We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות משרד פנים בבריטניה כמפורט בבעלי חיים (הליכים מדעיים) Act (1986) תחת מספר פרויקט רישיון 60/4435. לאסוף עוברים בשלבי התפתחותיים ספציפיים, הזדווגויות מתוזמן הוקמו O / N. בצהריים ביום של מציאת תוסף נרתיק יועד יום עוברי (E) 0.5. 1. הביתור E7.5 או E8.5 Postimplantation עוברים לאקס תרבות Vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את נקבות העכברים בהריון על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הרחם באמצעות מספריים, מחזיק אותו עם מלקחיים, ומניח בצלחת 30 מ&quot;מ מלא בינוני M2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרוע לגזרים את זהירות מכוסה המיומטריום באמצעות שני זוגות מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף את decidua, נזהר שלא לנקב את חללי extraembryonic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר הקרום של רייכרט על ידי צובט אותו עם מלקחיים ולאט לאט מפריד אותו מהעובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את העוברים תחת לנתחסטראו כדי להבטיח שצק חלמון, amnion וחרוט ectoplacental הם שלמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים לצלחת נקייה של M2 בעזרת פיפטה ומניחים על מכסה צלחת פטרי פלסטיק 30 מ&quot;מ על קרח (&quot;פלטפורמת הקרח &#39;) לעוברי צינה באופן חלקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, עובר חנות בM2 על פלטפורמת קרח לעד 1.5 שעות, למשל., במהלך הכנת תקשורת או מניפולציה של קבוצות קטנות של 3-4 ~ עוברים על RT. הערה: שחזור ודיסקציה של עוברי מכרסמים תוארה בפירוט בעבר 7,8,16. </li></ol> 2. מכין את העובר תרבות בינונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להפשיר או סרום עכברוש מסחרי-זמין (ראה גלנוויל-ג&#39;ונס et al. 13 למפרט), או בסרום חולדה הוכן בבית-פי Copp וCockroft 16 שחום מומת למשך 30 דקות ב 56 C וקפוא ב 1 מיליליטר aliquots ב -80 מעלות הערה: סרום עכברוש מסחרי-זמין מקובל<html> לתקופות של 24-36 שעות תרבות, אם כי בסרום שהוכנו בבית-הוא, בניסיון שלנו, מעולה לתקופות תרבות עד 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין עודף (למשל., 10 מיליליטר) של תוספים מוגדרים בהיקף של גלזגו מזערית בינונית חיוני (GMEM), 1% שאינם חיוניות חומצות אמינו (NEAA), 2 מ&quot;מ L- גלוטמין ופירובט נתרן 1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הנפח של מדיום התרבות שצריך בהתאם למספר העוברים של כל שלב שהולכים להיות מתורבת (ראה סעיף 3). מערבבים את סרום העכברוש עם התוספים המוגדרים כדי לפצות 50% בינוני תרבות (1: 1 (V / V) בסרום חולדה: תוספים מוגדרים) ו / או 75% בינוני תרבות (3: (V / V) בסרום עכברוש 1: הגדרה תוספי תזונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את מדיום תרבות עובר דרך מסנן 0.45 מיקרומטר ולהוסיף 10,000 IU פניצילין מיליליטר / ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. הערה: פתרון L- גלוטמין ופירובט נתרן מופשר טרי הוא חיוני לפיתוח עובר במהלך תרבות vivo לשעבר. </li></ol>דואר &quot;&gt; 3. אקס תנאי תרבות Vivo לשלבים עובריים שונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעוברי E7.5: תרבות סטטי באמצעות צלחות 4-היטב באינקובטור מסופק עם 5% CO 2 באוויר ב 37 צלזיוס למשך 24 שעות. תרבות עד שני עוברים לכל גם ב 1 מיליליטר של 50% בינוניים תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לE8.5 עוברים: להשתמש מנגנון תרבות רולר 8 מסתובבים בסיבובים 35 / דקה בשילוב גזים רציפים עם 5% CO 2 באוויר ב 37 צלזיוס למשך 24 שעות (1 מיליליטר של 50% בינוניים תרבות לכל עובר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעוברי E9.5: להשתמש מנגנון תרבות רולר מסתובב בסיבובי 35 גזים / דקה בשילוב מסופקים עם 5% CO 2, O 40% 2 55% N 2 ב 37 צלזיוס למשך 24 שעות (1 מיליליטר של 75% בינוניים תרבות ל עוּבָּר). הערה: עוברי תרבות בתוך 3 שעות לאחר הרדמת חסד העכברים כתקופות ממושכות בM2 להשפיע לרעה על התפתחות. ראה Copp וCockroft 16 לשיטה של vivo לשעבר תרבות עובר. </li></ol> 4. Graftinתאים בתרבית גרם לE7.5 או E8.5 עכבר עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה פיזית לגרד EpiSCs, אשר בכל מקום להביע GFP, מצלחת תרבות 6 היטב באמצעות קצה פיפטה 20-200 μl ומניח אותם בצלחת 30 מ&quot;מ המכילה את העוברים הערה: כדי להכניס גושי תאים בעוברים, תאים צריכים להיות לגרוטאות פיזית ולא trypsinized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף נימי השתלת יד משכה אל צינור aspirator לעשות פיפטה פה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למצוץ פיפטה הפה לצייר גושי תא אחד או יותר מגודל&gt; 20 תאים להשתלת הנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לפוצץ את התאים, כדי לפזר באופן חלקי גושים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר גוש תא אחד המכיל ~ 10-20 תאים ולמצוץ לתוך נימי השתלה שוב, שמירה על אותה קרוב לפתיחה של הנימים. היזהר שלא להעביר את גוש תא ובמתוך הנימים שוב ושוב, כדי למנוע פריצה לחתיכות קטנות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את העובר באופן רופף במקום עם זוג המלקחיים והכנס את ההשתלהנימים לתוך האזור של עניין כדי ליצור פתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרש את הגוש מנימי השתלה, שעזב את המחרוזת הקצרה של 10-20 תאים נתקעו בעובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך השתלה למספר הרצוי של עוברים. השתמש בגדלים אצווה של 3-4 עובר לנוחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השארת עובר בצלחת של מדיום M2, תמונה עובר המורכבים באמצעות תרכובת הקרינה לנתח מיקרוסקופ עם מצלמה, שמירת זמן הדמיה למינימום, כדי למנוע חשיפה של העוברים לאור וחום מוגזמים. הערה: קבע פעמים הדמיה באופן אמפירי כמו אלה יהיו תלויים במפרט של המצלמה ומיקרוסקופ, כמו גם את עוצמת הטבע וקרינה של fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העובר בpastette עם נפח מינימאלי של מדיום M2 מראש equilibrated בינוני תרבות (ראה סעיף 3) מייד לאחר הדמיה. הערה: לבחון בזהירות את המורפולוגיה של העוברים לאחר השתלה. תרבות רק intacעוברים לא. </li></ol> 5. עבודת יד Electroporation חומרים והתקנת מכשירים (הכן את בעקבות מראש של ניסויי Electroporation): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפטפות הזרקת DNA: למשוך טפטפות הזרקת DNA באמצעות חולץ micropipette אופקי. טפטפות הזרקה צריכה להיות טיפ נאה עם פתיחה פחות מ -10 מיקרומטר, כדי למנוע נזק לרקמות כאשר הזרקת DNA לתוך החללים העובריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לelectroporation נימי זכוכית: להשתמש microforge לחתוך את הפתיחה של טפטפות הזרקת DNA לקוטר פנימי של כל אחד או 30 מיקרומטר 20. כדי למנוע נזק לתאים כאשר הנימים נמצאת בקשר עם העובר לelectroporation, הקצה של זכוכית הנימים יש לחתוך בצורה נקיה ולא מכיל, קצוות השבורים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאלקטרודה בעבודת יד נימים (האנודה) (איור 1): להכניס חוט פלטינה קוטר 0.2 מ&quot;מ לזכוכית נימים electroporation עם פתיחה קבועה של או 30 מיקרומטר 20 קוטר להתמקד הנבחרריק הנוכחי ולספק את ה- DNA פלסמיד לאזור קטן של עניין בעובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאלקטרודה בעבודת יד בצורת L (קתודה) (איור 1): לכופף חוט פלטינה קוטר 0.2 מ&quot;מ יצירת צורה &quot;L&quot;, עם החלק האופקי של &quot;L&quot; סביב 1 מ&quot;מ האורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף כל אלקטרודה פלטינה לחוט מבודד דק ולהכניס אותו לתוך בעל מחט microinjection מכוסה על ידי סרט בידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מחזיקי מחט על מחזיקי מכשיר מיקרומניפולציה סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המעגל כפי שמוצג באיור 1: לחבר את האלקטרודה הנימים להאנודה של אספקת החשמל; לחבר את האלקטרודה בצורת L להאנודה של מודד; לחבר את הקתודה של mulimeter לקתודה של אספקת החשמל. </li></ol> 6. Electroporation E7.5 או E8.5 עכבר עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את נימי זכוכית electroporation עם PBS בתוך 1-2 מ&quot;מ של הראש ולהכניס את straiאלקטרודה להילחם הפלטינה (האנודה) לנימי הזכוכית עד שהוא מגיע לתחתית של הנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעגן את האלקטרודה בצורת L (קתודה) על פני השטח של צלחת פטרי 30 מ&quot;מ מלא PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העובר מבינוני M2 לתוך צלחת electroporation PBS המלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחט הזריקה מepiblast רוחב לתוך החלל מי השפיר של העובר. באמצעות משאבת פיק פנאומטי, להזריק פתרון ה- DNA (pCAG-Cre: GFP או pCAG-GFP 1-1.5 מיקרוגרם / מיליליטר עם 0.01% צבע צבע מאכל ירוק) לתוך החלל עד שהוא מלא לגמרי. לעוברי E7.5-E8.5, פתרון ה- DNA פחות מ -5 μl נדרש לעובר אחד. שימוש בצבע הירוק כמדד, להיזהר שלא פרץ את העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם בזהירות את העובר בין האלקטרודות ולהעביר את האלקטרודה הנימים למיקום המדויק שבו ה- DNA הוא להיות מועבר. הערה: הכיוון של העובר תלוי באזור שבו ה- DNA הוא להיות electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electropoלדרג את העובר באמצעות 200 וולט (V) ב 6 קטניות, כל אחד ממשך ms 50 עם מרווח 1 שניות בין דופק בכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העובר מראש equilibrated בינוני תרבות מייד לאחר electroporation. אם תרצה, חזור על התהליך עבור העובר הבא. הערה: הוסף את מדיום התרבות לתוך מיכל סטרילי ולשים אותו בחממת התרבות מראש לאזן הבינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות תאי electroporated 2 שעות לאחר התרבות, להעביר את העוברים לצלחת פטרי 30 מ&quot;מ נקי של מדיום M2 באמצעות pastette. תמונה עובר כמו בשלב 5.9 באמצעות תרכובת הקרינה מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים חזרה לתרבות באמצעות pastette מייד לאחר הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות תאים מתים שנגרמו על ידי electroporation, להכתים את העוברים עם צבע אדום-רחוק תא קרום חדיר גרעיני (1: 200 במדיום תרבות עובר) בשעת 37 צלזיוס למשך 10 דקות 2 שעות לאחר electroporation (אופציונאלי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את תאי electroporated, לתקן את אמברימערכת הפעלה בparaformaldehyde 4% (PFA) במשך 2-4 שעות על 4 מעלות, להכתים את הגרעין עם אולטרה סגול או counterstain הגרעיני ניאון מרחיק אדום ותמונה עובר באמצעות מיקרוסקופ confocal (אופציונאלי). הערה: צמיחה העוברית מושפעת לרעה אם נותרו זמן רב מדי בPBS. לכן, ודא שהזמן שלוקח לelectroporate כל עובר ממוזער (&lt;5 דקות לכל עובר). </li></ol>

