המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי חיל האוויר Office של מחקר המדעי בסיסי היוזמה גרנט FA9550-12-1-0464.

<ol>
	<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties.">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).</li><li>Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+bimolecular+protein-lipid+membranes+in+aqueous+solution.">Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution.</a> Nature. , (1966).</li><li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Bilayer+Formation+by+Contacting+Monolayers+in+a+Microfluidic+Device+for+Membrane+Protein+Analysis.">Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis.</a> ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).</li><li>Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+bionetworks+from+nanoliter+water+droplets.">Functional bionetworks from nanoliter water droplets.</a> J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Maglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+networks+with+incorporated+protein+diodes+show+collective+properties.">Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties.</a> Nat Nano. 4, 437-440 (2009).</li><li>Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+formation+between+lipid-encased+hydrogels+contained+in+solid+substrates.">Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates.</a> ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+attachment+method+for+reconstituting+lipid+bilayers+of+prescribed+size+within+flexible+substrates.">Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates.</a> ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-based+biomolecular+smart+materials.">Membrane-based biomolecular smart materials.</a> SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+virtual+ground+to+control+transmembrane+voltages+and+measure+bilayer+currents+in+serial+arrays+of+droplet+interface+bilayers.">The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers.</a> SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-inspired+electroactive+polymer+materials+incorporating+biomolecular+materials.">Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials.</a> SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Bayley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayers.">Droplet interface bilayers.</a> MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+torus+surrounding+planar+lipid+bilayer+membranes.">Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes.</a> BIOPHYS J. 12, 432 (1972).</li><li>Tien, H. T., Ottova, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+bilayer+concept+and+its+experimental+realization:+from+soap+bubbles,+kitchen+sink,+to+bilayer+lipid+membranes.">The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes.</a> J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).</li><li>Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+prokaryotic+mechanosensitive+channels.">Gating prokaryotic mechanosensitive channels.</a> NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).</li><li>Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+channels+in+microbes.">Mechanosensitive channels in microbes.