이 작품은 CIHR (MOP394808)과 CMCEWO에 캐나다 연구 의자에서 보조금에 의해 지원되었다 NSERC에서 대학원 장학금받는 사람이었다.

참고 :이 프로토콜은 다양한 단층 도금 세포 / 조직 문화 모델, 약물 치료 요법, 및 라벨 대상으로 광범위하게 호환됩니다. 따라서 실제 사용에서, 많은 특정 매개 변수는 실험 설계에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에, 이러한 사용자 정의 매개 변수에 대한 참조는 일반적인 있습니다. 대표적인 결과를 얻기 위해 사용되는 예 조건은, 이탤릭체에 포함되어 있습니다. 1. 솔루션 <ol><li> 0.1 M 트리스 버퍼 고장 성 (300 mM)을 식염수와 0.05 % 폴리 솔 베이트 20을 혼합하여 세척 버퍼를 준비; 실온에서 pH가 7.4. </li><li> 버퍼를 차단 준비합니다. 0.05 M 트리스 버퍼 고장 성까지 (300 mM)을 식염수는 0.05 % 폴리 소르 베이트 20, 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) 0.1 % 차가운 물고기 피부 젤라틴을 추가하고 실온에서 7.4로 pH를 조정합니다. </li><li> 0.05 M 트리스 - 완충 고장 성 (300 mM)을 식염수로 0.05 % 폴리 소르 베이트 20, 1 % BSA, 0.1 % 냉 물고기 껍질 젤라틴을 첨가하여 항체 희석액을 준비하고 4 O ℃에서 7.4로 pH를 조정 참고 : 트리스 버퍼의 pH는 온도에 따라 달라집니다. 즉, 온도 변화는 용액의 pH를 변경되고있다. 일관성을 위해,이 버퍼는 항상이 사용될 때의 온도에서, pH가 조정되어야한다. </li></ol> 2. 세포 배양 주 : 적절한 세포 배양 프로토콜이 사용될 세포 유형 (들)에 따라 달라질 것이다. 이러한 절차는 별도로 최적화되어야한다. 자세한 세포 배양 방법은 (16)을 포함하여, 쉽게 사용할 수 있습니다. 유사한 절차는 현저한 차이 대표적인 결과를 수득 하였다 : <ol><li> 성인 동물 문화 등의 루트 신경 뉴런은 12 설명 된대로. 문화에 세포를 성인 신경 세포 성장 매체를 사용합니다. 오히려 글루타민산보다, 예비 도금하여 아교 세포 밀도를 줄일 수 있습니다. 이 approximat에 성장 적어도 30 ~ 60 판마다 신경과 동반 아교 세포와 12 라운드 커버 글라스에 성장 혼합 신경 세포 아교 문화 결과엘리 40 % 포화 상태. 또한 신경교 과도 성장시키고있는 경우 일차 배양 신경 세포에서 복제되지 않으며, 신경교 공 배양하여 플레이트 밀려된다는 것을 주목해야한다. 신경에 영향을 미치는 것을 방지하기 위해, 신경교 번호 물리적 환원 화학 / 약학 적 방법에 바람직하다. 주 :이 프로토콜의 목적을 위해, 우리가 관심있는 세포가 성장하고있는 것으로 가정들이 실험적 원하는 상태 및 단층 도금. 우리는 24 웰 플레이트에서 12 라운드 커버 글라스에 도금하는 것이 가장 편리 할 것을 찾을 수 있습니다. 설명 모든 볼륨 및 절차는 24 웰 플레이트 잘 하나에 하나의 coverslip에 적합합니다. </li></ol> 배양 된 세포 3. 약물 치료 참고 : 여러 순차적 또는 중복은, 약물 치료가 가능하다. 특정 실험에 따라 달라집니다 사용하는 노출의 약물, 용량 / 농도 및 지속 시간. <ol><li> 원래의 성장 배지를 제거 16 </SUP&gt;를 선택한 농도 (들)에 관심있는 약물 (들)을 포함하는 배지로 교체합니다. 이 경우, 모르핀의 10 μm의이 식염수에 용해 또는 대조군으로 생리 식염수를 사용하여 사용합니다. 참고 : 각각의 독립적 인 복제 (일반적으로 하나의 24 웰 플레이트 문화) 같은 공통 제어 조건을 포함하는 것이 중요합니다. 