<ol>
	<li>O'Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+asthma+control+in+pediatric+patients+after+discontinuation+of+long-acting+Beta-agonists.">Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists.</a> Pulmonary med. , 894063 (2012).</li><li>Brons, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448, 191-195 (2007).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448, 196-199 (2007).</li><li>Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+differentiation+potential+of+epiblast+stem+cells+revealed+by+chimeric+embryo+formation.">In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation.</a> Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).</li><li>Sadik, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+relationship+and+optimization+of+double-pulse+electroporation.">Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation.</a> Biophys. J. 106, 801-812 (2014).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).</li><li>Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein+4+signaling+regulates+development+of+the+anterior+visceral+endoderm+in+the+mouse+embryo.">Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo.</a> Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).</li><li>Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+prepancreatic+endoderm+by+whole+embryo+electroporation.">Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation.</a> JOP. 6, 128-135 (2005).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+cell+markers+into+germ+layer+tissues+of+the+mouse+gastrula+by+whole+embryo+electroporation.">Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation.</a> Genesis. 35, 57-62 (2003).</li><li>Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-Mapping+Technique:+Targeted+Whole-Embryo+Electroporation+of+DNA+Constructs+into+the+Germ+Layers+of+Mouse+Embryos+7-7.5+Days+Post-coitum.">Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum.</a> CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893 (2007).</li><li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Nolkrantz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+single+cells+and+tissues+with+an+electrolyte-filled+capillary.">Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary.</a> Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).</li><li>Mazari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microdevice+to+locally+electroporate+embryos+with+high+efficiency+and+reduced+cell+damage.">A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage.</a> Development. 141, 2349-2359 (2014).</li><li>Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , (1990).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+the+formation+of+a+mammalian+body+plan.">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).</li><li>Wilson, V., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+and+morphogenetic+movement+in+the+late+mouse+primitive+streak.">Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak.</a> Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).</li><li>Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+progression+of+lineage+segregations+during+mammalian+embryogenesis+by+clonal+analysis.">Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis.</a> Dev Cell. 17, 365-376 (2009).</li><li>Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+in+mammalian+gastrulation:+the+ventral+node+and+notochord+are+relatively+quiescent.">Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent.</a> Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).</li><li>Tsakiridis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Wnt-driven+primitive+streak-like+populations+reflect+in+vivo+lineage+precursors.">Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors.</a> Development. 141, 1209-1221 (2014).</li><li>Gouti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+neuromesodermal+progenitors+reveals+distinct+roles+for+wnt+signalling+in+the+specification+of+spinal+cord+and+paraxial+mesoderm+identity.">In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity.</a> PLoS biology. 12, e1001937 (2014).</li><li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node.">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120, 613-620 (1994).</li></ol>