</a> ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+census+of+mechanosensitive+channels+in+living+bacteria.">Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria.</a> PLoS ONE. 7, e33077 (2012).</li><li>Levina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+Escherichia+coli+cells+against+extreme+turgor+by+activation+of+MscS+and+MscL+mechanosensitive+channels:+identification+of+genes+required+for+MscS+activity.">Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity.</a> The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).</li><li>Chiang, C. -. S., Anishkin, A., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+the+large+mechanosensitive+channel+in+situ:+estimation+of+the+spatial+scale+of+the+transition+from+channel+population+responses.">Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses.</a> BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).</li><li>Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+reveal+expanded+intermediate+states+and+a+sequential+action+of+two+gates+in+MscL.">Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).</li><li>Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetic+and+Spatial+Parameters+for+Gating+of+the+Bacterial+Large+Conductance+Mechanosensitive+Channel,+MscL.">Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).</li><li>Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+investigation+of+MscL+gating+using+experimental+data+and+coarse+grained+MD+simulations.">Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations.</a> PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).</li><li>Kubalski, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. , (2005).</li><li>Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis:+a+gated+mechanosensitive+ion+channel.">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li><li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+prokaryotic+mechanosensitive+channels+MscL+and+MscS.">Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS.</a> Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).</li><li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+models+of+the+MscL+gating+mechanism.">Structural models of the MscL gating mechanism.</a> BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).</li><li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels.">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li><li>Betanzos, M., Chiang, C. -. S., Guy, H. R., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+iris-like+expansion+of+a+mechanosensitive+channel+protein+induced+by+membrane+tension.">A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension.</a> NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).</li><li>Corry, B., Jayatilaka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+structure,+orientation,+and+energy+transfer+between+AlexaFluor+molecules+attached+to+MscL.">Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL.</a> BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+FRET+Reveals+Pore+Size+and+Opening+Mechanism+of+MscL.">Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL.</a> eLife. 3, e01834 (2014).</li><li>Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydration+properties+of+mechanosensitive+channel+pores+define+the+energetics+of+gating.">Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating.</a> J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).</li><li>Ko&#231;er, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+voltage-gated+ion+channel+model+inferred+from+the+crystal+structure+of+alamethicin+at+1.5-&#8491;+resolution.">A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-&#8491; resolution.</a> Nature. 300, 325-330 (1982).</li><li>Iwamoto, M., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+Bubble+Bilayers+with+Flush+Drainage.">Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Barriga, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayer+reconstitution+and+activity+measurement+of+the+mechanosensitive+channel+of+large+conductance+from+Escherichia+coli.">Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli.</a> J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

Mechanosensation מציין אחד מן המסלולים ההעברה החושיות הראשונות שהתפתחו ביצורים חיים. שימוש בתופעה זו ללימוד והבנה של מאפייני mechano-החשמלי של DIB, הוא צעד חיוני לחומרי גירויים מגיבים פונקציונליים. היא כרוכה בהתאגדות והפעלה של ערוץ mechanosensitive, MscL, בDIB כמתמר mechanoelectrical ומד לחץ כדי לזהות עליית מתח בממשק bilayer השומנים. בנימה אחרת, הפונקציה של ערוצי MS יכולה להיות מוסדרת באמצעות תכונות חומר הבסיסיות של bilayers שומנים כוללים עובי, עקמומיות פנימית, ודחיסות. לאור הנ&quot;ל, הטכניקה מבוססת micropipette מספקת כלי רב ערך המאפשר לחוקר את היכולת ללמוד ערוצי MS בדיבס ומספק תובנות לתוך המבנה של bilayer השומנים, כמו גם את אינטראקציות שומנים החלבון. במהלך שלוש עשר השנים האחרונותים, תיקון מהדק היה השיטה העיקרית ללמוד ערוצי MS, שכן הוא מאפשר הידוק של שני מתח ומתח. עם זאת, תיקון מהדק דורש ציוד יקר ולא מתאים למזעור, רכוש הנדרש להנדסה של מכשירים חושיים והמרה. דיבס בשל הפשטות, היציבות, והקומפקטיות שלהם לייצג סביבה מתאימה ללמוד את הפעילות של MscL. כאן, אנו מרחיבים התקדמות קודמת בטכניקות היווצרות DIB ידי מציע טכניקה מבוססת micropipette, עם היכולת לשלוט על הגודל של טיפות וממשק bilayer, את ההרכב הכימי של כל אגל, והמתח בממשק באמצעות גירוי דינמי. הטכניקה מורכבת של עיגון טיפות מימיות, המכיל proteoliposomes, לטיפים של coaxially מנוגדים נימי זכוכית. הטיפות ממוקמות באמבט של ממס אורגני וכאשר הביאו במגע צורות bilayer שומנים בממשק. Micropipettes מחובר לעממתנדים iezoelectric, המאפשרים תזוזה אופקית של הטיפות. דינמי דחיסת הטיפות, תוצאות בעלייה של מתח interfacial בממשק שמן מים ולכן עלייה במתח bilayer. שני היבטים מרכזיים להבחין בשיטה זו מטכניקת bilayer בועת קשר דומה ושפורסם לאחרונה (CBB) 37. שימוש בטכניקה שהוצגה במסמך זה, בגודל של bilayer נשלט באמצעות micromanipulators וכך הכרכים של הטיפות יישארו קבועים, שלא כמו בשיטת CBB. בנוסף, טכניקת CBB קוראת למשאבות לחץ, שאין צורך בשיטה שהוצגה במאמר זה עושה את זה פשוט יותר וקל יותר לבנות. אנו מסוגלים לשלב ולעורר MscL חיידקים בפעם הראשונה ללא שימוש בפיפטה תיקון או שינויים כימיים 38. מאז המערכת מאפשרת היווצרות קרום bilayer שומנים סימטרי חזק, זה מחקה את l הדוק יותרסימטריה איזה נר צריך לשים נמצאה בקרומים ביולוגיים. זה מאפשר לנו לחקור את ההשפעות של הרכב קרום מבוקר או חוסר סימטריה בפעילות של MscL. בנוסף, באמצעות טכניקות עיבוד תמונה, בשיטה זו מסייעת להעריך את המתח בממשק bilayer. טכניקה זו מסייעת בהבנת העקרונות של מרה הדדית בין כוחות בתפזורת