 488 nm ve 59 için (her etiketli kanalın 8-bit sıkıştırılmamış TIFF görüntüleri kaydetmek için görüntü yakalama ayarlarını yapılandırın4 nm), (ya hat ya da çerçeve), ve son görüntü için ortalama 4 ila 6 taramalara görüntüye her kanal sıralı. Optimal görüntü çözünürlüğü mikroskop özgü olacak ama x 1024 1024 genellikle iyi sonuç verir. </li><li> Konfokal görüntüleme yoluna geçin ve hücrenin merkezinden geçen z-düzlemine odaklanmak. </li><li> Iğne deliği (tipik olarak 1 Airy birimi), lazer gücü ve photomultiplier tüp gerilimi (kazanç) Optimize ve her bir kanal için ofset. Bu ayarları kaydetmek / kaydedin. Aynı çoğaltmak herhangi belirli bir hedef çifti için etiketlenmiş tüm hücreleri görüntüleme için aynı mikroskop ayarları kullanın. Not: Bu işlem, genellikle, bu hücre analizi için görüntülenmiştir gerektiğini yeterli ışıkla ağartma neden olur. </li></ol> 6. Görüntüleme <ol><li> Yüksek bir büyütme objektif (ör 100X) kullanarak, birinci Epifloresans kullanarak görüntülü bir hücre bulun. </li><li> Konfokal görüntüleme yoluna geçin ve hücrenin merkezinden geçen z-düzlemine odaklanmak. Benf mevcuttur, kullanım yazılım yakınlaştırma / kırpma ilgi hücreye tarama alanını kısıtlamak için. </li><li> Ayarları kullanarak her işaretli kanal için Yakalama görüntüleri, daha önce kurulmuş. Tekrarlayın yeterli örnek sağlamak için görüntüye çoğaltmak başına koşulu başına 15 veya daha fazla hücre 6,1-6,3 adımları. </li></ol> 7. ko Analizi <ol><li> Görüntülerin çifti açın (örneğin, &#39;yeşil&#39; ve &#39;kırmızı&#39;), ImageJ bir hücrenin. &gt; Renk&gt; RGB görüntü oluşturmak için komut ... Kanallar Birleştirme Görüntü kullanın. </li><li> Ilgi hücrenin etrafında bir seçim çizin. Seçilen hücredeki hedeflerin ko ölçmek için (https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/ edinilebilir 11) &quot;PSC ko&quot; eklentisi ImageJ kullanın. </li><li> İstenilen ko önlem (genellikle Pearson r 17) kaydedin. Tekrarlayın, her görüntülü hücre için 7,1-7,3 adımları. </li></ol&gt; 8. Veri Normalleştirme <ol><li> Her ortak denetim koşullarının kayıtlı ko değerlerinin ortalamasını hesaplayın her etiketleme durumunun çoğaltırlar. Not: Örneğin, nöronların ko değerlerinin ortalama &quot;48 saatlik bir araç, 60 dakikalık bir araç&quot; 3 etiketleme koşullarında (reseptör ve 3 bölmelerin her biri) her 3 bağımsız Her bir replika ilaç durumu. </li><li> (-1) Her biri, her etiketleme durumda çoğaltmak için mahsup verim ile araçları çarpın. Her o çoğaltmak her ko değeri her etiketleme durumda çoğaltmak için ofset ekleyin. Not: Bu ortak kontrol durumu için ortalama ko ölçüsü her etiketleme durumunun her tekrarında 0 olacak şekilde veriyi normalleştirmek edecektir. </li><li> Her etiketleme durumunun her çoğaltır verileri Havuz. Not: ko değişiklikler artık çoğaltır genelinde analiz edilebilir. İstatistiksel analYsis deney tasarımı bağlı olacaktır ancak tipik bir analiz arasında varyans içerecektir (ANOVA) (örneğin, Tukey) uygun post-hoc testler takip etmektedir. İstatistiksel kaynakları için, 18, ​​örneğin bkz. </li></ol>