The authors have no conflicts of financial or other interest to declare.

הארכת השלב הקריטי לניסויי השתלת תאים הוא החדרת מחרוזת עקבית של תאים באופן אידיאלי בפעולה אחת, כדי למנוע התפרקות של הגוש. טכניקה זו דורשת קצת תרגול בשליטה פיפטה הפה. אם תאי תורם לשלב גם במארח, הנגזרים שלהם יתפזרו בעובר. כדי לקבוע אם נוסף נגזר תאי התורם התפזר להבחין כראוי במארח, immunostaining יכול להתבצע על חלקי העובר. אם תאי תורם אינם תואמים לסביבת המארח, הם גם לא יכולים להיות מזוהים (כפי שהם גורשו מהעובר) או ליצור גושים מאוגדים בעוברים לאחר התרבות. אם שני תאים מפוזרים וגושי תא נצפו, זה עשוי להצביע על כך יותר מדי תאים היו מורכבים ותאי תורם מוגזמים שלא יכול לקיים אינטראקציה עם תאי מארח סביב הביאו היווצרות גוש. במקרה זה, שתלי נוספים המכיליםמספר קטן יותר של תאים יכול להתבצע. המגבלה העיקרית של טכניקת השתלת תאים הוא שזה לא ניתן לקבוע את מלוא פוטנציאל in vivo של תאים מאז תרבות עכבר לשעבר vivo על פני תקופות ארוכות מ -48 שעות לא הושגו. עם זאת, אם בשילוב עם הזרקת תא מודרך אולטרסאונד, ייתכן שניתן להעביר תאים בתרבית לעוברים ברחם. לסיכום, ניסויי תא השתלה היו בשימוש נרחב בקבוצה שלנו ונתנו לנו רמזים חשובים על פוטנציאל in vivo של סוגי תאים שונים 4,21,22. זוהי טכניקה של שירות כללי להעריך את פוטנציאל in vivo של במבחנה תאים בתרבית בעוברי postimplantation המוקדמים. Electroporation למרות במחקר זה הראינו רק שזה יעיל להשתמש בטכניקת electroporation הנימים למקד epiblast, אנילא ניתן גם לכוון במכוון שכבות נבט אחרות כגון תאים האנדודרם. השלב הקריטי לטכניקת electroporation הנימים הוא למזער את הזמן שלוקח לelectroporate כל עובר (&lt;5 דקות לכל עובר) מאז PBS הוא הכי מוצלח מאוד לעוברי עכברים מוקדם. הנתונים שלנו מעל הראו כי, ברוב האזורים בעוברים, electroporation אינו משפיע על צמיחת העובר. עם זאת, electroporation בצומת גרם התפתחות לא תקינה והביא למותו בטרם עת של העובר. זה עשוי בשל נזק או מוות של התאים היוצרים מרכזי איתות חשובים 23. לפיכך, אזור זה יצטרך להימנע עם טכניקה זו. אזהרה נוספת היא ש, כאמור בסעיף התוצאות, תוך epiblast או תאי פס פרימיטיביים היו ממוקדים, כמה תאים האנדודרם היו גם electroporated. זה יכול להיות בגלל DNA מגיע להאנדודרם דרך פערים באפיתל epiblast. האנדודרם מורכב מתאי אפיתל ובניסיון שלנו היש תאים ESE נטייה גבוהה יותר כדי לקחת את ה- DNA. לכן, בעת יישום טכניקה זו למיפוי גורל, חשוב להעריך שבו תאים בתחילה לקחת את ה- DNA. צריך גם לציין שלמרות שpCAG-GFP וpCAG-Cre: פלסמידים GFP יכולים להיות מועברים בצורה יעילה באמצעות פרמטרי electroporation מוצגים במחקר זה, את היעילות של בונה DNA אחרת עשויה להיות שונה וצריך אופטימיזציה בודדת. שינויים בריכוז ה- DNA, מתח electroporation או מספר הפעימות יכולים להתבצע אם פלסמידים הם מצאו להיות קשה transfect. לסיכום, מערכת electroporation שלנו מותאמת נימים יכולה ביעילות ובreproducibly לספק GFP או Cre: פלסמידים GFP למעט מאוד תאים בעובר עם מוות של תאים מוגבלים. מאחר ושיטה זו אינה דורשת ציוד יקר או מאוד מיוחד, זה יכול להיות תועלת רבה ללימודי מעקב תא או בבדיקת ההשפעה של ביטוי חוץ רחמי או o מחיקה המותנהגני F בעוברים מוקדמים, אם electroporation מבוצעים בעוברים שנשאו אללים מוטציה מותנים floxed. לכן, טכניקת electroporation זה מספקת כלי פונקציונלי שימושי להבנה על בסיס תא-ידי תאי התפקידים של גורמי תא פנימי בהקשר של סביבות עובריות wildtype המקומי.

