המחברים מבקשים להודות לגלן סלוקום (ספר לרפואה של ויסקונסין) וקולין א לאבין (ניקון מכשירים, Inc) לקבלת סיוע טכני מעולה עם ניסויים במיקרוסקופ. גרגורי בלס הוא הודה להגהה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות וHL108880 מענק איגוד סוכרת האמריקנית להעניק 1-15-BS-172 (לAS), ובן ג &#39;יפס מחקר המלגה מהאגודה לנפרולוגיה האמריקנית (ל- DVI).

שימוש בבעלי חיים ולרווחתם צריך לדבוק במדריך NIH לטיפול ושימוש בחי המעבדה הבא פרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC). פלאש 1. הכליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עכברוש 8 עד 12 בשבוע ישן זכר (הציע הוא זן ספראג Dawley, אולם זנים אחרים של גיל ומין שונים ניתן להשתמש עם שינויים מתאימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה על פי הנוהל מתיר פרוטוקול IACUC; לפקח עומק ההרדמה ולבדוק את בעלי החיים. התיאור מפורט של הניתוח שיבוצע ב1.3 - ניתן למצוא 1.8 בet al Ilatovskaya 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה נכונה, למקם את החיה על שולחן ניתוחים בטמפרטורה מבוקרת, לעשות (עד 3 אינץ &#39;באורך) חתך קו האמצע של הבטן, ולחשוף את הווריד הנבוב ואב העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מייתר סביב עורקי צליאק וmesenteric מעולה והבטןאב העורקים מעל אלה; לא לקשור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוטה לנתח אב העורקים בבטן מתחת לעורקי הכליה, ומניח את שני חיבורים אותיות סביבו, אבל לא לקשור, אז מהדק את אב העורקים מעל חיבורי האותיות ולקשור את החוט התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטטר אב העורקים עם צינורות פוליאתילן PE50 (המצורפים למשאבת מזרק מלאה PBS) מתחת למהדק ולתקן את הקטטר עם המייתר השני; להסיר את המהדק, להפעיל את המשאבה, ולקשור את אב העורקים ועורקי mesenteric עם צליאק. במהירות לעשות חתך בעורק כליה כדי להקל את הלחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות את אב העורקים עם PBS-מקורר מראש עבור 2 או 3 דקות בקצב של 6 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור זלוף, בלו וdecapsulate 7 הכליות, ולשים אותם על קרח בפתרון PBS. להרדים את החיה על פי פרוטוקול שאושר על ידי IACUC. </li></ol> 2. בידוד של glomeruli העכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 30 מיליליטר של תמיסה טריות של BSA 5% בRPMI 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח ומספריים,לבודד את הקליפה של שני הכליות, ולאחר מכן ברר עד הומוגנית. הליך זה כבר תואר קודם לכן 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את הרקמה טחונות בשלב הקודם דרך מסננת נירוסטה 100 רשת (ספוג מראש ב 5% BSA / פתרון RPMI) בעזרת מרית. לאסוף את הזרימה דרך בכוח הכבידה לאפשר הזרימה דרך לעבור דרך מסננת 140 רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הזרימה דרך נאסף מהרשת 140 מסננת באמצעות מסננת רשת מראש ספוג 200, לבטל את התסנין, ולשטוף את החלק העליון של המסננת עם 10 - 15 מיליליטר של פתרון BSA / RPMI מוכן לאסוף glomeruli שהמשקעת ב המסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את פתרון BSA / RPMI המכיל glomeruli על קרח בצינור 15 מ&quot;ל ולתת משקעי glomeruli בחלק התחתון של הצינור עד 20 דקות. תרכיז glomeruli בחלק התחתון של הצינור יהיה לראות בבירור. הסר את הפתרון העודף, עוזב כ 2 מיליליטר בצינור. </li></ol> 3. ערוץ יחיד תיקון מהדק אלectrophysiology <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שבבי זכוכית כיסוי 5 X 5 מ&quot;מ על ידי ציפוי אותם עם MW 70,000 - 150,000 פולי-ʟ ליזין, ולתת יבש. השתמש כ -30 μl של פתרון מסונן סטרילי 0.01% במים לכיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את הפתרונות הניסיוניים לRT ולמלא את תא תיקון- clamp ופיפטה. לניטור ערוצי TRPC, להשתמש בפתרון אמבטיה, במ&quot;מ: 126 NaCl, 1 CaCl 2, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 10 גלוקוז, pH 7.4; פיפטה: 126 NaCl, 1.5 CaCl 2, 10 HEPES, 10 גלוקוז; pH 7.4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מעכבים לפתרון פיפטה לחסום את הפעילות של ערוצי אנדוגני, שאינם רלוונטיים ללימודים (המומלצים הם: חומצת niflumic 100 מיקרומטר או DIDS (לחסום Ca 2 + Cl -activated - ערוצים), 10 מ&quot;מ TEA (לעכב גדולות-מוליכות 2 Ca + - K התלוי + ערוץ), 10 iberiotoxin ננומטר (לחסום את Ca 2 + K + ערוצי -activated), 10 מיקרומטר nicardipine (לחסום N-סוג Ca2 + ערוצים)) ישירות לפני ניסוי תיקון מהדק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות הפתרון המכיל glomeruli, ולאחר מכן להחיל כ -50 μl שלו לשבבי זכוכית הכיסוי מצופה פולי-ʟ ליזין. בואו glomeruli לצרף לכ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את שבבי זכוכית עם glomeruli לתא תיקון- clamp מראש מלא בפתרון האמבטיה; perfuse קאמרי בשיעור של 3 מיליליטר / דקה 1 דקות כדי להבטיח את הסרת glomeruli הפנוייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל ניסוי תיקון- clamp קונבנציונלי במצב 7-מצורף תא. עם טפטפת זכוכית (7-10 התנגדות פיפטה MΩ) ליצור חותם גבוהה התנגדות בין פיפטה וקרום podocyte ידי החלת שאיבה עדינה (פיפטה המצורפת לpodocyte על פני השטח של glomerulus המבודד מוצג באיור 2, ב משמאל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידות מצורפים תא, נמוך לעבור הזרמים ב 300 הרץ על ידי מסנן שמונה-מוט בסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Use מבודד glomeruli בניסויי תיקון מהדק עד 4 - 6 שעות. שמור את חלק glomeruli המניות על קרח. </li></ol> 4. מדידות ratiometric Confocal הקרינה של ריכוז סידן תוך תאים בPodocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 500 μl של חלק glomeruli (שתואר על 2.5) 0.5 מיליליטר בצינור חרוטי ולהוסיף צבעי סידן פורעה אדום, בבוקר וFluo-4, בבוקר. השתמש 2 מ&quot;מ ו 1 ריכוזי מניית מ&quot;מ של פורעה האדום, בבוקר וFluo-4, בבוקר, בהתאמה (חנות ב -20 ° C, מומס DMSO) ולהשתמש 2.5 μl של כל צבע לμl 500 של חלק glomeruli. מייד לאחר תוספת של הצבעים לכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום צינורות על שייקר מסתובב לפחות 20 דקות עד שעה 1 בRT. הערה: ניתן להוסיף סוכנים תרופתי במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן coverslips זכוכית, לכסות אותם עם פולי-ליזין ʟ ולאפשר ייבוש באמצעות סט צלחת מחומם ל -70 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהטעינה של צבעי סידן היא completדואר, יחול של glomeruli מכילה פתרון לcoverslips המצופה פולי-ליזין 100 ʟ μl ולתת להם להיצמד למשטח לכ -5 דקות. הר coverslips המצורף glomeruli לחדר הדמיה, ותנקב עם פתרון האמבטיה (המכיל (במ&quot;מ): 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, pH 7.35) בשיעור של 3 מיליליטר / דקה להסרת glomeruli הפנוייה והצבעים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקרוסקופ סריקת לייזר confocal לגל עירור 488 ננומטר ומסנני פליטה (525/25 וננומטר 650/25 לFluo-4 ופורע אדום, בהתאמה). הגדר את תוכנת הדמיה לתדר ורזולוציה רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא glomeruli בbrightfield ולאחר מכן הפעל את זיהוי של אותות הקרינה. התאם את עוצמת הלייזר לכל צבע כדי למנוע הרוויה של האות. בחר את מישור המוקד עם podocytes שישירות מחוברים לזכוכית. זה ממזער את ההשפעה נגרמת על ידי התכווצות של glomerulus בתגובה לתרופהיישום. פעמיים לבדוק שglomerulus של בחירה מצורף גם לזכוכית; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הדמיה מישור המוקד של בחירה (לקחת 512 x 512 תמונות עם התדירות שנקבעה ב 4 שניות לדמיין Ca 2 + שינויים מהירים חולפים. השתמש 60x / עדשה אובייקטיבית דומה NA 1.4 או לתמונה ברזולוציה גבוהה), תחול תרופות של עניין, ולהקליט את התגובה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מטוס מוקד רצוי (קרוב למשטח של הזכוכית ככל האפשר, כדי להבטיח הדמיה של podocytes על פני השטח של glomerulus). בדוק את עוצמת הקרינה על Fluo4 וערוצי FuraRed, ולוודא כי glomerulus נראה בbrightfield ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הדמיה. לפני היישום של כל תרופות, שיא לפחות 1 דקות של הקרינה בסיס לוודא כי האות היא יציבה (אין קוצים פתאומיים או דהייה של האות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תרופות הרצויות בעזרת micropipette; להיות זהיר ולוודא את התרופה הצליחה לפזר היטב ולהגיע לglomerUlus. מערבבים את פתרון האמבטיה בעדינות אם יש צורך, לפקח על מישור המוקד הנבחר ולבדוק שזה לא זז מחוץ לפוקוס בגלל יישום הסמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את השינויים בעוצמת הקרינה לאותות Fluo4 וFuraRed. ודא ההקלטה היא מספיק זמן, על ידי מחכה עד האות מגיעה לרמת הרמה או מגיעה לשיא ואז חוזרת לנקודת התחלה. לבצע שינוי פתרון או תוספת של כל תרופות אחרות במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את ההקלטה, ולשמור את הקובץ בתבנית המקורית של התוכנה. </li></ol></li></ol> ניתוח תמונה 5. למדידות סידן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח תמונה עם התוכנה הפתוחה ImageJ מצויד בתוסף שירות ND המאפשר יבוא תמונות בפורמט ND2 הילידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את התמונה ברצף; לוודא לפצל את הערוצים ולהשתמש בגווני אפור מצב hyperstack. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב → כלים → נתיב מנהל ROI לנתח בתוכנת ImageJ לoעט חלון מנהל החזר על השקעה. בחר כמה אזורים של העניין (podocytes) באמצעות כלי בחירה סגלגלים ו&quot; הוסף (t) &quot;הפונקציה במנהל ההחזר על ההשקעה. כהחזר על ההשקעה האחרונה, בחר את האזור ברקע; להציל את ROIs נבחר (עוד → שמור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את החלון המכיל את הערוץ שנבחר לניתוח. השתמש עוד → פונקצית מדידה רב במנהל את ההחזר על ההשקעה, סמן את התיבה &quot;שורה אחת לכל פרוסה&quot; בדיאלוג שקופץ החוצה, ולאחר מכן לחץ על אישור. התוצאות יוצגו בפורמט שניתן להגדיר בחלון התוצאות: להיכנס לתוצאות אפשרות תפריט → מדידות, בחר &quot;Mean ערך אפור&quot; ולחשב את ערכי עוצמה עבור כל פיקסל את ההחזר על ההשקעה, אשר יוצג ב חלון תוצאות בעמודות נפרדות לכל החזר על השקעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את ערכי עצמת ROI נמדדו עבור כל ערוץ (Fluo-4 ופורע אדום) לתוך תוכנת ניתוח נתונים העדיפה; ערכי עוצמת רקע לגרוע מכל DATנקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל נקודת זמן לחשב את היחס של עוצמות של Fluo-4 לערוצי פורעה אדומים. פיזור עלילה / קו שינויים של חולף Ca 2 + לכל החזר על השקעה נקודה-זמן. חישוב ממוצע ערכים / SE לglomeruli נבחרה. הערה: טור זמן צריך להיות מוגדר על פי תדירות הדמיה נבחרה על 4.5. </li></ol> 6. חישובי ריכוז סידן תוך תאים באמצעות Fluo-4 פלואורסצנטי איתותים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דוגמא של glomeruli ולבצע את פרוטוקול הניסוי עד שלב 4.7. לאחר ההקלטה של ​​הקרינה הרקע להוסיף ionomycin (ריכוז סופי בתא האמבטיה צריך להיות 10 מיקרומטר) לפתרון האמבטיה, ועליית עוצמת הקרינה שיא. ברגע שמגיעה למקסימום העצמה שלה והריקבון מתחיל, להוסיף MnCl 2 (ריכוז סופי צריך להיות 5 מ&quot;מ) כדי להרוות את הקרינה 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים שהתקבלו ב6.1. העתק את Fluo-4 ערכי עוצמת אות ROI מתקבלים לפילפרוטוקול המתואר ב5.1-5.5 על ידי תוכנת ניתוח מועדפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ריכוז סידן תוך תאי (בננומטר) בpodocyte המתאים להחזר על ההשקעה באמצעות נוסחא: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> שם ד K הוא ניתוק שנקבע מראש קבוע לFluo-4 (345 ננומטר), F הוא העצמה בנקודה הזמן שאתה חישוב ריכוז סידן ל( בסיס), ודקות F ו- F מקסימום הם ערכי העצמה ב נקודת העומס מרבי סידן (לאחר יישום ionomycin) ואחרי מרווה של הקרינה (עם MnCl 2), בהתאמה (ראה איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+nephrotic+syndrome:+connecting+molecular+genetics+to+podocyte+physiology.">Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).