והמשטח בDIB, מאפשר מדידות של נכסי קרום בסיסיים, ומשפר את ההבנה של תגובת MscL קרום מתח. למרות ששיטה זו לוקחת צעד אחד קרוב יותר לכיוון מערכת חומר גירויים מגיבים biomolecular וסביבה פיזיולוגית השונה ללמוד MscL, יש מגבלות למערכת. מתח במערכת זו לא יכול להיות מהודק בשל נוכחותם של מאגר השומנים בצורה של יפוזומים בכל אגל, שנוטה להקל על מתח בממשק שמן / מים. לכן, בערוצי mechanosensitive הנוכחיים יכול להיות מגורהבדיבס רק במשטר דינמי. הנוכחות של בועות אוויר במערכת משפיעה באופן משמעותי את הדיוק ושחזור של הניסויים. בועות האוויר הנוכחיות בהידרוג&#39;ל יכולות לגרום הפסד, אם חיבור חשמלי. בעוד אנו מתארים את השימוש בשיטה המבוססת מיקרו-פיפטה לגירוי של MscL, הטכניקה יכולה לשמש כדי לחקור סוגים אחרים של ערוצי טרשת נפוצה ויש לו הפוטנציאל להיות בשימוש על ידי חוקרים ללמוד מגוון רחב של מולקולות ביולוגיות. לדוגמא, הגדרה דומה כבר בשימוש במעבדה שלנו כדי ללמוד את תגובת mechanoelectrical של קרום bilayer ממשק טיפה חינם ערוץ. חלבונים שונים יכולים להיות מחדש ומופעלים באמצעות התקנה מבוקרת מאוד זה, לוקחים בחשבון שסביבות הכינון מחדש של כל biomolecule להשתנות. השיטה המתוארת במאמר זה נוגעת בפוטנציאל יישום משמעותי רחב יותר שמוגבל רק לדמיונו של החוקר.

בעשור האחרון, ההרכבה של bilayers שומנים המלאכותי כבר התקדמה באופן משמעותי באמצעות הפיתוח של שיטת bilayer ממשק טיפה. ידוע כיציב ואיתן, דיבס כפה את עצמם כמערכות מודל חלופיות לקלסיים הצבועים (Mueller) וbilayers המקופלת מישוריים (Montal-מולר) 1. למרות שהרעיון של שימוש בטיפין כדי ליצור bilayers שומנים שתחילתה 1960 2, לא זכה לפופולריות עד לאחרונה. הניסיון המוצלח הראשון שדווח על ידי קבוצת Takeushi 3, ואחריו כמה מחקרים מדגימים היווצרות bilayer באמצעות רשת של טיפות על ידי קבוצת ביילי 4-6. לאחרונה, טכניקות אנקפסולציה הוצעו על ידי קבוצת ליאו 7-9, שהיה חלוצות הרעיון של שימוש דיבס כאבני בניין של מערכות חומר לרומן גירויים מגיבים 10. במחקרים קודמים, דיבס הוכיח את היכולת שלהם להגיב לחשמלי 9,11, כימיגירויי iCal 10,12, ואופטיים 13. ביו-תרכובות שונות עם פונקציות גירויים מגיבים שונות כבר עוררו ביעילות כאשר מחדש בDIB 10,14. לאור ניסיונות המוצלחים אלה שאלה חשובה היא הרים: יכולות להגיב לגירוי מכאני DIB כאשר מולקולות ביולוגיות מתאימות משולבות? הכוחות הפועלים על interfacial DIB שונים מאלה ב15,16 מערכת bilayer האחר. לכן, את המתח בbilayer מוחזק על ידי הטיפות יכולים להיות נשלט על ידי ויסות מתח בממשקים-שמן-מים שומנים; מושג אינו ישים במערכות bilayer הצבועות או מקופלות. ערוצי MscL, ידועים כשסתומי שחרור osmolyte ואלמנטים בסיסיים של קרום cytoplasmic חיידקים, מגיבים למתח קרום עלה 17,18. במקרה של זעזועים תת-אוסמוטי, מספר ערוצים המתגוררים בקרום של תא קטן 19 יכול ליצור masתגובת חדירות sive לשחרר במהירות יונים ומולקולות קטנות, חיסכון בחיידקים מתמוגה 20. Biophysically, MscL הוא למד היטב ומתאפיין בעיקר באמצעות טכניקת מהדק התיקון הבולט 21-23. מודלים מבניים אמין מסבירים 24,25 מנגנון gating של MscL מוצעים מבוססים על המבנה של homolog גביש 26,27, דוגמנות 28, ותוצאות של ניסויים נרחבים 24,29-31. תחת מתח מיושם ב~ 10 MN / מ &#39;, הערוץ הסגור אשר מורכב מחבילה הדוקה של סלילים הטרנסממברני, הופך לטבעת של סלילים מוטים מאוד להרכיב נקבובית מלא מים ~ 28 Å מוליך 21,24,32. כמו כן, נקבע כי הידרופוביות של השער ההדוק, ממוקמת בצומת של תחומים TM1 הפנימיים, קובעת את סף ההפעלה של הערוץ 33. במקביל, נמצא כי על ידי הפחתת הידרופוביות של השער, tensioסף n יכול להיות הוריד 22. מאפיין זה של MscL התאפשר העיצוב של שסתומי שליטה שונים 34, בעיקר למטרות משלוח סמים. לכל המאפיינים הנ&quot;ל ומבוסס על תפקידה הבסיסי של תרגום מתחים מוגזמים קרום תא לפעילות אלקטרו, MscL עושה כושר נהדר כמתמר mechanoelectrical בדיבס. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מבוססת micropipette מקורי כדי ליצור דיבס ולמדוד את הפעילות של ערוצי MscL התאגדו תחת גירוי מכאני. אנו מדווחים לראשונה, התגובה של דיבס לגירוי מכאני והכינון מחדש הפונקציונלי של המוטציה V23T נמוך הסף של MscL בדיבס 35. המערכת הניסיונית מורכבת של טיפות מימיות שומנים עטופים המעוגנות לטיפים של שני micropipettes הזכוכית בורוסיליקט היריב. כאשר טיפות מובאות במגע ממשק bilayer שומנים הוא FOrmed. טכניקה זו מציעה שליטה על ההרכב הכימי וגודל של כל אגל (בתפזורת), כמו גם את הממדים של ממשק bilayer. בנוסף, קרומים סימטריים עם קומפוזיציות שומנים שונות בכל עלון יכולים להיווצר בקלות. יש אחד של micropipettes המצורף למפעיל פיזואלקטריים הרמוני, מספק את היכולת ליישם חד מחזור מתוכנתים מראש או גירוי oscillatory. מתח מועבר אל הקרום המלאכותי באמצעות הדחיסה של שני הטיפות התומכות בו. כתוצאה מעיוות אגל, תחומי עלייה-שמן-מים שומנים ממשקים, ובו זמנית הזווית בין הטיפות יורד, גורמים לעלייה במתח קרום והפעלת MscL חולפת. באמצעות ניתוח של הצורות של הטיפות בעיוות, יכול להיות מוערך המתח שנוצר בממשק. למרות ההתמקדות במאמר זה היא על מאפייני mechano-התמרה של DIB, אנחנו גם להדגיש כי סוגים אחרים של ביומולקולות, כגון alamethicin, יכולות להיות מופעלות על ידי פלטפורמה רב תפקודית זו. אנו מציגים כאן, את כל ההיבטים הטכניים של הכנה, הרכבה, ומדידות בשיטה חדשה זו באופן צעד-אחר-צעד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MscL, ערוץ מוליכות גדולות mechanosensitive (MSC), הוא שסתום שחרור osmolyte בכל מקום שמסייע חיידקים לשרוד זעזועים תת-האוסמוטי פתאומיים. זה כבר גילה וקפדנות למד באמצעות טכניקת תיקון מהדק לכמעט שלושה עשורים. תפקידה הבסיסי של תרגום מתח להחיל את קרום התא לתגובת חדירות עושה אותו למועמד חזק לתפקד כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular מבוסס קרום מלאכותיים. משמש כאבני בניין למכשירים כאלה, bilayers ממשק אגל (דיבס) יכולה לשמש כפלטפורמה חדשה להתאגדות והגירוי של ערוצי MscL. כאן, אנו מתארים שיטה מבוססת micropipette כדי ליצור דיבס ולמדוד את הפעילות של ערוצי MscL התאגדו. שיטה זו מורכבת של טיפות מימיות-עטוף שומנים מעוגנים לטיפים של שני micropipettes היריב (מיקום coaxially) הזכוכית בורוסיליקט. כאשר טיפות מובאות במגע, ממשק bilayer שומנים הואנוצר. טכניקה זו מציעה שליטה על ההרכב הכימי ואת הגודל של כל טיפה, כמו גם ממדים של ממשק bilayer. יש אחד של micropipettes המצורף למפעיל פיזואלקטריים הרמוני מספק את היכולת לספק גירוי oscillatory רצויה. באמצעות ניתוח של הצורות של הטיפות בעיוות, ניתן לאמוד את המתח שנוצר בממשק. שימוש בטכניקה זו, הפעילות הראשונה של ערוצי MscL במערכת DIB מדווחת. מלבד ערוצי MS, פעילויות מסוגים אחרים של ערוצים ניתן ללמוד באמצעות שיטה זו, המוכיחות את הרב-פונקציונלי של פלטפורמה זו. השיטה שהוצגה כאן מאפשרת מדידה של נכסי קרום בסיסי, מספקת שליטה רבה יותר על היווצרות קרום סימטרי וא-סימטרי, והיא דרך חלופית כדי לעורר וללמוד ערוצי mechanosensitive.