תרבית תאים כבר בשימוש נרחב במחקרי ביולוגיה התפתחותית. תאי גזע העובריים של עכבר (ESCs) ותאי גזע epiblast (EpiSCs) יכולים להתמיין לכל שלוש השכבות הנבט במבחנה והם מודל שימושי להתמיינות תאים בעובר יונקים המוקדם. הגזירה של שורות תאים אלה נפתחה הזדמנות למניפולציה במבחנה וחקירה מפורטת של האירועים מקומי איתות ורשתות תעתיק הפועלים בדפוסים עובריים מוקדמים. עם זאת, הוא נשאר חשוב לקבוע את הרלוונטיות vivo של כל מניפולציות שבוצעו בתרבות. פוטנציאל in vivo של ESCs עכבר נגזר עובר preimplantation כבר העריך ידי החדרת אותם בחזרה לעוברי preimplantation (morulae או blastocysts) 1. עם זאת, EpiSCs המייצגים את תאי epiblast בעוברי postimplantation לא יכול לשלב ביעילות בעוברי preimplantation 2,3. previoשלנו ממצאים הראו כי יעילות EpiSCs יכול ליצור מפלצות ולתרום לכל השכבות הנבט, כאשר מורכב לעוברי postimplantation 4. לפיכך, הדרך הטובה ביותר להעריך התאים בתרבית במבחנה היא להציג אותם לסביבתם המקבילה in vivo. Electroporation הוא שיטה נפוצה כדי לספק מולקולות אקסוגניים לתאים ממוקדים בשני in vivo ובניסויי מבחנה. אנרגיה חשמלית יכולה לייצר מספר רב של נקבוביות בקרום התא, המאפשר חומצה דאוקסיריבונוקלאית אקסוגניים (DNA) או חומצה ריבונוקלאית (RNA) כדי להזין את התאים. אחד האתגרים הגדולים ביותר עבור טכניקה זו היא לשלב כדאיות תא אופטימליות עם 5,6 יעילות הגבוה electrotransfection. Electroporation של חומצות גרעין ברקמות עובריות, מצופה זהב אלקטרודות שהנפוצות ביותר בשימוש, המאפשר מיקוד של תאים במגוון רחב מרחבי 7-9. כדי להשיג loca יותרהעברת גני lized, אלקטרודה בצורת מחט נוצלה כדי להשיג שדה חשמלי מוקדי 10,11. באמצעות שיטה זו, המחברים הראו כי לאחר electroporation, סביב 30-60 תאים לקחו את ה- DNA לבנות 11. עם זאת, נראה כי באופן מדויק התאמת מספר תאי electroporated עדיין קשה עם אלקטרודה ברוחב קבוע. טכניקת electroporation הנימים נעשתה שימוש כדי לספק פלסמידים לתאים בודדים 12-14. עם זאת, טכניקה זו לא יושמה לelectroporating פלסמידים לעוברי vivo לשעבר. לאחרונה, microdevice דווח מקומי electroporate כמה תאי דיסטלי קרביים האנדודרם (פחות מ 4 תאים) בעוברי עכבר postimplantation המוקדם 15. עם זאת, זה עדיין לא ידוע אם מכשיר זה ביעילות יכול למקד האאקטודרם והמזודרם vivo לשעבר. במחקר זה אנו מתארים שתי שיטות רומן כדי להעריך את התפקוד תאי וגנטי בהודעה המוקדמת-implantation עוברים. אנו מדגימים כיצד להשתיל ראשון במבחנה תאים בתרבית לאתרים שהוגדרו בעוברי עכברים מוקדם להעריך את הפוטנציאל שלהם in vivo. השילוב של התאים המורכבים וצאצאיהם, כל שכותרתו על ידי תג גנטי (למשל, חלבון ניאון ירוק (GFP), ניתן לבדוק עוד יותר על ידי immunostaining של חלבונים ספציפיים רקמה 4. שנית, אנו מתארים שיטה משופרת להעביר דנ&quot;א בדיוק לאתרים מקומיים בעובר דרך electroporation. במקום להשתמש באלקטרודה בצורת מחט, הכנסנו חוט דק בתוך נימי זכוכית שקצהו קנס, ולהוכיח כי שינוי זה יכול לספק DNA למספר קטן של תאים עם יעילות גבוהה ומוגבל תא מוות. יתר על כן, אנו מראים כי באמצעות נימי זכוכית בגדלים שונים פתיחה, אנחנו יכולים לשלוט על מספר תאי electroporated. לכן, אנו מאמינים בשיטה זו יכולה להיות תועלת רבה ללמוד דפוסים עובריים מוקדמים מעורבות מספרים קטנים oתאים ו.

<table><tbody><tr><td>Forceps</td><td>Dumostar</td><td>T5390</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope system with fluorescence&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope with a digital camera</td><td>Olympus</td><td>Olympus BX61</td><td></td></tr><tr><td>Inverted confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11397863</td><td></td></tr><tr><td>30mm Petri dishes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo scientific</td><td>179820&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2 medium&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes&amp;nbsp;</td><td>NICHIRYO</td><td>Nichipet</td><td></td></tr><tr><td>tips&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio One</td><td>685280</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator&amp;nbsp;</td><td>SANYO</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>Roller culture apparatus&amp;nbsp;</td><td>BTC Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters 0.45&amp;micro;m, sterile&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>non-essential amino acids (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30549.01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Gas Cartridge for Portable Meker Burner</td><td>COLEMAN&amp;nbsp;</td><td>COLEMAN 250</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>640798</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipette puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&amp;nbsp;</td><td>De Fonbrune</td><td>BS030301</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic pico pump&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Microloader tips&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 square wave pulse generator&amp;nbsp;</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Green food coloring dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C.I. 42053</td><td></td></tr><tr><td>A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye</td><td>Biotium</td><td>40060-T</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-Cre:GFP&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#13776&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#16664</td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Excel</td><td>XL830L</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators&amp;nbsp;</td><td>Leitz&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2mm diameter platinum wire&amp;nbsp;</td><td>Agar Scientific</td><td>E404-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Chicken IgY, HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2428</td><td></td></tr><tr><td>Liquid DAB+ Substrate Chromogen System&amp;nbsp;</td><td>Dako</td><td>K3467</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>A far-red fluorescence nuclear counterstain</td><td>Life Technologies</td><td>T3605</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for precisely localized transfer of cells or dna into early postimplantation mouse embryos

מניפולציה והתרבות של עוברי עכברים מוקדם היא עדיין חזקה במידה רבה בטכנולוגית שיפור הערך של מערכת מודל זה תחת שימוש. לעומת זאת, תרבית תאים כבר בשימוש נרחב במחקרי ביולוגיה התפתחותית. עם זאת, חשוב לקבוע אם במבחנה תאים בתרבית באמת מייצגים בסוגי vivo תא. השתלת תאים לעוברי, ואחריו הערכה על תרומתם בפיתוח היא שיטה שימושית כדי לקבוע את הפוטנציאל של תאים בתרבית במבחנה. במחקר זה, אנו מתארים שיטה להשתלת תאים לאתר מוגדר של עוברי עכברי postimplantation המוקדם, ואחריו תרבות לשעבר vivo. גם אנחנו מציגים את שיטת electroporation מותאמת המשתמשת בנימי זכוכית בקוטר ידוע, המאפשרת לוקליזציה והתאמה מדויקות של מספר התאים מקבלים DNA אקסוגני עם שתי יעילות transfection גבוהה ומוות של תאים נמוכים. טכניקות אלה, שאינם דורשים כל spציוד ecialized, לעבד מניפולציות ניסיוניות של gastrulation ועובר עכבר organogenesis שלב מוקדם אפשרי, ניתוח המאפשר למחויבות בתת אוכלוסיות תאים בתרבית ואת ההשפעה של מניפולציות גנטיות באתר על התמיינות תאים.

הארכת EpiSCs שכל מקום בגוף להביע EGFP (R04-GFP, נגזר מepiblast E6.5, וC2, נגזר במבחנה מmESCs) 4 היו שרוט באופן ידני ממנת התרבות ומורכבת לאתרים שונים של עוברי E7.5 (איור 2 א). העוברים היו בתרבית vivo לשעבר ונותחו לאחר 24 שעות. חלוקת תאי תורם הוערכה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אם תאי תורם התאגדו, הם התרבו ונגזרים שלהם מפוזרים בעוברי המארח (איור 2). זה נצפה כי שתלים המכילים 10-16 תאים התאגדו ביעילות בעוברי המארח (איור 2 א, ו -2), לעומת זאת, השתלת תאים נוספים לא תבאנה לchimaerism טוב יותר. במקום זאת, תאים מורכבים מיוצרים גושים מאוגדים (איור 2 ג ו 2 ד). Electroporation לssess את היעילות של מערכת electroporation שלנו, אנחנו נמסרו פלסמידים להביע GFP (pCAG-GFP וpCAG-Cre: GFP) לאתרים ספציפיים בעובר. עולה בקנה אחד עם מחקר קודם 11, תאי GFP + אותרו בעוברים 1-2 שעות לאחר electroporation (איור 2E ו2G). כאשר תאי epiblast דיסטלי בעובר בשלב מאוחר פס הפרימיטיבי היו electroporated, תאים שכותרתו תרמו להאאקטודרם העצבי לאחר 24 שעות בתרבות (איור 2E ו2F). תוצאה זו תואמת היטב מפות גורל ידועות של תאי epiblast בעוברים בgastrulation 17. באופן דומה, כאשר פלסמיד הביטוי של GFP היה electroporated בפס הפרימיטיבי בE8.5 (2-5 somites), GFP + תאים תרמו להמזודרם הפרקסיאלית (איור 2G ו2H), עולה בקנה אחד עם מפות גורל ידועות של הפס הפרימיטיבי מאוחר 18 . יתר על כן, אנו נצפו תרומה לכל שלוש שכבות הנבט מתאי electroporated (איור ט 2-K),טוען כי הליך electroporation אינו מתפשר התנהגות תא בגוף חי. עם זאת, אנחנו גם שמנו לב שתוך epiblast (E7.5) או תאי פס פרימיטיביים (E8.5) היו ממוקדים, כמה תאים האנדודרם היו גם electroporated (איור 3 ג ולוח 1). אחד היתרונות הגדולים של שימוש באלקטרודה נימים הוא כי מספר תאי electroporated יכול להיות נשלט, פשוט על ידי שינוי הקוטר של פתיחתו. כדי לקבוע את מספר תאי electroporated, עוברים היו קבועים 2 שעות לאחר electroporation וצלמו בwholemount על מיקרוסקופ confocal. מספר תאי GFP + נספר באופן ידני בZ- ערימות confocal. טבלת 1 מראה כי, לשלב נתון, להגדיל את גודל הפתיחה של נימי זכוכית 20-30 מיקרומטר תוצאות בספיגת ה- DNA על ידי יותר תאים. כאשר גודל פתיחה אחת הושווה בין השלבים (E7.5 לעומת E8.5), יותר תאים נמצאו להיות electroporated בשלב האחרון. אפקט זה יכול להיות בגלל ריכוז גבוה יותר של הווה DNA בחלל מי השפיר בE8.5. כי פתרון ה- DNA היה מעורב עם צבע המאכל הירוק, אנו יכולים להשתמש בצבע הירוק כדי להעריך את ריכוז ה- DNA בחלל מי השפיר. במיקרוסקופ, ברור כי, בהשוואה לעוברי E8.5, הצבע הירוק לאחר הזרקת ה- DNA הוא הרבה יותר קל בחלל של עוברי E7.5. למרות שאותו הריכוז של פתרון ה- DNA שהוזרק לעוברי E7.5 וE8.5, יותר פתרון ה- DNA היה בחלל מי השפיר של עוברי E8.5 כדי למלא אותו לגמרי, כי הם גדולים יותר בגודל. לאחר נסיגת מחט הזריקה, תמיד יש מידה מסוימת של דליפה של פתרון ה- DNA מהחלל מי השפיר, ומאז החור לנקב גדול בהשוואה לגודל של החלל מי השפיר בעוברים קודם לכן, סביר להניח כי לא הייתה דליפה באופן יחסי יותר מE7.5 מעוברי E8.5, שמוביל לריכוז ה- DNA נמוך יותר. המספר שונה של transfectedתאים יכולים להיות גם בגלל בקטרים ​​השונים או ספי מתח הטרנסממברני מושרה (ITV) של תאים בשלבים שונים. חסרון של electroporation הוא המוות של התאים הקשורים. בדומה לזהב המסורתי מצופה או אלקטרודות בצורת מחט, electroporation באמצעות אלקטרודה נימים גם גורם למוות של התאים. לאחר electroporation אזור המיקוד הופיע בצבע כהה בהשוואה לאזורים הסמוכות (3A ואיור 3), מצביע על כך שמידה מסוימת של מוות של תאים חייבת חלו בתחום זה. כדי לקבוע את מספר התאים מתים הנגרמים על ידי הליך electroporation נוסף, עוברים היו מוכתמים בצבע קרום-חדיר תאי ניאון גרעיני. הגרעינים של תאים מתים תויגו עם צבע פלואורסצנטי מרחיק אדום קרום חדיר. הצביעה אישרה כי טכניקת electroporation נימים זה תוצאות רק במספר קטן של תאים מתים בסמוך לאתר electroporation (איור 3D ותאble 1). שם לב שלמרות שתאים מתים מופיעים באתר electroporation, GFP תאים + ותאים מתים גם יוקרתיים ביותר מאחד לשני (איור 3E ו3F). יתר על כן, כאשר epiblast רוחב הזנב בE8.5 היה electroporated עם pCAG-GFP ופתיחת נימי זכוכית של 20μm, מספר גדול של תאי GFP + התגלה לאחר 48 שעות בתרבות (איור 3G ו3H). יחדיו, תוצאות אלה מרמזות ביותר GFP + התאים זוהו 2 שעות לאחר electroporation עדיין קיימא בתרבות נוספת. אנחנו הבקענו את המספר של ה- GFP + תאים לאחר vivo לשעבר תרבות 24 שעות. שישה עוברים electroporated עם pCAG-GFP בE7.5, באמצעות פתיחת נימים של קוטר 20μm. 107 ± 31 (ממוצע ± SD) GFP + תאים / עובר התגלו. מכיוון שבתחילתה של תרבות (2 שעות), 9 תאים electroporated על עובר לממוצע ( <s<html> טרונג&gt; לוח 1), זה מצביע על כך שתאי electroporated עברו 3-4 חטיבות בתוך 2 שעות. התא הממוצע הכפלת זמן מE7.5 לעוברי E8.5 הוא סביב 6-7 שעות בכל מלבד אלה בצומת הגחון 19,20 התאים. הדבר מצביע על כך את הליך electroporation לא לעכב צמיחת תאים נורמלית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig1.jpg" /> איור 1. תרשים המעגל מראה את התקנת electroporation. פתרון ה- DNA העובר המכיל בחלל מי השפיר שלה היה ממוקם בין שתי אלקטרודות. נוכחי בפרמטרים שנבחרו סופק על ידי גנרטור גל מרובע דופק (אספקת חשמל). מודד היה קשור בסדרה כדי לזהות את הזרם החשמלי שעובר העובר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> jove_content &quot;FO: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig2.jpg" /> איור 2. חלוקת תאים מורכבים או electroporated בעוברי מארח. שכבות (AH) הקרינה GFP (ירוק) על תמונות brightfield של עוברי wholemount (גווני אפור) () 10-16 GFP + EpiSCs היו מורכבים לאזור הדיסטלי של סוף עובר -streak שלב. (ג) גוש גדול של ה- GFP + EpiSCs היה מורכבים לאזור הדיסטלי של עובר בשלב אמצע פס-. (B ו- D) חלוקת תאי EpiSCs נגזרו (ירוקה) בעוברי המארח (מוצגת ב ו- C) לאחר 24 שעות בתרבות. (תאי B) GFP + המפוזרים בעובר המארח, המצביעים על שילוב נכון של תאי התורם. (ד) השתלת גושי תאים גדולים יותר הביאו להיווצרות גוש מאוגדת בעובר המארח. (EK) pCAG-Cre: ele פלסמיד GFP<html> ctroporated לאזורים ספציפיים של עוברי wildtype. Electroporating האזור הדיסטלי של עובר בשלב מוקדם ניצן (E) או הפס הפרימיטיבי של עובר שלב 2-5 somite (G) הביא GFP + תאים באזורים אלה 2 שעות לאחר ההליך. (F ו- H) ההפצה של ה- GFP + תאים בעוברי המארח לאחר 24 שעות בתרבות, שהראה כי תאי electroporated לתרום לneuroectoderm (החץ השחור) (F) והמזודרם הפרקסיאלית (חץ לבן) (H). (IK) immunostaining DAB לתאי GFP + מראים כי תאי electroporated יכולים להצמיח neuroectoderm (I), המזודרם (J) והאנדודרם (J ו- K) לאחר 24 שעות בתרבות. בר סולם (AH) = 250 מיקרומטר; סרגל קנה מידה (IK) = 100 מיקרומטר. הערה: איור 1 א ו -1 B הם נדפסו מהפרסום הקודם שלנו 4.href = היעד &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig3.jpg" /> (AC) pCAG-Cre הפצת 3. איור של ה- GFP תאים + ותאים מתים בעוברים לאחר electroporation: (גודל פלסמיד GFP electroporated לתוך תאי epiblast רוחב הזנב של E8.5 (שלב somite 2-5) עובר נימי פתיחה. :. 20 מיקרומטר) () 2 שעות לאחר ההליך, אזור המיקוד הראה צבע כהה (חץ לבן) בהשוואה לחלקים אחרים של העובר. הבלעה מראה הגדלה של אזור electroporated. (ב) תמונת Brightfield (גווני אפור) ועליהן ערוץ הניאון הירוק מראים את תאי electroporated (הירוקה). (ג) confocal Z-הפרוסה מראה ששני תאים האנדודרם (ירוק) גם לקחו את פלסמיד כאשר תאי epiblast רוחב הזנב היו ממוקדים. גרעין התא מוצג באדום (DF) pCAG-Cre:. פלסמיד GFP היה electroporated בהיבט הזנב של הצומת של עובר E8.5 (גודל פתיחת נימים: 30 מיקרומטר). העובר היה בתרבית לשעה 2. תאי Electroporated מוצגים בתאים ירוקים ומתים באדום. (ד) אזור electroporated מכיל שני GFP + תאים, כמו גם תאים מתים. האזור בקופסא הלבנה נותח נוסף במיקרוסקופ confocal. ספירה ידנית של Z- המחסנית הראתה כי היו 33 GFP תאים + ו -23 תאים מתים באזור זה. רק שני תאים היו חיוביים עבור שני fluorophores. (E ו- F) יכול לצפות בXYZ של Z-פרוסת confocal מהאזור בארגזים הלבן בD מראה תאי GFP + הם נפרדים מהתאים המתים. הגרעינים מוצגים בכחול (G ו- H) pCAG-Cre:. פלסמיד GFP היה electroporated לכמה celLS בepiblast רוחב הזנב של עובר E8.5 (גודל פתיחת נימים: 20 מיקרומטר) וצלם לאחר שתי (G) ו 48 שעות (H) vivo לשעבר הערה תרבות: (H) העובר נותק בשני אחרי התרבות. אזורי הראש והלב הוסרו. בר סולם (A, B, D, G ו- H) = 250 מיקרומטר; סרגל קנה מידה (C, E ו- F) = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קוטר של פתיחת צינור הנימים </td><td> שלב עובר </td><td> יעילות electroporation: לא. עוברים המכילים GFP + תאים לאחר 2h / לא מוחלט. עוברים של electroporated (לא. GFP + עוברים שהתפתחו בדרך כלל לאחר 24 או תרבות 48h) </td><td> מספר הממוצע של ה- GFP + תאים לכל עובר ± SD (n = לא. של עוברים שנבדקו) </td><td> מס &#39;שלGFP + endodermal תאים לכל עובר ± SD (n = לא. של עוברים שנבדקו) </td></tr><tr><td> 20μm </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 7/9 (7) </td><td> 9 ± 3 (n = 4) </td><td> 4 ± 2 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30μm </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 13/15 (12) </td><td> 17 ± 2 (n = 4) </td><td> 6 ± 1 (n = 4) </td></tr><tr><td> 20μm </td><td> E8.5 (2-5 somites) </td><td> 12/13 (10) </td><td> 21 ± 4 (n = 4) </td><td> 11 ± 4 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30μm </td><td> E8.5 (2-5 somites) </td><td> 2/2 (2) </td><td> 33 ו -26 (n = 2) </td><td> 14 ו -16 (n = 2) </td></tr></tbody></table> טבלת 1. יעילות Electroporation של pCAG-Cre: פלסמיד GFP בעוברי עכברים. קיצור: LS, שלב פס פרימיטיווי מאוחר; LB: שלב מאוחר ניצן. עוברים מבוימים פידאונס ו -12 דייויס