</li><li>Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+glomerular+barrier+and+mechanisms+of+proteinuria.">Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria.</a> Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).</li><li>Patrakka, J., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+role+of+podocytes+in+proteinuria.">New insights into the role of podocytes in proteinuria.</a> Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).</li><li>Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+albumin+reflection+coefficient+with+isolated+rat+glomeruli.">Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).</li><li>Gloy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+depolarizes+podocytes+in+the+intact+glomerulus+of+the+Rat.">Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat.</a> J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).</li><li>Nitschke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+the+intracellular+calcium+activity+in+podocytes+of+the+intact+glomerulus.">Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus.</a> Kidney Int. 57, 41-49 (2000).</li><li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+analysis+of+TRPC+channels+in+the+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli.">Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li><li>Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+heavy+metal+ions+perturb+fura-2+measurements+of+basal+and+hormone-evoked+Ca2++signals.">Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals.</a> Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).</li><li>Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mineralocorticoid+and+angiotensin+II+receptor+blockers+on+proteinuria+and+glomerular+podocyte+protein+expression+in+a+model+of+minimal+change+nephrotic+syndrome.">Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome.</a> Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).</li><li>Abramowitz, J., Birnbaumer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+canonical+transient+receptor+potential+channels).">Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels).</a> FASEB J. 23, 297-328 (2009).</li><li>Heeringa, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+TRPC6+mutation+that+causes+childhood+FSGS.">A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS.</a> PLoS ONE. 4, e7771 (2009).</li><li>Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+role+of+TRPC6+in+vitamin+D+ameliorating+podocyte+injury+in+STZ-induced+diabetic+rats.">The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats.</a> Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).</li><li>Bohrer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+puromycin-induced+defects+in+the+transglomerular+passage+of+water+and+macromolecules.">Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules.</a> J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).</li><li>Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+charge+and+size+selectivity+barrier+of+the+glomerular+filter+in+aminonucleoside+nephrosis+in+rats.">Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats.</a> Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).</li><li>Schiessl, I. M., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+AT2+receptor+activation+attenuates+AT1+receptor-induced+increases+in+the+glomerular+filtration+of+albumin:+a+multiphoton+microscopy+study.">Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSAIDs+acutely+inhibit+TRPC+channels+in+freshly+isolated+rat+glomeruli.">NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).</li><li>Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+wave+of+tubuloglomerular+feedback.">Calcium wave of tubuloglomerular feedback.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).</li><li>Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+directly+stimulates+ENaC+activity+in+the+cortical+collecting+duct+via+AT(1)+receptors.">Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).</li><li>Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+the+P2+receptors+profile+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated+rat+glomeruli.">Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+has+acute+effects+on+TRPC6+channels+in+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli.">Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).</li><li>Schaldecker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+TRPC5+ion+channel+protects+the+kidney+filter.">Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter.</a> J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).</li><li>Roshanravan, H., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+acting+through+P2Y+receptors+causes+activation+of+podocyte+TRPC6+channels:+role+of+podocin+and+reactive+oxygen+species.">ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).</li><li>Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+activation+of+TRPC6+channels+in+rat+podocytes+requires+generation+of+reactive+oxygen+species.">Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species.</a> J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הגישה המתוארת כאן מאפשרת הניתוח של טיפול בסידן על ידי podocytes של glomeruli המכרסמים. טכניקה זו מאפשרת יישום של אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק היחידה ערוץ וההדמיה confocal ratiometric הקרינה. עם זאת, ניתן להשתמש בשתי הגישות בנפרד, בכוחות עצמם. יש הפרוטוקול המוצע כמה צעדים פשוטים יחסית, ה...

הכליות לשמור על איזון homeostatic לחומרים שונים ולהסדיר את נפח דם באופן שקובע כולל לחץ דם. הפרעות בסינון הכלייתי, הספיגה או להוביל להפרשה או מצבים פתולוגיים מלווים, החל יתר או תת לחץ דם בסופו מחלת כליות בשלב שסופו של דבר דורשת השתלת כליה. יחידת כליות הסינון (glomerulus) מורכבת משלוש שכבות - האנדותל הנימים, קרום במרתף ושכבת תא בודד של תאי אפיתל - podocytes, אשר ממלא תפקיד מרכזי בשמירה על שלמות החריץ-סרעפת והפונקציה 1. חוסר תפקוד במסנן גלומרולרי permselective גורם לאובדן שתן של מקרומולקולות, כגון חלבון. סוכנים שונים עשויים להשפיע על המבנה של podocytes ותהליכי רגלם, הקובע את שלמות מחסום סינון glomeruli. Podocytes מעורב בתחזוקה של הגנב שפונקצית סינון eruli. זה כבר נקבע כי טיפול סידן נאותה podocyte מוביל לפציעת תא וממלא תפקיד חשוב בהתקדמות של צורות שונות של nephropathies 2,3. לכן, פיתוח של מודל המאפשר למדידה ישירה של שינויי ריכוז סידן תוך תאי יהיה אינסטרומנטלי ללימודים של פונקצית podocyte. glomeruli המבודדת שימשה בעבר במחקרים רבים, כולל מדידה של מקדם השתקפות אלבומין משנה 4 והערכה של זרמים סלולריים נפרד במדידות תיקון מהדק אלקטרו כל תא 5,6. בעבודה הנוכחית אנו מתארים את הפרוטוקול שמאפשר לחוקר למדוד תאיים שינויי ריכוז סידן בתגובה לבקשות של סוכנים תרופתיים, להעריך את הרמות בסיסיות של סידן בתוך התאים, ולהעריך את פעילות ערוצי סידן בודדת. מדידות ריכוז סידן Ratometric וelectrop תיקון מהדקhysiology שימש לקביעת שינויים בריכוז סידן תוך תאי במסגרת פעילות podocyte והערוץ, בהתאמה.