<ol>
	<li>Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+G+protein-coupled+receptors.">Trafficking of G protein-coupled receptors.</a> Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).</li><li>Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+GPCRs+by+endocytic+membrane+trafficking+and+its+potential+implications.">Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).</li><li>Hislop, J. N., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+endocytic+trafficking+of+G-protein-coupled+receptors.">Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors.</a> Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).</li><li>Nagi, K., Pi&#241;eyro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptor+signalling:+implications+for+the+development+of+analgesic+tolerance.">Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance.</a> Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).</li><li>Whistler, J. L., Enquist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+postendocytic+sorting+of+G+protein-coupled+receptors.">Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors.</a> Science. 297 (5581), 615-620 (2002).</li><li>Von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptors+by+endocytic+membrane+traffic:+mechanisms+and+translational+implications.">Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications.</a> Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).</li><li>Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromerization+of+the+&#181;-+and+&#948;-opioid+receptors+produces+ligand-biased+antagonism+and+alters+&#181;-receptor+trafficking.">Heteromerization of the &#181;- and &#948;-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters &#181;-receptor trafficking.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).</li><li>Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+distribution+of+delta-opioid+receptor+fused+with+various+tags+in+PC12+cells.">Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells.</a> Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).</li><li>Scherrer, G., Tryoen-T&#243;th, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockin+mice+expressing+fluorescent+delta-opioid+receptors+uncover+G+protein-coupled+receptor+dynamics+in+vivo.">Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).</li><li>He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+&#181;-opioid+receptor+activity+by+preventing+&#948;-opioid+receptor-mediated+codegradation.">Facilitation of &#181;-opioid receptor activity by preventing &#948;-opioid receptor-mediated codegradation.</a> Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).</li><li>French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+fluorescent+markers+in+confocal+microscope+images+of+plant+cells.">Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).</li><li>Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+morphine+treatment+alters+&#948;+opioid+receptor+post-internalization+trafficking.">Prolonged morphine treatment alters &#948; opioid receptor post-internalization trafficking.</a> Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+targeting+of+mu-delta+opioid+receptor+heterodimers+by+RTP4.">Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).</li><li>Gupta, A., Mulder, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+abundance+of+opioid+receptor+heteromers+after+chronic+morphine+administration.">Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration.</a> Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Field, A., Miles, J., Field, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovering Statistics Using R. , (2012).</li><li>Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-low+dose+naltrexone+attenuates+chronic+morphine-induced+gliosis+in+rats.">Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats.</a> Mol. Pain. 6, 22 (2010).</li><li>Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+among+various+proteins+as+blocking+agents+for+ELISA+microtiter+plates.">Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates.</a> J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook. , (2010).</li><li>Morris, T. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+immunocytochemical+staining+with+multiple+rabbit+polyclonal+antibodies.">A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies.</a> J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners&#8217;+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners&#8217; guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Erişkin dorsal kök ganglion nöronlarının (birincil duyu nöronları) birincil kültürleri analizi için bu protokolü optimize ettik. Aynı zamanda, genel olarak tek tabaka kaplama kültürlenmiş hücreler için, az ya da hiç bir değişiklik, kullanılabilir. colocalizational analiz ancak ilaç tedavisi ve doku tespit / hazırlık bileşenleri uygun olmaz, aynı zamanda doku dilimleri ve benzeri hazırlıkları 11 mümkündür. Ilgi çekici olan, burada sunulan ICC yönte...