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos at JoVE.com

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

methods-for-precisely-localized-transfer-cells-or-dna-into-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Views.  School of Biological Sciences, University of Edinburgh. We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Video: Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neuroscience

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Genetics

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.

מניפולציה תת-תאית של מיקרוטובול ציטוספקלטון בעובר עכבר קדם-ההשתלה החי באמצעות פוטוסטטינים

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Biology

Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects of epigenetic alterations originated during preimplantation development on subsequent fetal development and adult health. The use of an effective and consistent embryo transfer technique is crucial to enhance the generation of genetically modified animals and to determine the effect of different treatments on implantation rates and survival to term. Embryos at the blastocyst stage are usually transferred by uterine transfer, performing a puncture in the uterine wall to introduce the embryo manipulation pipette. The orifice performed in the uterus does not close after the pipette has been withdrawn, and the embryos can outflow to the abdominal cavity due to the positive pressure of the uterus. The puncture can also produce a hemorrhage that impairs implantation, blocks the transfer pipette and may affect embryo development, especially when embryos without zona are transferred. Consequently, this technique often results in very variable and overall low embryo survival rates. Avoiding these negative effects, utero-tubal embryo transfer take advantage of the utero-tubal junction as a natural barrier that impedes embryo outflow and avoid the puncture of the uterine wall. Vasectomized males are required for obtaining pseudopregnant recipients. A technique to perform vasectomy is described as a complement to the utero-tubal embryo transfer.

Utero-tubal embryo transfer uses the utero-tubal junction as a barrier to prevent the embryo outflow that may occur when performing uterine transfer. Vasectomized males are required to obtain pseudopregnant recipients for embryo transfer. Both techniques are discussed.

העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video