이 간 재판 변동을 보정 복제에서 데이터의 정상화를 허용합니다. </li><li> 48 시간 16 원래의 성장 조건에서 세포를 품어. </li><li> 이후 약물 치료의 경우, 반복 3.1 단계 및 Deltorphin 1 μm의 3.2, SNC80 1 ㎛, 또는 차량을 60 분 12 품어. 물에 deltorphin II를 용해하고 물에 1 mm로 희석하여 40 μm의 HCl 및 초음파 처리, 10mm의에서 SNC80를 용해. 주 :이 프로토콜들이 선택 성장 배지에서 원하는 농도 (들)에 용해 될 수 있다는 약물 (들)을 가용화 한 가정한다. 에 대한 적절한 절차이러한 가용화 문제의 약물에 따라 달라집니다 개별적으로 최적화해야합니다. </li><li> 세척 당 세척 버퍼의 1 ~ ㎖로, 부드럽게 세 번 세포를 씻으십시오. (세척 버퍼이 경우) 원하는대로 부드럽게, 신선한 용액을 잘 보충, 우물에서 액체를 흡입 한 후 신속하게, 부드럽게 각 세척을 수행합니다. </li></ol> 4. 고정 및 면역 세포 화학 참고 : 특정 표시 대상이 실험에 의해 달라질 수 있습니다. 논의 된 바와 같이 우리의 사용에서, 우리는, 델타 오피오이드 수용체 (DOR) 및 Rab5, 랩 (11), 및 램프 1 레이블. 특정 항체는 특정 실험에 따라 달라집니다 사용. 최적의 라벨 조건은 특정 항체를 사용 (들)에 따라 달라집니다. 이 주제의 많은 풀러 논의는 다음과 같습니다. <ol><li> 37 ºC에서 10 분 동안 ~ 0.1 M 인산염 완충 생리 식염수 300 μL 4 % 파라 포름 알데히드를 침지하여 세포를 고정합니다. 참고 :이 중요하다 4 % 파라포름 알데히드 갓 인해 이전에 냉동 파라 포름 알데히드를 사용함으로써 발생되는 형광도에 제조 될 수있다. </li><li> 3.3에 기술 된 바와 같이, 세척 당 세척 완충액 중 ~ 1 ㎖로, 부드럽게 3 번 세포를 씻어. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 버퍼를 차단 μL (300)에있는 세포를 품어. </li><li> 4 ºC에서 48 시간 동안 항체 희석액 300 μL에서 일차 항체와 세포를 품어. 우리의 사용에서, 차 DOR에 대한 항체 (토끼 반 DOR)과 중 하나 Rab5 (마우스 항 - Rab5), 랩 11 (마우스 항 - Rab11), 및 램프 1 (염소 항 - 램프 1). </li><li> 3.3에 기술 된 바와 같이, 세척 당 세척 완충액 중 ~ 1 ㎖로, 가볍게 세 번 세포를 씻어. </li><li> 상이한 형광 물질에 접합 된 이차 항체와 세포를 부화 RT에서 1 시간 동안 항체 희석액 300 μL의 (아래 설명 참조). 이, 이후의 모든 단계에서 빛으로부터 세포를 보호합니다. 대표적인 결과를 얻으려면, 녹색 발광 형광 접합 된 항 - 토끼와 eith을 사용어 적색 발광 형광 접합 된 항 - 마우스 또는 적색 발광 형광 접합 된 항 염소. </li><li> 3.3에 기술 된 바와 같이, 세척 당 세척 완충액 중 ~ 1 ㎖로, 부드럽게 3 번 세포를 씻어. </li><li> ~에 접시를 들고, 잘 각각 45 °를 세척 버퍼 ~ 1ml를 떠나 24 웰 플레이트에서 12 라운드 된 커버를 제거하고 미세 집게를 사용 고타 떨어져 커버 슬립을 올립니다. 커버 슬립은 용이하게 집게를 사용하여 제거 할 수있는 곳에서, 웰 벽에 닿 올 것이다. </li><li> 현미경, 커버 슬립, 세포 측 다운 마운트 장착 매체를 방지 페이딩 슬라이드. </li></ol> 5. 현미경 설정 <ol><li> 고배율 대물 렌즈 (100X)를 사용하여, 표면 형광 제를 사용하여 묘화 될 수있는 대표적인 셀을 찾은. </li><li> 예를 들어, 사용되는 각 형광 물질의 검출, 488 nm 내지 59 (각 분류 채널의 8 비트 압축 TIFF 화상을 기록하는 촬상 설정 구성4 ㎚), (중 라인 또는 프레임에 의해), 최종 이미지에 대한 평균 4 ~ 6 스캔 이미지에 각 채널을 순차적으로. 최적의 이미지 해상도는 현미경 별 수 있지만 X 1024 (1024)는 일반적으로 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. </li><li> 공 초점 이미징 경로로 전환 세포의 중심을 Z-면에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 핀홀 (전형적 에어리 1 부), 레이저 전력, 광전자 증 배관 전압 (게인)를 최적화하고, 각 채널에 대한 오프셋. 이러한 설정을 기록 / 저장합니다. 같은 복제에 특정 대상 쌍에 대해 표시된 모든 세포 이미징에 대해 같은 현미경 설정을 사용합니다. 참고 :이 프로세스는 일반적으로이 세포 분석을 위해 몇 군데되지 않도록 충분한 광표백 발생합니다. </li></ol> 6. 이미징 <ol><li> 고배율 대물 렌즈 (예를 들어, 100X)를 사용하여, 표면 형광 제를 사용하여 묘화 될 수있는 세포를 찾아. </li><li> 공 초점 이미징 경로로 전환 세포의 중심을 Z-면에 초점을 맞 춥니 다. 나는F 가능한 소프트웨어를 사용 크게 / 작물의 관심 셀로의 스캔 영역을 제한한다. </li><li> 설정을 사용하여 레이블이있는 각 채널에 대한 이미지를 캡처 이전에 설립했다. 반복 충분한 샘플을 보장하기 위해 이미지에 복제 당 조건 당 15 이상의 셀을 6.3에 6.1 단계를 반복합니다. </li></ol> 7. colocalization을 분석 <ol><li> 이미지의 쌍을 엽니 다 (예를 들어, &#39;녹색&#39;과 &#39;빨간색&#39;) ImageJ에있는 셀의. &gt; 컬러&gt; RGB 이미지를 생성하는 명령 ... 채널 병합 이미지를 사용합니다. </li><li> 관심의 세포 주위에 선택을 그립니다. 선택한 셀에 대상의 colocalization을 정량화 (https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/에서 사용할 수 11) &quot;PSC colocalization을을&quot;플러그인 ImageJ에 사용합니다. </li><li> 원하는 colocalization을 측정 (일반적으로 피어슨의 R 17)를 기록한다. 반복 각 군데 셀에 대한 7.1-7.3 단계를 반복합니다. </li></ol&gt; 8. 데이터 정규화 <ol><li> 각각의 공통 제어 조건의 기록 colocalization을 값들의 평균을 계산한다 각 표시 상태의 복제. 참고 : 예를 들어, 뉴런의 colocalization을 값의 평균 &quot;48 시간 차량 60 분 차량&quot;3 라벨 조건 (수용체와 3 구획의 각) 각 3 독립적 인 복제 각각의 약물 상태. </li><li> (-1) 각 각 라벨 상태에서 복제에 대 한 오프셋 산출하는 기준 수단을 곱하십시오. 각각 그 복제의 각 colocalization을 값으로 각각의 라벨 상태에서 복제에 대 한 오프셋 (offset) 추가. 주의 : 이것은 공통 제어 조건에 대한 평균 측정 colocalization을 각 표시 상태의 각 복제에 0이되도록 데이터를 정규화한다. </li><li> 각 표시 상태의 모든 복제에서 데이터를 풀. 참고 : colocalization을의 변화는 지금 복제를 통해 분석 할 수 있습니다. 통계 항문이 Analysis 실험 설계에 따라 달라집니다하지만 일반적으로 분석 수준의 분산을 포함 할 것이다 (ANOVA)은 (예를 들어, Tukey에) 적절한 사후 테스트 하였다. 통계 자료를 들어, 18, ​​예를 참조하십시오. </li></ol>

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	<li>Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+G+protein-coupled+receptors.">Trafficking of G protein-coupled receptors.</a> Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).</li><li>Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+GPCRs+by+endocytic+membrane+trafficking+and+its+potential+implications.">Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).</li><li>Hislop, J. N., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+endocytic+trafficking+of+G-protein-coupled+receptors.">Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors.</a> Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).</li><li>Nagi, K., Pi&#241;eyro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptor+signalling:+implications+for+the+development+of+analgesic+tolerance.">Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance.</a> Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).</li><li>Whistler, J. L., Enquist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+postendocytic+sorting+of+G+protein-coupled+receptors.">Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors.</a> Science. 297 (5581), 615-620 (2002).</li><li>Von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptors+by+endocytic+membrane+traffic:+mechanisms+and+translational+implications.">Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications.</a> Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).</li><li>Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromerization+of+the+&#181;-+and+&#948;-opioid+receptors+produces+ligand-biased+antagonism+and+alters+&#181;-receptor+trafficking.">Heteromerization of the &#181;- and &#948;-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters &#181;-receptor trafficking.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).</li><li>Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+distribution+of+delta-opioid+receptor+fused+with+various+tags+in+PC12+cells.">Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells.</a> Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).</li><li>Scherrer, G., Tryoen-T&#243;th, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockin+mice+expressing+fluorescent+delta-opioid+receptors+uncover+G+protein-coupled+receptor+dynamics+in+vivo.">Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).</li><li>He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+&#181;-opioid+receptor+activity+by+preventing+&#948;-opioid+receptor-mediated+codegradation.">Facilitation of &#181;-opioid receptor activity by preventing &#948;-opioid receptor-mediated codegradation.</a> Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).</li><li>French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+fluorescent+markers+in+confocal+microscope+images+of+plant+cells.">Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).</li><li>Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+morphine+treatment+alters+&#948;+opioid+receptor+post-internalization+trafficking.">Prolonged morphine treatment alters &#948; opioid receptor post-internalization trafficking.</a> Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+targeting+of+mu-delta+opioid+receptor+heterodimers+by+RTP4.">Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).</li><li>Gupta, A., Mulder, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+abundance+of+opioid+receptor+heteromers+after+chronic+morphine+administration.">Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration.</a> Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Field, A., Miles, J., Field, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovering Statistics Using R. , (2012).</li><li>Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-low+dose+naltrexone+attenuates+chronic+morphine-induced+gliosis+in+rats.">Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats.</a> Mol. Pain. 6, 22 (2010).</li><li>Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+among+various+proteins+as+blocking+agents+for+ELISA+microtiter+plates.">Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates.</a> J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook. , (2010).</li><li>Morris, T. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+immunocytochemical+staining+with+multiple+rabbit+polyclonal+antibodies.">A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies.</a> J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners&#8217;+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners&#8217; guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 성인 후근 신경절 신경 세포 (차 감각 뉴런)의 차 문화의 분석을 위해이 프로토콜을 최적화했다. 또한 광범위 단층 도금 배양 된 세포에 대해 거의 또는 수정없이 사용할 수있다. colocalizational 분석 그러나 약물 치료 및 조직 고정 / 혼합물의 구성 요소가 적절하지 않을 것입니다, 또한 조직의 조각 및 기타 준비 (11)에서 가능하다. 흥미로운 것은, 여기에 제시된 ...