Reseptörler, özellikle de G protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler), rutin ve hücre yüzeyi 1, hücre içi kaçırılan. Bunlar karmaşık bir orkestra ve sıkı kontrol süreçleri hücrelerin mevcut reseptör tamamlar dikte ve reseptör zamansal aktivite, duyarsızlaştırma ve resensitization 2 düzenleyen - 4. Önemli olarak, bu işlemler, ilaca bağlı reseptör aktivitesi veya işlem de dahil olmak üzere, hücresel ortama duyarlı. Diğer bir deyişle, reseptörlerindeki ligandlannın etkimeleri ve böylece hücre yanıt değiştirmeden, bu reseptörlerin hücre içi değiştirebilir. Bu şekilde, bu dış ligandlar da klasik haberciye-to-efektör kaskadları 5,6 ötesinde, daha fazla etkiler, hücre fonksiyonu üzerinde yapılmamış gösterirler. Uyarılmış reseptör kaçakçılığı gibi değişiklikler incelenmesi zordur. Mevcut tüm teknikler sınırlamaları içerir. Biyotin koruma deneyleri moni için kullanılmıştırtor yüzeyi reseptörleri popülasyonları. Bu reseptörler, biyotinile edilmiş ve İmmüno bir timecourse zamanla biyotinile reseptörleri azalmayı ölçmek için gerçekleştirilir. Bu teknik, esas olarak reseptör 7 arasında bir başlangıç, etiketlenmiş, popülasyonda bozunmasını takip eder ve bu işlem zaman içerisinde inşa çok yararlıdır. Ne yazık ki, bu deney gibi içselleştirilmesi, geri dönüşüm, ya da yeni reseptörler olarak reseptörlerin, orijinal havuzun bozulması dışında herhangi bir işlem izlemek için değiştiremiyor. Ayrıca, 50kDa aralığında bir reseptöre 150kDa aralığında bir antikorunun ilavesi reseptörün kaçakçılığı 8,9 değiştirebilir ve bu teknik, düşük ekspresyon düzeyi reseptörleri ile kullanmak için zor olabilir. Diğer işlemler hücre içi ticareti bölmeleri (örneğin, endozomlar, vs.) belirlemek ve ilgi reseptörleri ile ko değerlendirmek için çeşitli yöntemler kullanırlar. Bu bizi içeririfade heterolog sistemlerde e reseptörleri ve bölme belirteçleri (örneğin, Rab-aile GTPases) kimerik yapıları floresan proteini etiketli. Bu potansiyel fiksasyon ve permeabilization ile ilgili konuları kaldırarak, canlı hücre görüntüleme kullanımını sağlar. Daha fizyolojik temsilci hücre tipleri ile davranış ve uyumsuzluk ticareti üzerindeki etiketi ve ifade seviyesi etkileri: Güçlü iken, böyle bir strateji heterolog genel sistemlerin aynı sınırlamalara muzdarip. Daha halk, boyalar kolaylıkla hücre içi bölmeleri etiketlemek için kullanılır (örneğin, lizozomlar, görünürde) 10. Boyalar, ancak özgüllüğü (lizozomlar için boyalar durumunda bütün asidik organeller) eksikliği ve diğer bölmeleri sayesinde ticaretini değerlendirmek yok. Yine de, bu teknikler, sistem ve deneysel koşullar üzerinde önemli bir kontrole olanak aşağıdaki burada sunulan ko analiz yöntemleri yararlanabilir. Metot WBurada mevcut e ko reseptör ticareti izleme geliştirir. Uygun belirteçleri etiket immünsitokimya (ICC) kullanarak, birden fazla farklı hücre içi bölmeleri tespit etmek mümkündür. Bu, aynı zamanda, heterolog sistemlerde yerine fizyolojik olarak-ilgili primer hücre kültürlerinde kullanımına izin verir. Bu ICC protokol etiketleme öncesi ilgi hücreleri tespit kapsar; Bu ilaç tedavisi (ler) itibaren belirli bir timepoint etiketleme izin verir. Bu, o zaman noktasında küresel reseptör bölmesi dernekleri bir &#39;anlık&#39; üretiyor. Birden timepoints ile kaçakçılık değişikliklerin bir timecourse da inşa edilebilir. Kısaca, hücreler, ilaç ile muamele edilmiş, reseptör ve ilgi duyulan hücre içi bölüm için etiketli, odaksal olarak görüntülü ve fotomikrografları matematiksel reseptör ve bölme 11 arasında ko ölçmek için analiz edilir. Bizim kullanımı, biz Ra ile bir reseptörün ko incelendiğindeb5, Rab11 ve membran protein 1 (LAMP1) Lizozomal ilişkili. Bu belirteçler, sırasıyla erken endozomlar, geri dönüşüm endozomlar ve lizozomları belirlemek. Bu ko önlemler içselleştirilmesi, geri dönüşüm ve yıkımı 12 kapsayıcı süreçler için vekiller olarak hareket ederler. Tüm teknikler ile olduğu gibi, bazı sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Nedeniyle her bireyin nöron analiz görüntüye ihtiyacı, bu tekniğin ilgili koşullar ve timepoints sayısına bağlı olarak oldukça emek-yoğun hale gelebilir. Tüm immün da fiksasyon ve permeabilization 13 neden hücresel ultrastrüktürün, protein lokalizasyonu ve epitop erişilebilirlik üzerindeki etkileri ile uğraşmak gerekir. Başlangıçta birincil duyu nöronlarının birincil kültürlerinde kullanılmak için optimize edilmiş olsa da, bu yöntem diğer tek tabaka kaplama kültürü modelleri genel olarak uyumludur. Bir matematiksel sayısal MEASUR kullanımıko e özellikle, çok daha metodolojik, genellikle bu tür görsel-kontrol çok kanallı bindirmeleri 14 olarak belirsiz, öznel ölçütlere yararlanmıştır reseptör kaçakçılığı değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan önceki tekniklere göre daha titiz olduğunu. Bu teknik, in vivo girişimler (önce primer kültür üretimi) ile geniş uyumluluk için özellikle yararlıdır, in vitro müdahaleler (kültür büyüme sırasında) ve çeşitli etiketleme 15 hedefler. Bu nedenle, çok sayıda farklı araştırma sorulara uyarlanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7041-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">720084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 circle Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">1254580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua/Poly-Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00380-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DOR antibody</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS316175</td>
			<td>Used at 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7904</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-853</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-LAMP1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC8098</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drug-induced changes in receptor post-internalization trafficking by colocalizational analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Bu tekniği kullanarak, bu uzun süreli / kronik ve akut ilaç tedavileri hem Aşağıdaki reseptör sonrası içselleştirme kaçakçılığı değişiklikleri ölçmek mümkündür. İlaç tedavileri, fiksasyon ve etiketleme sonrasında, yüksek çözünürlüklü iki kanallı fotomikrografları ilgi her hücrenin yakalanır. Örnek görüntüler şekillere (Şekil 1) üretilmesi için, yanlış renk ko ile kombine edilebilir. Daha sonra colocalizational analizi, tarif edildiği gibi, hedef, hedef ko ...