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-&amp;#671;-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>solution</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>Germany</td></tr><tr><td>Nikon confocal microscope (inverted)</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Silicone Compound</td></tr><tr><td>Software</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Low pass filter</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8 pole Bessel</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japan</td></tr><tr><td>Motorized micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Microvibration isolation table</td><td>TMC</td><td></td><td>equipped with Faraday cage</td></tr><tr><td>Multichannel valve perfusion system</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoxin</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Niflumic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TEA chloride</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>without antibiotics</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>30% albumin solution</td></tr><tr><td>Temperature controlled surgical table</td><td>MCW core</td><td></td><td>for rodents</td></tr><tr><td>Steel sieves:</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>mesh 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>screen for CD-1</td></tr><tr><td>Binocular microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Binocular microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump-based perfusion system</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene tubing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane anesthesia</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Other basic reagents</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

כאן אנו התייחסנו לבעיה של מדידת שינויים חריפים ברמות סידן בpodocytes. איור 1 מראה ייצוג סכמטי של פרוטוקול הניסוי תוכנן על מנת לבצע הדמיה confocal הקרינה חי ברזולוציה גבוהה והקלטות פעילות ערוץ יון אחד בpodocytes של טרי glomeruli מכרסם מבודדת. בקצרה, לאחר החולדה מורדמת, צריכים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli at JoVE.com