수용체 특히, G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)는, 정기적으로 및 세포 표면 (1)로부터, 세포 내에서 팔려. 이 복잡하게 조율하고 엄격하게 제어 과정은 세포의 가능한 수용체 보완을 지시하고 수용체 시간 활동, 탈감작 및 resensitization 2 조절 - 4. 중요한 것은, 이들 방법은 약물 유발 수용체 활성 또는 비활성을 포함한 셀룰러 환경에 응답한다. 즉, 수용체에 리간드의 행동함으로써 세포 응답을 변경, 그 수용체의 세포 내 인신 매매를 변경할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 외부 리간드에도 고전 메신저 투 이펙터 캐스케이드 5,6- 넘어 더 효과 세포 기능에 아직 발휘. 유도 수용체 인신 매매에 이러한 변화를 검토하는 것은 어렵다. 사용 가능한 모든 기술은 한계를 포함한다. 비오틴 보호 분석법 모니하는데 사용되어왔다토르 표면 수용체 집단. 이들 수용체는 바이오틴 화되어 면역 침전의 timecourse은 시간이 지남에 따라 바이오틴 수용체의 감소를 정량화하기 위해 수행된다. 이러한 기술은 본질적으로 수용체 (7)의 초기 레이블, 인구의 점진적인 열화를 모니터링하고,이 공정의 시간 코스를 구성하는데 매우 유용하다. 불행하게도,이 분석은 내재화, 재활용, 또는 새로운 수용체 등의 수용체, 원래 풀 저하 이외의 프로세스를 모니터링 할 수 없다. 또한, 50kDa 범위 수용체 150kDa 범위의 항체의 첨가는 수용체의 매매 8,9 변경할 수 있으며,이 기술은 낮은 발현 수준의 수용체로 사용하기 어려울 수있다. 다른 절차는 세포 내 인신 매매 구획 (예를 들면, 엔도 좀 등)을 확인하고 관심있는 수용체와 그들의 colocalization을 평가하기 위해 다양한 방법을 사용합니다. 이것은 우리를 포함표현 이종 시스템의 전자 수용체 및 구획 마커 (예를 들면, 랩 - 가족 GTP 아제)의 키메라 구조를 형광 단백질은 태그가. 이로 인해 고정 및 투과성으로 관련된 문제를 제거하는, 살아있는 세포 이미징의 사용을 가능하게한다. 더 생리 학적으로 대표 세포 유형과 행동과 호환성을 인신 매매에 태그와 발현 정도 효과 : 강력한 있지만, 이러한 전략은 이종 일반적으로 시스템의 동일한 제한을 앓고. 더 널리, 염료가 쉽게 세포 내 구획 레이블을하는 데 사용됩니다 (예를 들어, 리소좀, 표면 상) 10. 염료는, 그러나, 특이성 (리소좀에 대한 염료의 경우 모든 산성 세포 소기관을)이 부족하고 다른 구획을 통해 인신 매매를 평가하지 않습니다. 또, 이들 기술은 시스템 및 실험 조건 위에 상당한 제어를 허용 이하, 여기에 제시된 colocalization을 분석 방법 이점있다. 방법 승여기에 현재 전자는 colocalization을하여 수용체 인신 매매의 추적을 정제. 적당한 표식 라벨을 면역 세포 화학 (ICC)를 사용하면, 여러 별개의 세포 내 구획을 식별 할 수있다. 이는 또한 이종 시스템 대신에 생리 학적으로 관련 일차 세포 배양의 사용을 허용한다. 이러한 ICC 프로토콜 라벨 이전 관심 세포를 정착시키는 것을 포함한다; 이 약물 치료 (들) 다음과 같은 특정 평가시기에 표시를 허용합니다. 이것은 그 평가시기에 글로벌 수용체 구획 협회의 &#39;스냅 샷&#39;을 생산하고 있습니다. 여러 시점들로, 인신 매매 변경 timecourse도 구성 할 수있다. 간단히, 세포가 약물 처리, 수용체와 관심의 세포 내 구획 표지이며, 공 초점 이미징 및 현미경은 수학적 수용체와 실 (11)의 colocalization을 정량화 분석된다. 우리의 사용에서, 우리는 류마티스 관절염 수용체의 colocalization을을 조사B5, Rab11 및 막 단백질 1 (램프 1)를 리소좀은 관련. 이 마커는 각각 초기 엔도 좀, 재활용 엔도 좀과 리소좀을 식별합니다. 이 colocalization을 조치 국제화, 재활용, 분해 (12)의 무엇보다 중요한 프로세스에 대한 프록시 역할을합니다. 모든 기술에서와 같이, 몇 가지 제한을 고려해야한다. 인해 모든 개별 뉴런 분석 이미지 필요성이 기법 시점들과 관련된 조건의 수에 따라 상당히 노동 집약적이 될 수있다. 모든 immunolabeling는 고정과 투과성으로 (13)에 의해 발생하는 세포의 미세 구조, 단백질의 현지화 및 에피토프 접근성에 미치는 영향에 맞설해야합니다. 원래 기본 감각 뉴런의 차 문화와 함께 사용하기에 최적화 있지만,이 방법은 다른 단층 도금 문화 모델과 광범위하게 호환됩니다. 수학적 정량 지표 성과의 사용colocalization을의 전자는 특히, 훨씬 더 많은 방법 론적으로, 종종 시각적으로 검사 멀티 채널 오버레이 (14)와 같은 모호한, 주관적 조치에 의존 수용체 인신 매매의 변화를 평가하는 데 사용 이전 기술보다 엄격한입니다. 이 기술은 생체 개입 (이전에 차 문화 세대)과의 폭 넓은 호환성을 위해 특히 유용, 체외 개입 (문화 성장 중), 각종 라벨 (15)을 목표로하고있다. 이와 같이, 많은 다른 연구 질문하도록 구성 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7041-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">720084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 circle Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">1254580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua/Poly-Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00380-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DOR antibody</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS316175</td>
			<td>Used at 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7904</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-853</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-LAMP1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC8098</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drug-induced changes in receptor post-internalization trafficking by colocalizational analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