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis at JoVE.com

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

Reseptör ticareti ligandlarına sinyal ve hücre yanıt modüle ve kendisi ligand bağlı sinyal dahil olmak üzere hücre koşulları, yanıt verici olmaktadır. Burada, biz kantitatif immün ve colocalizational analizi kullanılarak ilaca bağlı reseptör ticaretini değerlendirmek için güçlü ve esnek bir teknik açıklar.

Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

tracking-drug-induced-changes-receptor-post-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Görüntüleme.  University of California Irvine.  Reseptör ticareti ligandlarına sinyal ve hücre yanıt modüle ve kendisi ligand bağlı sinyal dahil olmak üzere hücre koşulları, yanıt verici olmaktadır. Burada, biz kantitatif immün ve colocalizational analizi kullanılarak ilaca bağlı reseptör ticaretini değerlendirmek için güçlü ve esnek bir teknik açıklar. 

Video: Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Küçük Hayvan Kas Aşı dinamiği ile Takip In Vivo Floresan Görüntüleme

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Biyoloji

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

Keten içinde değişiklikler Kalıtsal Çevre İndüklenmiş

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

RNA Yapısı &#39;peroksidatif&#39; ve &#39;Oksidatif&#39; Hidroksil Radikal footprinting İzleme Denge Değişiklikler

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Scap analizi<em&gt; K</em&gt; İnsan Hücreleri -glycosylation ve Ticareti

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

Gerçek zamanlı timositleri mikroskobu tarama lazer göz ön odasında Vivo içinde Takibi

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler