הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים תרבות, כל ההליכים פרוטוקול זה מבוצעות באמצעות שיטות מעבדה סטרילית שנערך מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. לפני שמתחילים, להבטיח כי התקשורת היא כל equilibrated ל 37 ° C ו בגז כראוי. הכנת Geltrex מצופה צלחות תרבות הערה: ראה נספח לשימוש CELLstart מנות תרבות מצופה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> One הפשירי שפופרת של Geltrex (1 מ&quot;ל) לאט 2-8 ° C ו 1:100 לדלל אותו 99 מ&quot;ל של נוק D-MEM/F-12. מערבבים בעדינות את הפתרון. הערה: יש שורות תאים iPS עשויה לדרוש דילול שונים Geltrex לצמיחה אופטימלית. ראו נספח דילולים חלופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את כל פני השטח של כל מנה תרבות עם פתרון Geltrex (1 מ&quot;ל למנה 35 מ&quot;מ, 1.5 מ&quot;ל למנה 60 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם כל צלחת עם Parafilm כדי למנוע ייבוש דגירה את הכלים במשך שעה 1 ב 37 ° C. הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את Geltrex מצופה מנות התרבות בשעה 4 ° C עד חודש 1. חותם כל צלחת עם Parafilm למנוע Geltrex מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, העברת Geltrex מצופה הכלים ברדס זרימה למינרית ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת החדר (כ - 1 שעה). </li></ol> הכנת בנוקאאוט השלם SR מזין ללא בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 1 מ&quot;ל של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פתרון בסיסי FGF, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. הפתרון Aliquot ולאחסן ב -20 ° C למשך עד 6 חודשים. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> יסוד FGF </td><td> 10 מיקרוגרם </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table> הערה: ניתן להחליף BSA עם HSA או SR נוק בריכוז זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 50 מ&quot;ל של תמיסת מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​2 Dispase, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. סנן לעקר את הפתרון ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 100 מ&quot;ל של SR בנוקאאוט להשלים מזין חינם (KSR-FF) בסביבה נקייה מחיידקים, לשלב את המרכיבים המפורטים בטבלה להלן. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> במלאי ריכוז </td><td> הריכוז הסופי </td><td> נפח </td></tr><tr><td> נוק DMEM/F12 (לא קט. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (קט &#39;מס&#39; 35050-061) </td><td> 200 מ&quot;מ </td><td> 2 מ&quot;מ </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> נוקאאוט SR (לא קט. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> נוקאאוט SR-GFC (לא קט. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> bFGF (לא קט. PHG0024). </td><td> 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 μL </td></tr></tbody></table> אתה יכול לאחסן את המדיום KSR-FF ב 2-8 מעלות עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני טרום equilibrating המדיום להשלים לטמפרטורה וגזים, בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף נפח הנדרש mercaptoethanol 2 (55 מניות בריכוז mM) בריכוז סופי 0.1 מ&quot;מ. לדוגמה, כדי להכין 100 מ&quot;ל של KSR-Fבינוני F להוסיף μL 182 מ&quot;מ 55 2 mercaptoethanol (1:550 דילול) לחילופין, 2 mercaptoethanol ניתן להוסיף בינוני השלימה 1X ומאוחסנים ב 2-8 מעלות צלזיוס עד שבוע. </li></ol> הכנת הקפאה / cryopreservation בינוני בינוני cryopreservation מורכב משני התקשורת; בינוני מקפיא A ו-B בינוני הקפאת הם הוסיפו לתאים בזמנים שונים חייבים להישאר מופרדים. הם כל אחד 50% מהנפח הכולל של בינונית cryopreservation הצורך. סך היקף בינוני cryopreservation שצריך הוא 1 מ&quot;ל על כל בקבוקון להיות קפוא. צלחת 90% 60mm ומחוברות של hESC יכול לשמש לבנק 2 בקבוקונים של hESC בתקשורת cryopreservation. הכן נפח מספיק בינונית כל הקפאה עם תוספת 2-5 מ&quot;ל כדי להבטיח overage. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בינוני הקפאה (50% של נפח סופי): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> 50% KSR </td></tr><tr><td> בינוני B מקפיא (50% של נפח סופי): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> 20% DMSO </td></tr></tbody></table> דוגמה: אם אתה מקפיא 20 בקבוקונים של תאים, תצטרך 20mL של cryopreservation בינוני. הוסף 4mL עבור overage עבור סכום כולל של בינונית cryopreservation 24mL. כלומר, תצטרך 12mL של הקפאת בינוני (50% 24mL) ו 12mL של B בינוני הקפאה (50% 24mL). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בינוני הקפאה (12 מ&quot;ל): </td><td> 6 מ&quot;ל DMEM/F12 </td><td> 6 מ&quot;ל KSR </td></tr><tr><td> בינוני B מקפיא (12 מ&quot;ל): </td><td> 9.6 מ&quot;ל DMEM/F12 </td><td> 2.4 מ&quot;ל DMSO </td></tr></tbody></table> ההרכב הסופי של המדיום cryopreservation הוא 65% DMEM/F12, KSR 25% ו 10% DMSO. Cryopreserving iPSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם נפח הנדרש Dispase בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאזן את נפח הנדרש KSR-FF תוך 37 דק &#39;for15 ° C אמבט מים. עיין 1below טבלה לקבל פרטים על אמצעי האחסון הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום בילה מספינת תרבות באמצעות פיפטה, ולשטוף את התאים פעמיים עם D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף מראש חימם פתרון Dispase לכלי השיט תרבות (למשל, 1 מ&quot;ל של תמיסת Dispase לכל צלחת 60 מ&quot;מ תרבות). מערבולת כלי התרבות כדי לצפות את פני התא כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כלי מן האינקובטור, לשאוב את הפתרון Dispase, לשטוף בעדינות את התאים עם D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד את התאים את פני השטח של צלחת התרבות באמצעות מגרד התא, ולהעביר את התאים צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המנה תרבות פעמיים עם KSR-FF, בעדינות &quot;ריסוס את&quot; כל התאים לא מנותקת. בריכת בינוני לשטוף עם התאים בצינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התחתית XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו כמות מספקת של cryovials. ברגע שהתאים נמצאים בקשר עם DMSO, הם צריכים להיות aliquoted קפואים בתוך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קפיצי בעדינות את הצינור, באופן מלא לעקור את התא גלולה מתחתית הצינור מחדש להשעות את התאים א בינוני מקפיא [על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה באמצעות 5 מ&quot;ל סרולוגיות פיפטה]. בעקבות השעיה אחיד של גושים, מוסיפים נפח שווה של B בינוני מקפיא אליו, בצורה טיפה חכם, בעוד בעדינות מתערבל ההשעיה תא לערבב. הערה: בשלב זה, התאים נמצאים בקשר עם DMSO, עבודה חייב להתבצע ביעילות. לאחר התאים נמצאים בקשר עם DMSO, הם צריכים להיות aliquoted קפואים בתוך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 1 מ&quot;ל של השעיה על התא cryovial כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות למקום בקבוקונים ב פרוסטי מר [במהירות להקפיא] ולהעביר אותו -80 מעלות למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אחסון ולינה -80 ° C, להעביר את התאים מיכל חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך. </li></ol> iPSC להפשיר בקבוקון והתאוששות תא הערה: KSR-FF עשוי להיות מוחלף עם המדיום MEF ממוזג KSR המכילים, או בינוני KSR לשימוש עם המאכיל. ראו נספח הוראות להכנת אמצעי התקשורת. טרום חמים 10 מ&quot;ל של מדיום KSR-FF בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הכמות המתאימה של Geltrex מצופה הכלים בטמפרטורת החדר לשאוב כל נוזל הכלים לפני ציפוי אותךr תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את hESC (או iPSC) בקבוקון מטנק חנקן נוזלי אחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון קפוא להפשיר במהירות של תאים אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים, רק עד נתח קפוא קטן נשאר הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס בקבוקון עם 70% isopropanol כדי לטהר אותו ולהעביר אותו את מכסה המנוע רקמה סטרילית תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, להעביר את כל תכולת הבקבוקון לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל בעזרת פיפטה 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הבקבוקון עם 1 מ&quot;ל של KSR-FF ולהוסיף את זה צינור 15 צנטריפוגות מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט, להוסיף 4 מ&quot;ל של KSR-FF נפתח חכם התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. בעוד הוספת בינוני, בעדינות להזיז את הצינור הלוך ושוב לערבב את התאים. (פעולה זו מפחיתה את הלם אוסמוטי על התאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שפופרת 15 מ&quot;ל עם ההשעיה התא 1000rpm (200 x ז) ​​למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב ולהיפטר supernatant מבלי להפריע לתא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את התא גלולה מראש חימם KSR-FF (למשל 4mL/60 צלחת מ&quot;מ) בעזרת פיפטה 5 מ&quot;ל פיפטה בעדינות את התאים למעלה ולמטה עד התא גלולה מפוזרת באופן מלא. הכדאיות של יותר מ 70% צפויה, אולם אם הכדאיות הוא פחות מ -70%, זה עלול לקחת זמן רב יותר עבור התאים להגיע למפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה אותו, להעביר את ההשעיה תא נפתח חכם צלחת Geltrex מצופה תרבות טרום equilibrated לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת תרבות 37 ° C חממה, עם אווירה humidified של CO 4-6% 2 באוויר. בזהירות מערבולת כלי בצפון לדרום, ממזרח למערב דפוס כדי לפזר באופן שווה את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות נוזל לשנות את המנה תרבות 24 שעות לאחר ההפשרה ואת יום לאחר מכן להסיר את פסולת התא כדי לספק מזון טרי עד המנה הוא כ 70-80% ומחוברות. עבור התרבות המשך passaging של תאים iPS שלך, עיין בפרוטוקול שלנו תחת הכותרת &quot;מזין ללא התרבות Passaging של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני&quot; </li></ol> תוצאות צפויות התאים צריכים להיות בערך 70-80% ומחוברות לפני cryopreservation. Dispase תוצאות עיכול להתכרבל מתקפלים המושבות בשולי המושבה. לאחר קצירת התאים הם קפואים כמו גושים קטנים בתקשורת cryopreservation. לאחר הבקבוקון הוא מופשר, תאים להתאושש לצרף צלחת מצופה מראש כמו גושים קטנים. הם גדלים במהירות המוביל צלחת ומחוברות בתוך 5-6 ימים. לוח 1 - כרכים מומלצים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> 35mm דיש </td><td> 60mm דיש </td><td> 100mm דיש </td></tr><tr><td> השלם בנוקאאוט SR בינוני </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 4 מ&quot;ל </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Geltrex פתרון </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 1.5 מ&quot;ל </td><td> 4-5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 3-4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> D-PBS עבור שטיפה </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 4 מ&quot;ל </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> אנא <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">לחץ כאן כדי לראות את התוספתן</a> .