이 기술을 사용하면, 장기간 / 만성 및 급성 약물 치료 모두 다음 수용체 내재화 후 거래의 변화를 정량화하는 것이 가능하다. 약물 치료, 정착, 및 표지 한 후, 고해상도 2 채널 현미경은 관심의 각 셀의 포획된다. 대표적인 이미지는 예시적인 도면 (도 1)를 생성하기 위해 거짓 색 colocalization을 함께 결합 될 수있다. 후속 colocalizational 분석 한 바와 같이, 목표 대상 colocalization을 (예를...

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Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

수용체는 리간드 매매 시그널링 및 세포 반응성을 조절하고, 그 자체의 리간드 - 유도 된 세포 신호 전달을 포함한 조건에 응답한다. 여기, 우리는 양적 immunolabeling 및 colocalizational 분석을 사용하여 약물 유발 수용체 인신 매매를 평가하기위한 강력하고 유연한 기술을 설명합니다.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

tracking-drug-induced-changes-receptor-post-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K 조회수.  University of California Irvine.  수용체는 리간드 매매 시그널링 및 세포 반응성을 조절하고, 그 자체의 리간드 - 유도 된 세포 신호 전달을 포함한 조건에 응답한다. 여기, 우리는 양적 immunolabeling 및 colocalizational 분석을 사용하여 약물 유발 수용체 인신 매매를 평가하기위한 강력하고 유연한 기술을 설명합니다. 

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Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

작은 동물의 근육 Engraftment의 역학에 의해 추적 VIVO에서 형광 이미징

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

연구

생물학

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

플렉스의 변경을 물려 전할 수있는 환경을 유도

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

&#39;Peroxidative&#39;와 &#39;산화&#39;히드록실 급진적 Footprinting에 의해 RNA 구조의 모니터링 평형 변경

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

SCAP의 분석<em&gt; N</em&gt; 인간 세포의 -glycosylation 및 매매

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 눈의 앞쪽 챔버에 Thymocytes의 비보에 추적 실시간

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...