המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים

זוהי שיטה חלופית וקלה לשימוש להעברת גנים מעניינים לביצים עכבר מופרות באמצעות ניקוב לייזר של זניה פלוצידה ואספקת גנים lentiviral. ניקוב בסיוע לייזר של הליך תורם העכבר עשוי להיות ישים גם ביצים מופרות של מינים אחרים להקל על כניסת סוגים אחרים של וירוסים או reagents transfection. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת כישורים מיוחדים עבור micromanipulation והזרקת מיקרו של ביצי עכבר מופרות.

הפגנת הליך בידוד ביצית עכבר מופרית תהיה Page Myers, מדען מחקר מסניף הרפואה ההשוואתית ב- NIEHS. 16 עד 24 שעות לאחר ההזדווגות, לבודד את השחלות ואת ovaducts מעכברים נקבה עם תקעים בנרתיק, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כאשר כל הרקמות נאספו, לקרוע את האמפולה של כל השחלה לגזרים, ולשחרר את הביציות המופריות, מוקף תאים cumulous, ולהעביר את הביצים בתאים cumulous לצלחת 35 מילימטר המכיל אחד x hyaluronidase במדיום M2 טרי, עבור דגירה שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר.

פיפטה את הביצים כמה פעמים כדי לשחרר את התאים cumulous, ולהעביר את הביצים לצלחת חדשה 35 מילימטר המכיל M2 בינוני, עם צינור לשטוף את האנזים. לאחר מכן, מעבירים את הביצים השטופות לתבשיל 35 מילימטר המכיל אשלגן סימפלקס ממוטב בינוני, או KSOM, ו pipette לשטוף את M2 הנותר בינוני היאלואורונידס. לאחר מכן, להעביר את הביצים 35 מילימטר רקמות תרבות מטופלים צלחות זרע עם 50 microliters של KSOM ושני מיליליטר של dimethylpolysiloxane עבור שיווי משקל של שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני וחמצן, ו 90% חנקן.

בעוד הביצים נמצאות באינקובטור, להגדיר ולכייל את לייזר XYClone, על פי המלצות היצרן. כאשר הביצים מוכנות, מניחים את צלחת הירידה הראשונה על שלב המיקרוסקופ בלייזר, וממקדים ידנית את הזונה פלוצ'ידה. לאחר אישור כי אור LED לייזר גלוי דרך המטרה, להזיז את שלב המיקרוסקופ כדי למקד את zona עם לייזר LED, ולהשתמש בתוכנת המחשב כדי להגדיר את לייזר XYClone ל 250 מיקרו שניות.

התאימו את גודל תאורת ה-LED לממדים המתאימים, וניקוב הזונה פלוצ'ידה של כל ביצה שלוש פעמים באמצעות הלייזר כדי לייצר שלושה חורים של 10 מיקרומטר. זה קריטי לבצע את הניקוב במהירות, אבל בזהירות, כמו ביצים מופרות לא יכול לשמור מחוץ החממה במשך יותר מ 15 דקות. לאחר מכן, להחזיר את הביצים מחוררות לאנקובטור במשך שעתיים נוספות.

בסוף הדגירה השנייה, לטפל טיפת KSOM 50 microliter עם שני microliters של lentivirus מרוכז ללא ערבוב. ולהחזיר את הביצים לאנקובטור לארבעה ימים. כאשר הביצים התפתחו לתוך blastocysts, להשתמש במכשיר העברת עוברים שאינם כירורגיים, להפקיד כ 10-15 עוברים על שני microliters של KSOM.

17 ימים לאחר העברת העובר, לאפשר לעכבר בהריון ללדת באופן טבעי או לאסוף את הנידון על ידי ניתוח קיסרי לפי הצורך. לאחר מכן, לאסוף רקמה מן הגורים עבור genotyping, כדי לקבוע את קצב הטרנסגנזה. ניתן לבדוק מדי יום פיתוח ביציות מבודדות ומופרי עכבר תחת המיקרוסקופ.

60 עד 70% מהעוברים הבריאים והבלתי מטופלים מתפתחים לבסטוציסט בתוך שלושה עד ארבעה ימים. בעוד שכ-47% מהעוברים מחוררים בלייזר ומתומרים מתפתחים לבולסטוציסטים, 85% מהם מבטאים את הגן המקוצר של העניין. מכוון את הלייזר כדי לדלל את zona, במקום ליצור חור, מאפשר לעוברים המתפתחים ליהנות שלם, אנקפסולציה zona pellucida תוך שמירה מתירנית כדי טרנסדוקציה lentiviral.

התמרה עם lentivirus רקומביננטי, הבעת copepod GFP ממקדם הארכה 1A גורם אינטגרציות lentiviral מרובים, וביטוי גבוה של GFP תחת מנורת LED כחולה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי בעוד היכולת של lentiviruses להשתלב בגנום המארח עושה אותם כלי רב עוצמה עבור אספקת גנים יציבה, אבל אינטגרציה אקראית עשויה גם להציג מוטציות הכנסה. טכניקה זו יכולה לאפשר לחוקרים בתחום הגנטיקה לפתח במהירות מודלים מהונדסים של בעלי חיים לחקר מחלות לייצור חלבון איבו, או למחקרי גנים תפקודיים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה על דגימות רקמה מבודדות של גורים מתומרים כדי לענות על שאלות נוספות על המיקום והיקף ביטוי הגנים ברקמות שונות של עניין. אל תשכח כי עבודה עם lentiviruses יכול להיות מסוכן מאוד. לכן אנא בצע את ההנחיות המוסדיות שלך לעבודה עם lentiviruses.

ללבוש בגדי מגן אישיים לטהר את כל הפסולת לפני סילוק.