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

ערוץ יחיד הדמיה ניתוח וסידן בPodocytes של glomeruli מבודדת טרי

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

single-channel-analysis-calcium-imaging-podocytes-freshly-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  Medical College of Wisconsin. Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. 

Video: Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte foot processes contain actin bundles that bind to cytoskeletal adaptor proteins such as podocin. Those adaptor proteins, such as podocin, link the backbone of the glomerular slit diaphragm, such as nephrin, to the actin cytoskeleton. Studying the localization and function of these and other podocytic proteins is essential for the understanding of the glomerular filter&#39;s role in health and disease. The presented protocol enables the user to visualize actin, podocin, and nephrin in cells with super resolution imaging on a conventional microscope. First, cells are stained with a conventional immunofluorescence technique. All proteins within the sample are then covalently anchored to a swellable hydrogel. Through digestion with proteinase K, structural proteins are cleaved allowing isotropical swelling of the gel in the last step. Dialysis of the sample in water results in a 4-4.5-fold expansion of the sample and the sample can be imaged via a conventional fluorescence microscope, rendering a potential resolution of 70 nm.

The presented method enables visualization of fluorescently labeled cellular proteins with expansion microscopy leading to a resolution of 70 nm on a conventional microscope.

הדמיה של חלבונים פודוציטיים נפרין, אקטין ופודוצ'ין עם מיקרוסקופיית הרחבה

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Biochemistry

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Neuroscience

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

דרך יעילה Sieving כדי לבודד Glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Medicine

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיית סידן חד-תאי למחקרי הפעלת ערוצים

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and chemicals et al. It primarily relies on microscopy imaging technology and the related Ca2+ indicator Fura-2/AM (AM is the abbreviation for Acetoxymethyl ester). Inside the cells, Fura-2/AM is hydrolyzed by esterases into Fura-2, which can reversibly bind with free cytoplasmic Ca2+. The maximum excitation wavelength shifts from 380nm to 340nm (when saturated with Ca2+) upon binding. The emitted fluorescence intensity is quantitatively related to the concentration of bound Ca2+. By measuring the 340/380 ratio, the Ca2+ concentration in the cytoplasm can be determined, eliminating errors caused by variations in the loading efficiency of the fluorescent probe among different samples. This technology allows for real-time, quantitative, and simultaneous monitoring of Ca2+ changes in multiple cells. The results are stored in &#8220;.XLSX&#8221; format for subsequent analysis, which is fast and generates intuitive change curves, greatly improving the detection efficiency. From different experimental perspectives, this article lists the use of this technology to detect Ca2+ signals in cells with endogenous or overexpressed channel proteins. Meantime, different methods for activating cells were also showed and compared. The aim is to provide readers with a clearer understanding of the usage and applications of single cell Ca2+ imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>דימות סידן חד-תאי לחקר הפעלת תעלות יוני סידן

This article presents a method for real-time, quantitative monitoring of calcium ion (Ca2+) concentrations in cells using single-cell Ca2+ imaging with the Fura-2/AM dye. This technique enables efficient dye loading and accurate calculation of Ca2+ levels through fluorescence intensity ratios, making it a simple and rapid approach for research applications.

דימות סידן חד-תאי לחקר הפעלת תעלות יוני סידן

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...