איורים 1 ו -2 תצוגת ההתקנה וציוד ניסיוניות משמש להקלטת פעילות חלבון במהלך הגירוי המכני של קרום bilayer השומנים. כדי למזער את הרעש חשמלי למדידות שלנו, תחנת העבודה ממוקמת בתוך כלוב פאראדיי תוצרת מעבדה, מקורקע להארקה בAxoPatch 200 B מגבר. היווצרות של bilayer שומנים בידוד יציב היא צעד מפתח במחקר זה. בהסדר זה, monolayer שומנים המרכיב בממשק שמן / מים של הטיפות מימיות שקועים באמבט של ממס אורגני. כאשר טיפות ממוקמות במגע, עודפי שמן מתבטל, וmonolayers השומנים היריב דק לbilayer שומנים עבה שתי מולקולות. הטכניקה הנפוצה ביותר בשימוש באפיון bilayer היא מתח מהדק. עם מתח מהדק, המתח על פני bilayer נשמר ערך קבוע בזמן הנוכחי נמדד. איור 4 </stronז&gt; מציג הקלטה נוכחית בזמן אמת אופיינית להיווצרות bilayer הראשונית. ידיעת הקיבול הספציפי (~ 0.6 μF / 2 סנטימטר) 5 של bilayer השומנים DPhPC, האזור של bilayer נוצר יכול להיות מחושב. אזור bilayer יכול להיות נשלט על ידי שינוי המיקום של הטיפות (איור 4 א). באמצעות המפעיל פיזואלקטריים, סוגים שונים של צורות גל (סינוסי, מרובע, משולש, וכו &#39;.) בתדרים, אמפליטודות, ומחזורי החובה שונים יכולים להיות מיושמים על הטיפות לאופקיות וaxially להתנדנד ובכך, מתח bilayer ואזור אפשר לשנות (איור 4). כאשר DIB מגורה באופן מכאני, תוך שמירה על פוטנציאל למתח קבוע על פני הקרום, המוטציה V23T נמוך סף (להשיג של פונקציה) של MscL יוצרת פעילויות אמינות כוללים מדינות בעיקר תת-מוליך ואירועי פתיחה מלאים מדי פעם (איור 5) . EV אלהמציג זהה לאלה שנרשמו בטכניקת תיקון- clamp מקרומים פנימיים E. coli ויפוזומים מחדש עם V23T המטוהר MscL. התוצאות באיור 5 להוכיח gating המתרחש בתגובה לעלייה במתח, שכן כל הקוצים הנוכחיים הם נצפו בדחיסת השיא. בדחיסת שיא, הרחבת האזוריויות היחסית של הטיפות היא מקסימלי, ולכן, מתח בממשק הוא מקסימאלי. Alamethicin, ערוץ יון מתח מגודרת ואחד מהפפטידים הנחקרים ביותר, מגביר את חדירות קרום כאשר מתח DC מוחל על פני הקרום 36. היכולת של ממשק bilayer השומנים לארח חלבונים הטרנסממברני ופפטידים גם היא נבדקה על ידי ביצוע הקלטות הנוכחיות gating מתח באמצעות alamethicin פפטיד. Alamethicin מעורבב עם פתרון פוספוליפידים לריכוז סופי של מיליליטר / 100 ng. איור 6 מציג את מדידות זרם תחת<html> מהדק מתח (115 mV). הטיפות בניסוי זה נקרע לגזרים על מנת להשיג ממשק קטן bilayer והתנגדות כך גבוהה וקיבול קטן יותר. Gating ההתנהגות של הפפטיד Alamethicin מוצגת דרך השלבים של הנוכחי (איור 6) הבדידים. היסטוגרמה בצד ימין של העלילה מציגה את השינויים במוליכות מרמת הבסיס (.0962 NS), שהוא בעצם רמת המוליכות הראשונה של הערוץ עצמו. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> איור 1:. סכמטית המתארים את החלקים העיקריים וממדים של מאגר נפט מאגר הנפט מיוצר במכונה החנות באוניברסיטת וירג&#39;יניה טק. הוא מורכב מצינור אקריליק גלילי מכונה דבוקה אל פני השטח של גיליון אקריליק. ניתן לשנות את הממדים והעיצוב כדי להתאים ליישומים שונים או יותר משני micropipettes.&quot;Target =&quot; _ /53362/53362fig1large.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> איור 2:. ניסיון התקנה וmicropipettes הכנה () תחנת העבודה סטנדרטית ליצירה, מכאני גירוי, ואפיון הממשק bilayers כוללת מיקרוסקופ, מניפולטורים 3-ציר, מצלמה דיגיטלית, מתנד פיזואלקטריים, שולחן בידוד רעידות, וכלוב פאראדיי (לא מוצג). (ב) הגדרת הניסוי מורכבת משני micropipettes הידרוג&#39;ל מולא PEG-DMA המנוגדים אופקי ממוקם בתוך אמבט של שמן hexadecane. כל אחד מmicropipettes מכיל אלקטרודה Ag / AgCl לספק חיבור חשמלי. Micropipette שלישי מלא בproteoliposome פתרון משמש כדי ליצור את הטיפות בקצה micropipettes האחר. (ג) בתגובה הנוכחית DIB יכולה להימדדבאמצעות שילוב של נתוני מערכת רכישת הרעש הנמוך המגבר והתיקון. (ד) סגר את התמונה המציגה את הטיפות מימיות נוצרו בקצה micropipettes. אלקטרודות (E) Ag / AgCl נעשות על ידי טבילת קצה שני 250 מיקרומטר חוטי כסף באקונומיקה. אז אלקטרודות מוזנות באמצעות שתי נימי הזכוכית בורוסיליקט מלאות בהידרוג&#39;ל PEG-DMA, שהוא נרפא עם אור UV כדי לחזק. בעל microelectrode ישר עם מחבר זכר משמש לחיבור אחד של micropipettes לheadstage של מגבר התיקון. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> איור 3:. תמונות הממחישות את היווצרות bilayers ממשק אגל () micropipette 10 מיקרומטר מלאים proteoliposomes ממוקם מתחת למיקרוסקופ בסמוך לטיפי micropipette. באמצעות מזרק מחובר לmicropipette, לוותר נפחים קטניםשל proteoliposomes ליצירת טיפות כדוריות לעצמה רצויה. בואו טופס monolayer כך שהוא מאפשר את הטיפות לשבת במשך עשר דקות. להביא את הטיפות במגע; bilayer יהווה לאחר כל השמן בממשק מתבטל. (ב) בעוד bilayer נוצר, ההרכב הכימי בשני הצדדים של הממשק יכול להיות נשלט על ידי הזרקת כימיקלים רצויים באמצעות micropipette מיקרו בגודל. (ג) הטיפות ברגע של המגע הראשון. (ד) כאשר טיפות bilayer השומנים נוצר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> איור 4: מדידות בזמן אמת להראות שני דילול הראשוני וההרחבה הבאה של הממשק נוכחי () נמדד במהלך היווצרות bilayer באמצעות היישום של פוטנציאל חשמלי משולש.. גודל הנוכחי נמדד הוא ביחס ישר לנפחים<html> tance, ובכך האזור של ממשק bilayer. קרוב הטיפות הם הביאו יחד, גדולים יותר באזור של להיפך הממשק וסגן. (ב) במועד היישום של עירור מכאני, האזור של העליות וירידות ממשק bilayer באותה התדירות כמו אות המגרה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> איור 5:. מדידות בזמן אמת להראות את התגובה של bilayer לעירור מכאני, כמו גם gating של המוטציה V23T של MscL הצורה של התגובה הנוכחית היא סינוסי, המתייחס לשינוי בסינוסי קיבול bilayer כתוצאה מ שינוי אזור bilayer. הקוצים הנוכחיים, המתרחשים בשיאו של כל מחזור, מצביעים gating תת-מוליכות של המוטציה V23T. עלילת קוטב נוספת מצביעה על כך שgating מתרחש בדחיסת שיא, המשקפת עלייה במתח בממשק bilayer. &gt; <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig6.jpg" /> איור 6:. מדידות נוכחית תחת מהדק מתח והיסטוגרמה מקביל רמות מוליכות לפעילות gating ערוצי Alamethicin התאגדו gating ההתנהגות של הפפטיד Alamethicin מוצג דרך גידול הצעד חכם הבדיד בנוכחי. רמות המוליכות להתאים היטב עם מדידות קודמות שבוצעו על ידי קבוצת המחקר שלנו באוניברסיטת וירג&#39;יניה טק 7.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

ערוצי mechanosensitive חיידקים יכולים לשמש כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular. bilayers אגל הממשק (דיבס), אבני בניין בהשראת תא למכשירים כאלה, מייצג פלטפורמות חדשות לשלב ולעורר ערוצי mechanosensitive. הנה, אנחנו מדגימים שיטה מבוססת micropipette חדש של יוצרי דיבס, המאפשר הלימוד של ערוצי mechanosensitive תחת גירוי מכאני.

רב תכליתיים, Micropipette מבוסס שיטה להתאגדות וגירוי של ערוצים בקטריאלי Mechanosensitive יון בbilayers ממשק אגל

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

multifunctional-micropipette-based-method-for-incorporation

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Views.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  ערוצי mechanosensitive חיידקים יכולים לשמש כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular. bilayers אגל הממשק (דיבס), אבני בניין בהשראת תא למכשירים כאלה, מייצג פלטפורמות חדשות לשלב ולעורר ערוצי mechanosensitive. הנה, אנחנו מדגימים שיטה מבוססת micropipette חדש של יוצרי דיבס, המאפשר ?...

Video: Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...