המחברים מבקשים להודות לגלן סלוקום (ספר לרפואה של ויסקונסין) וקולין א לאבין (ניקון מכשירים, Inc) לקבלת סיוע טכני מעולה עם ניסויים במיקרוסקופ. גרגורי בלס הוא הודה להגהה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות וHL108880 מענק איגוד סוכרת האמריקנית להעניק 1-15-BS-172 (לAS), ובן ג &#39;יפס מחקר המלגה מהאגודה לנפרולוגיה האמריקנית (ל- DVI).

שימוש בבעלי חיים ולרווחתם צריך לדבוק במדריך NIH לטיפול ושימוש בחי המעבדה הבא פרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC). פלאש 1. הכליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עכברוש 8 עד 12 בשבוע ישן זכר (הציע הוא זן ספראג Dawley, אולם זנים אחרים של גיל ומין שונים ניתן להשתמש עם שינויים מתאימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה על פי הנוהל מתיר פרוטוקול IACUC; לפקח עומק ההרדמה ולבדוק את בעלי החיים. התיאור מפורט של הניתוח שיבוצע ב1.3 - ניתן למצוא 1.8 בet al Ilatovskaya 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה נכונה, למקם את החיה על שולחן ניתוחים בטמפרטורה מבוקרת, לעשות (עד 3 אינץ &#39;באורך) חתך קו האמצע של הבטן, ולחשוף את הווריד הנבוב ואב העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מייתר סביב עורקי צליאק וmesenteric מעולה והבטןאב העורקים מעל אלה; לא לקשור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוטה לנתח אב העורקים בבטן מתחת לעורקי הכליה, ומניח את שני חיבורים אותיות סביבו, אבל לא לקשור, אז מהדק את אב העורקים מעל חיבורי האותיות ולקשור את החוט התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטטר אב העורקים עם צינורות פוליאתילן PE50 (המצורפים למשאבת מזרק מלאה PBS) מתחת למהדק ולתקן את הקטטר עם המייתר השני; להסיר את המהדק, להפעיל את המשאבה, ולקשור את אב העורקים ועורקי mesenteric עם צליאק. במהירות לעשות חתך בעורק כליה כדי להקל את הלחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות את אב העורקים עם PBS-מקורר מראש עבור 2 או 3 דקות בקצב של 6 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור זלוף, בלו וdecapsulate 7 הכליות, ולשים אותם על קרח בפתרון PBS. להרדים את החיה על פי פרוטוקול שאושר על ידי IACUC. </li></ol> 2. בידוד של glomeruli העכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 30 מיליליטר של תמיסה טריות של BSA 5% בRPMI 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח ומספריים,לבודד את הקליפה של שני הכליות, ולאחר מכן ברר עד הומוגנית. הליך זה כבר תואר קודם לכן 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את הרקמה טחונות בשלב הקודם דרך מסננת נירוסטה 100 רשת (ספוג מראש ב 5% BSA / פתרון RPMI) בעזרת מרית. לאסוף את הזרימה דרך בכוח הכבידה לאפשר הזרימה דרך לעבור דרך מסננת 140 רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הזרימה דרך נאסף מהרשת 140 מסננת באמצעות מסננת רשת מראש ספוג 200, לבטל את התסנין, ולשטוף את החלק העליון של המסננת עם 10 - 15 מיליליטר של פתרון BSA / RPMI מוכן לאסוף glomeruli שהמשקעת ב המסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את פתרון BSA / RPMI המכיל glomeruli על קרח בצינור 15 מ&quot;ל ולתת משקעי glomeruli בחלק התחתון של הצינור עד 20 דקות. תרכיז glomeruli בחלק התחתון של הצינור יהיה לראות בבירור. הסר את הפתרון העודף, עוזב כ 2 מיליליטר בצינור. </li></ol> 3. ערוץ יחיד תיקון מהדק אלectrophysiology <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שבבי זכוכית כיסוי 5 X 5 מ&quot;מ על ידי ציפוי אותם עם MW 70,000 - 150,000 פולי-ʟ ליזין, ולתת יבש. השתמש כ -30 μl של פתרון מסונן סטרילי 0.01% במים לכיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את הפתרונות הניסיוניים לRT ולמלא את תא תיקון- clamp ופיפטה. לניטור ערוצי TRPC, להשתמש בפתרון אמבטיה, במ&quot;מ: 126 NaCl, 1 CaCl 2, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 10 גלוקוז, pH 7.4; פיפטה: 126 NaCl, 1.5 CaCl 2, 10 HEPES, 10 גלוקוז; pH 7.4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מעכבים לפתרון פיפטה לחסום את הפעילות של ערוצי אנדוגני, שאינם רלוונטיים ללימודים (המומלצים הם: חומצת niflumic 100 מיקרומטר או DIDS (לחסום Ca 2 + Cl -activated - ערוצים), 10 מ&quot;מ TEA (לעכב גדולות-מוליכות 2 Ca + - K התלוי + ערוץ), 10 iberiotoxin ננומטר (לחסום את Ca 2 + K + ערוצי -activated), 10 מיקרומטר nicardipine (לחסום N-סוג Ca2 + ערוצים)) ישירות לפני ניסוי תיקון מהדק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות הפתרון המכיל glomeruli, ולאחר מכן להחיל כ -50 μl שלו לשבבי זכוכית הכיסוי מצופה פולי-ʟ ליזין. בואו glomeruli לצרף לכ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את שבבי זכוכית עם glomeruli לתא תיקון- clamp מראש מלא בפתרון האמבטיה; perfuse קאמרי בשיעור של 3 מיליליטר / דקה 1 דקות כדי להבטיח את הסרת glomeruli הפנוייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל ניסוי תיקון- clamp קונבנציונלי במצב 7-מצורף תא. עם טפטפת זכוכית (7-10 התנגדות פיפטה MΩ) ליצור חותם גבוהה התנגדות בין פיפטה וקרום podocyte ידי החלת שאיבה עדינה (פיפטה המצורפת לpodocyte על פני השטח של glomerulus המבודד מוצג באיור 2, ב משמאל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידות מצורפים תא, נמוך לעבור הזרמים ב 300 הרץ על ידי מסנן שמונה-מוט בסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Use מבודד glomeruli בניסויי תיקון מהדק עד 4 - 6 שעות. שמור את חלק glomeruli המניות על קרח. </li></ol> 4. מדידות ratiometric Confocal הקרינה של ריכוז סידן תוך תאים בPodocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 500 μl של חלק glomeruli (שתואר על 2.5) 0.5 מיליליטר בצינור חרוטי ולהוסיף צבעי סידן פורעה אדום, בבוקר וFluo-4, בבוקר. השתמש 2 מ&quot;מ ו 1 ריכוזי מניית מ&quot;מ של פורעה האדום, בבוקר וFluo-4, בבוקר, בהתאמה (חנות ב -20 ° C, מומס DMSO) ולהשתמש 2.5 μl של כל צבע לμl 500 של חלק glomeruli. מייד לאחר תוספת של הצבעים לכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום צינורות על שייקר מסתובב לפחות 20 דקות עד שעה 1 בRT. הערה: ניתן להוסיף סוכנים תרופתי במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן coverslips זכוכית, לכסות אותם עם פולי-ליזין ʟ ולאפשר ייבוש באמצעות סט צלחת מחומם ל -70 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהטעינה של צבעי סידן היא completדואר, יחול של glomeruli מכילה פתרון לcoverslips המצופה פולי-ליזין 100 ʟ μl ולתת להם להיצמד למשטח לכ -5 דקות. הר coverslips המצורף glomeruli לחדר הדמיה, ותנקב עם פתרון האמבטיה (המכיל (במ&quot;מ): 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, pH 7.35) בשיעור של 3 מיליליטר / דקה להסרת glomeruli הפנוייה והצבעים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקרוסקופ סריקת לייזר confocal לגל עירור 488 ננומטר ומסנני פליטה (525/25 וננומטר 650/25 לFluo-4 ופורע אדום, בהתאמה). הגדר את תוכנת הדמיה לתדר ורזולוציה רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא glomeruli בbrightfield ולאחר מכן הפעל את זיהוי של אותות הקרינה. התאם את עוצמת הלייזר לכל צבע כדי למנוע הרוויה של האות. בחר את מישור המוקד עם podocytes שישירות מחוברים לזכוכית. זה ממזער את ההשפעה נגרמת על ידי התכווצות של glomerulus בתגובה לתרופהיישום. פעמיים לבדוק שglomerulus של בחירה מצורף גם לזכוכית; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הדמיה מישור המוקד של בחירה (לקחת 512 x 512 תמונות עם התדירות שנקבעה ב 4 שניות לדמיין Ca 2 + שינויים מהירים חולפים. השתמש 60x / עדשה אובייקטיבית דומה NA 1.4 או לתמונה ברזולוציה גבוהה), תחול תרופות של עניין, ולהקליט את התגובה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מטוס מוקד רצוי (קרוב למשטח של הזכוכית ככל האפשר, כדי להבטיח הדמיה של podocytes על פני השטח של glomerulus). בדוק את עוצמת הקרינה על Fluo4 וערוצי FuraRed, ולוודא כי glomerulus נראה בbrightfield ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הדמיה. לפני היישום של כל תרופות, שיא לפחות 1 דקות של הקרינה בסיס לוודא כי האות היא יציבה (אין קוצים פתאומיים או דהייה של האות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תרופות הרצויות בעזרת micropipette; להיות זהיר ולוודא את התרופה הצליחה לפזר היטב ולהגיע לglomerUlus. מערבבים את פתרון האמבטיה בעדינות אם יש צורך, לפקח על מישור המוקד הנבחר ולבדוק שזה לא זז מחוץ לפוקוס בגלל יישום הסמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את השינויים בעוצמת הקרינה לאותות Fluo4 וFuraRed. ודא ההקלטה היא מספיק זמן, על ידי מחכה עד האות מגיעה לרמת הרמה או מגיעה לשיא ואז חוזרת לנקודת התחלה. לבצע שינוי פתרון או תוספת של כל תרופות אחרות במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את ההקלטה, ולשמור את הקובץ בתבנית המקורית של התוכנה. </li></ol></li></ol> ניתוח תמונה 5. למדידות סידן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח תמונה עם התוכנה הפתוחה ImageJ מצויד בתוסף שירות ND המאפשר יבוא תמונות בפורמט ND2 הילידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את התמונה ברצף; לוודא לפצל את הערוצים ולהשתמש בגווני אפור מצב hyperstack. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב → כלים → נתיב מנהל ROI לנתח בתוכנת ImageJ לoעט חלון מנהל החזר על השקעה. בחר כמה אזורים של העניין (podocytes) באמצעות כלי בחירה סגלגלים ו&quot; הוסף (t) &quot;הפונקציה במנהל ההחזר על ההשקעה. כהחזר על ההשקעה האחרונה, בחר את האזור ברקע; להציל את ROIs נבחר (עוד → שמור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את החלון המכיל את הערוץ שנבחר לניתוח. השתמש עוד → פונקצית מדידה רב במנהל את ההחזר על ההשקעה, סמן את התיבה &quot;שורה אחת לכל פרוסה&quot; בדיאלוג שקופץ החוצה, ולאחר מכן לחץ על אישור. התוצאות יוצגו בפורמט שניתן להגדיר בחלון התוצאות: להיכנס לתוצאות אפשרות תפריט → מדידות, בחר &quot;Mean ערך אפור&quot; ולחשב את ערכי עוצמה עבור כל פיקסל את ההחזר על ההשקעה, אשר יוצג ב חלון תוצאות בעמודות נפרדות לכל החזר על השקעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את ערכי עצמת ROI נמדדו עבור כל ערוץ (Fluo-4 ופורע אדום) לתוך תוכנת ניתוח נתונים העדיפה; ערכי עוצמת רקע לגרוע מכל DATנקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל נקודת זמן לחשב את היחס של עוצמות של Fluo-4 לערוצי פורעה אדומים. פיזור עלילה / קו שינויים של חולף Ca 2 + לכל החזר על השקעה נקודה-זמן. חישוב ממוצע ערכים / SE לglomeruli נבחרה. הערה: טור זמן צריך להיות מוגדר על פי תדירות הדמיה נבחרה על 4.5. </li></ol> 6. חישובי ריכוז סידן תוך תאים באמצעות Fluo-4 פלואורסצנטי איתותים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דוגמא של glomeruli ולבצע את פרוטוקול הניסוי עד שלב 4.7. לאחר ההקלטה של ​​הקרינה הרקע להוסיף ionomycin (ריכוז סופי בתא האמבטיה צריך להיות 10 מיקרומטר) לפתרון האמבטיה, ועליית עוצמת הקרינה שיא. ברגע שמגיעה למקסימום העצמה שלה והריקבון מתחיל, להוסיף MnCl 2 (ריכוז סופי צריך להיות 5 מ&quot;מ) כדי להרוות את הקרינה 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים שהתקבלו ב6.1. העתק את Fluo-4 ערכי עוצמת אות ROI מתקבלים לפילפרוטוקול המתואר ב5.1-5.5 על ידי תוכנת ניתוח מועדפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ריכוז סידן תוך תאי (בננומטר) בpodocyte המתאים להחזר על ההשקעה באמצעות נוסחא: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> שם ד K הוא ניתוק שנקבע מראש קבוע לFluo-4 (345 ננומטר), F הוא העצמה בנקודה הזמן שאתה חישוב ריכוז סידן ל( בסיס), ודקות F ו- F מקסימום הם ערכי העצמה ב נקודת העומס מרבי סידן (לאחר יישום ionomycin) ואחרי מרווה של הקרינה (עם MnCl 2), בהתאמה (ראה איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+nephrotic+syndrome:+connecting+molecular+genetics+to+podocyte+physiology.">Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).</li><li>Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+glomerular+barrier+and+mechanisms+of+proteinuria.">Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria.</a> Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).</li><li>Patrakka, J., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+role+of+podocytes+in+proteinuria.">New insights into the role of podocytes in proteinuria.</a> Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).</li><li>Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+albumin+reflection+coefficient+with+isolated+rat+glomeruli.">Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).</li><li>Gloy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+depolarizes+podocytes+in+the+intact+glomerulus+of+the+Rat.">Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat.</a> J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).</li><li>Nitschke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+the+intracellular+calcium+activity+in+podocytes+of+the+intact+glomerulus.">Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus.</a> Kidney Int. 57, 41-49 (2000).</li><li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+analysis+of+TRPC+channels+in+the+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli.">Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li><li>Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+heavy+metal+ions+perturb+fura-2+measurements+of+basal+and+hormone-evoked+Ca2++signals.">Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals.</a> Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).</li><li>Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mineralocorticoid+and+angiotensin+II+receptor+blockers+on+proteinuria+and+glomerular+podocyte+protein+expression+in+a+model+of+minimal+change+nephrotic+syndrome.">Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome.</a> Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).</li><li>Abramowitz, J., Birnbaumer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+canonical+transient+receptor+potential+channels).">Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels).</a> FASEB J. 23, 297-328 (2009).</li><li>Heeringa, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+TRPC6+mutation+that+causes+childhood+FSGS.">A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS.</a> PLoS ONE. 4, e7771 (2009).</li><li>Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+role+of+TRPC6+in+vitamin+D+ameliorating+podocyte+injury+in+STZ-induced+diabetic+rats.">The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats.</a> Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).</li><li>Bohrer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+puromycin-induced+defects+in+the+transglomerular+passage+of+water+and+macromolecules.">Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules.</a> J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).</li><li>Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+charge+and+size+selectivity+barrier+of+the+glomerular+filter+in+aminonucleoside+nephrosis+in+rats.">Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats.</a> Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).</li><li>Schiessl, I. M., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+AT2+receptor+activation+attenuates+AT1+receptor-induced+increases+in+the+glomerular+filtration+of+albumin:+a+multiphoton+microscopy+study.">Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSAIDs+acutely+inhibit+TRPC+channels+in+freshly+isolated+rat+glomeruli.">NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).</li><li>Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+wave+of+tubuloglomerular+feedback.">Calcium wave of tubuloglomerular feedback.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).</li><li>Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+directly+stimulates+ENaC+activity+in+the+cortical+collecting+duct+via+AT(1)+receptors.">Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).</li><li>Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+the+P2+receptors+profile+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated+rat+glomeruli.">Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+has+acute+effects+on+TRPC6+channels+in+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli.">Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).</li><li>Schaldecker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+TRPC5+ion+channel+protects+the+kidney+filter.">Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter.</a> J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).</li><li>Roshanravan, H., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+acting+through+P2Y+receptors+causes+activation+of+podocyte+TRPC6+channels:+role+of+podocin+and+reactive+oxygen+species.">ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).</li><li>Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+activation+of+TRPC6+channels+in+rat+podocytes+requires+generation+of+reactive+oxygen+species.">Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species.</a> J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הגישה המתוארת כאן מאפשרת הניתוח של טיפול בסידן על ידי podocytes של glomeruli המכרסמים. טכניקה זו מאפשרת יישום של אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק היחידה ערוץ וההדמיה confocal ratiometric הקרינה. עם זאת, ניתן להשתמש בשתי הגישות בנפרד, בכוחות עצמם. יש הפרוטוקול המוצע כמה צעדים פשוטים יחסית, ה...