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li><li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li></ol>

המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי החיים טכנולוגיות המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Knockout DMEM/F12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>12660-012</td>
<td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)</td>
</tr>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A10580-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &mu;g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PHG0024</td>
<td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td>
</tr>
<tr>
<td>2-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>21985-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>17105-041</td>
<td>Note: see appendix for alternative passaging methods</td>
</tr>
<tr>
<td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A10480-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO, 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>JT Baker</td>
<td>JT9224-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Tissue Culture Hood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator set at 37&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette-Aid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bath set at 37&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 mm Tissue Culture treated dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liquid nitrogen storage tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopropanol freezing containers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 mL Cryovials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cryopreserving and recovering of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

הגילוי בשנת 2006 כי fibroblasts האדם העכבר יכול להיות reprogrammed כדי לייצר תאים iPS 1-3 עם איכויות דומות להפליא בתאי גזע עובריים יצרה מקור חדש בעל ערך של תאים pluripotent עבור גילוי תרופות, טיפול בתא, ואת המחקר הבסיסי. התקשורת GIBCO ו ריאגנטים להיות בחוד החנית של המחקר תא גזע pluripotent במשך שנים. נוק DMEM בתוספת החלפת נוק סרום הוא התקשורת המועדף על צמיחת תאים גזע עובריים ועכשיו iPS תרבית תאים 3-9. מערכת זו תקן הזהב לתקשורת כעת ניתן להשתמש עבור תרבות חופשית מזין עם תוספת של SR קוקטייל נוק גורם הגדילה. ES האדם מסורתית ותרבות iPS שיטות תא דורשים שימוש בעכבר או אדם מזין שכבות פיברובלסטים, או מזין ממוזג בינוני. שיטות אלה הם תרבות עתירי עבודה, קשה בקנה מידה וקשה לשמור על הירכיים תאים שלא עברו התמיינות בשל תנאים מוגדרים. Invitrogen פיתחה SR נוק צמיחה קוקטייל פקטור כדי לאפשר לך מעבר בקלות הירכיים ותרבויות הס תא מזין חופשית תוך שמירה על השימוש שלך SR נוק.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium at JoVE.com

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

פרוטוקול זה מתאר את נוהל מפורט עבור cryopreserving אדם בתאי iPS במדיום בנוקאאוט SR cryopreservation ושחזור אלה תאים להשלים בנוקאאוט SR מזין חינם (KSR-FF) בינוני או מבוססי מזין בנוקאאוט בינוני SR.

Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

cryopreserving-recovering-human-ips-cells-using-complete-knockout

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Views.  Life Technologies.  中文 日本語 

Video: Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Predicting the Effectiveness of Population Replacement Strategy Using Mathematical Modeling

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  Insight is given into how computational models can provide information on the population dynamics of mosquitoes and the spread of transposable elements through A. gambiae subspecies.  The ethical considerations of releasing genetically modified mosquitoes into the wild are discussed.

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy. Insight is given into how computational models can provide information on the population dynamics of mosquitoes and the spread of transposable elements through A. gambiae subspecies. The ethical considerations of releasing genetically modified mosquitoes into the wild are discussed.

חיזוי את האפקטיביות של אסטרטגיה החלפת אוכלוסייה באמצעות מודלים מתמטיים

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  ...

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שב&quot;ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

ניתוח השוואתי של הורמון גדילה האנושית בסרום שימוש SPRi, ננו-SPRi ומבחני ELISA

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...