הכליות לשמור על איזון homeostatic לחומרים שונים ולהסדיר את נפח דם באופן שקובע כולל לחץ דם. הפרעות בסינון הכלייתי, הספיגה או להוביל להפרשה או מצבים פתולוגיים מלווים, החל יתר או תת לחץ דם בסופו מחלת כליות בשלב שסופו של דבר דורשת השתלת כליה. יחידת כליות הסינון (glomerulus) מורכבת משלוש שכבות - האנדותל הנימים, קרום במרתף ושכבת תא בודד של תאי אפיתל - podocytes, אשר ממלא תפקיד מרכזי בשמירה על שלמות החריץ-סרעפת והפונקציה 1. חוסר תפקוד במסנן גלומרולרי permselective גורם לאובדן שתן של מקרומולקולות, כגון חלבון. סוכנים שונים עשויים להשפיע על המבנה של podocytes ותהליכי רגלם, הקובע את שלמות מחסום סינון glomeruli. Podocytes מעורב בתחזוקה של הגנב שפונקצית סינון eruli. זה כבר נקבע כי טיפול סידן נאותה podocyte מוביל לפציעת תא וממלא תפקיד חשוב בהתקדמות של צורות שונות של nephropathies 2,3. לכן, פיתוח של מודל המאפשר למדידה ישירה של שינויי ריכוז סידן תוך תאי יהיה אינסטרומנטלי ללימודים של פונקצית podocyte. glomeruli המבודדת שימשה בעבר במחקרים רבים, כולל מדידה של מקדם השתקפות אלבומין משנה 4 והערכה של זרמים סלולריים נפרד במדידות תיקון מהדק אלקטרו כל תא 5,6. בעבודה הנוכחית אנו מתארים את הפרוטוקול שמאפשר לחוקר למדוד תאיים שינויי ריכוז סידן בתגובה לבקשות של סוכנים תרופתיים, להעריך את הרמות בסיסיות של סידן בתוך התאים, ולהעריך את פעילות ערוצי סידן בודדת. מדידות ריכוז סידן Ratometric וelectrop תיקון מהדקhysiology שימש לקביעת שינויים בריכוז סידן תוך תאי במסגרת פעילות podocyte והערוץ, בהתאמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluo4 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F14217</td>
			<td>500&#181;l in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuraRed AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F-3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F-68&#160;</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3909-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon confocal microscope (inverted)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td>&#160;Laser exitation 488nm. Emission filters 500-550nm and 570-620nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6661B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Silicone Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording/perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch Clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Pass Filter</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>LPF-8</td>
			<td>8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvibration isolation table</td>
			<td>TMC</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel valve perfusion system</td>
			<td>AutoMake Scientific</td>
			<td>Valve Bank II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording/perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10 . 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5904-5UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niflumic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3514-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEA chloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>T2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835030</td>
			<td>without antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8327</td>
			<td>30% albumin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td>MCW core</td>
			<td></td>
			<td>for rodents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel sieves:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>#100 (150 &#956;m), 140 (106 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson, Inc&#160; SIEVE 3 SS FH NO200</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>50-871-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson, Inc&#160; SIEVE 3 SS FH NO270</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>50-871-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson, Inc&#160; SIEVE 3 SS FH NO400</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>50-871-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mesh 200&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s4145</td>
			<td>screen for CD-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PE50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane anesthesia</td>
			<td><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other basic reagents</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

כאן אנו התייחסנו לבעיה של מדידת שינויים חריפים ברמות סידן בpodocytes. איור 1 מראה ייצוג סכמטי של פרוטוקול הניסוי תוכנן על מנת לבצע הדמיה confocal הקרינה חי ברזולוציה גבוהה והקלטות פעילות ערוץ יון אחד בpodocytes של טרי glomeruli מכרסם מבודדת. בקצרה, לאחר החולדה מורדמת, צריכים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli at JoVE.com

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

ערוץ יחיד הדמיה ניתוח וסידן בPodocytes של glomeruli מבודדת טרי

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

single-channel-analysis-calcium-imaging-podocytes-freshly-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  Medical College of Wisconsin. Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. 

Video: Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

הדמיה תפקודית של שומן חום בעכברים עם FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...