המחברים רוצים להכיר ד&quot;ר יצחק Zambrano והעובדים בבנק בית החולים עין מנצ&#39;סטר העיניים לאספקה ​​של רקמת העין תורם אנושי, ומר פיט ווקר מהפקולטה למדעי החיים מתקן היסטולוגיה לתמונות H &amp; E המוכתמות. תודה מיוחדת למר רוג&#39;ר Meadows על עזרתו עם מיקרוסקופ. SJC הוא נמען של מועצה למחקר רפואי (MRC) פיתוח קריירה מלגה (MR / K024418 / 1) והמחברים גם להכיר מימון מחקר האחרון אחרים מMRC (G0900538 וK004441), להילחם עבור Sight (1866) והחברה מקולרי.

רקמת העין אנושית הסכימה למטרות מחקר התקבלה מבנק מנצ&#39;סטר רויאל בית החולים לעיניים העיניים לאחר הסרת הקרנית להשתלה. השימוש ברקמות אנושיות למחקר היה בהתאם לחוק אדם רקמות (2004) הנחיות, ובאישור ועדת אתיקה למחקר באוניברסיטה (אסמכתא 11,305). 1. העשרה של ממברנה של כל הפריטים ברוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את סביבת העבודה מסביב ומתחת למיקרוסקופ לנתח עם חומר חיטוי 1% (V / V) ולאחר מכן לנגב עם 70% (V / V) אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא הבאים ליד: אזמל חדש חד פעמי, שני מגרדי סטרילי תא (נפוצה בתרבית רקמה) ושלושה זוגות של פינצטה (מופיעים כאן כ, B, ו- C, ראה רשימת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גלובוס עין לצלחת פטרי, חד פעמית, שמירה על המכסה לשימוש מאוחר יותר. באמצעות אזמל חד פעמי חדש, להסיר כל עצב ראייה שייר, שעלול להפריע ליצירת מו שטוחUNT של הרקמה. בשלב הבא, לעשות ארבעה חתכים באופן שווה במרווחים ליצור ארבעה רביעים, אם ימשיכו לחלק 3 (העשרה של הקרום של קולרים ברוך) לא לחתוך את אזור המקולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהחתכים להאריך דרך כל העומק של רקמות העין - מרשתית נוירו הפנימית ביותר (NSR), דרך דמית העין ולובן עין (הלבן של העין). המשך החתך כל הדרך עגולה העיניים משולי עיינית לעצב הראייה. זה יאפשר עיינית שהשתטחה (ראה איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק ברבע אחד של עיינית שטוחה באמצעות פינצטה (כדי למנוע ניתוק דמית העין), להשתמש בפינצטה B הגדול יותר לאחיזת NSR הזגוגית והבסיסי ולמשוך רקמה זו מאפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתחיל בפריפריה, נע לכיוון המרכז של עיינית פתחה ולאחר מכן לצד שכנגד. בדרך כלל, אבל לא תמיד הן הזגוגית וNSR לנתק כאחד. השתמש בscalpel לבלו כל NSR שייר עגן בדיסק האופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, תוך החזקה ברבע אחד של רקמה במקום באמצעות פינצטה, להשתמש במגרד תא סטרילי כדי לסלק בעדינות monolayer הרשתית מהמשטח הפנימי השלם של עיינית. תאים אלה בקלות לנתק וניתן לראות גושים חומים-פיגמנט כהים. לשטוף עם PBS לשטוף בעדינות תאי הרשתית וחילצה מן עיינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להשתמש בפינצטה כדי לקלף בעדינות את הרקמה שמעליה אדום הכהה (הכוללת גם הקרום של ברוך ודמה עין) מכל 4 הרביעים עין. הנח את הרקמה נכרת לתוך צלחת נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בקצה המשוטח של מגרד תא אחד להחזיק את הרקמה נכרתה במקום, להשתמש במגרד השני כדי לגרד את הרקמה בעדינות. הפעל את הרקמה שוב ולחזור, הסרת כמה שיותר חומר עודף ככל האפשר. סופו של דבר, קרום שקוף יישאר: זה הוא הקרום של ברוך גס המועשר. השימוש במיקרוסקופ לנתח במינימום של הגדלת 20X הואחיוני בסיוע להסרת דמית העין וההעשרה של קרומו של ברוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, לשטוף בקצרה קרום של ברוך עם מים ultrapure כדי להסיר דמית העין ודם שייר לפני הצבת הקרום לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את הקרום המועשר של ברוך בכ 1 מיליליטר מים ultrapure ובקצרה מערבולת (כ -15 שניות) כדי לעזור lyse כל עניין סלולארי זיהום (ראה איור 2). צנטריפוגה המדגם XG ב 500 במשך 30 שניות לגלולת הקרום ולשאוב את supernatant. הערה: הקרום של ברוך המועשר שנותר עכשיו הוא מוכן לsolubilization (כפי שתואר בסעיף 2 להלן) או אחסון ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 2. solubilization של ניתוח ממברנה והמערבי כתם של כל הפריטים מועשר ברוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ חלבון מהקרום של ברוך מועשר על ידי טבילה ברקמת 500 μl 8 M urEA במשך 6 שעות ב RT ב 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות solubilized צנטריפוגה ב 10,000 XG במשך 10 דקות כדי גלולה כל עניין תאי שנותר. הסר את supernatant ולהעביר אותו ל3,500 קרום הדיאליזה דה MWCO, ואז למקם את מדגם בL 1 של PBS לdialyse במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, להוסיף 40 μl של חרוזים בידוד חלבון, ולסובב מדגם / תערובת חרוז (20 סל&quot;ד במערבל מסתובב) ב RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 10,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה חרוזים. הסר supernatant וsolubilize חלבון קשור לחרוזים בμl 30 2x מאגר טעינת מדגם (65.8 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3% (w / v) גליצרול, bromophenol 0.01% כחולים, 3% β-mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואז צנטריפוגות ב10,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה חרוזים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את supernatant המכיל את החלבונים שפורסמו על טרומי SDS-ג&#39;ל שיפוע דף (ראה רשימת חומרים) להפרדת חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו להקות חלבון מופרדות באמצעות פרוטוקול נפוץ צביעה, למשל, Coomassie כחול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקיצור, להוסיף 20 מיליליטר של הכתם הכחול המבריק (0.1% כחולים מבריק (w / v), מתנול 50%, 10% חומצה אצטית קרחונית, 40% מים) לג&#39;ל, ודגירה במשך 30 דקות ב RT עם תסיסה עדינה . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הפתרון מכתים ולשטוף את הג&#39;ל מוכתם במים ללא יונים עד מכתים רקע מצטמצם במידה מספקת כדי לאפשר הדמיה להקת חלבון מוכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, העברה מופרדת להקות חלבון לnitrocellulose לניתוח מערבי, כפי שתתואר להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה מופרדת להקות חלבון על קרום nitrocellulose ב 80 מילי-אמפר לשעה 2.5 באמצעות מנגנון semidry העברה במאגר העברה (25 מ&quot;מ טריס, 192 מ&quot;מ גליצין, 10% [v / v] מתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה 10 מיליליטר PBS, 10% (w / v) חלב, ושל 0.02% (w / v) BSA במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס לפני הבנוסף דואר של הנוגדנים הראשוניים הרצויים לגילוי חלבון. הערה: כדוגמא כאן, איור 3 ג תערוכות immunoblot נציג של הקרום של ברוך solubilised משלושה תורמים נפרדים חקר לרגולטור של המפל המשלים, חלבון גורם כמו H-1 (FHL-1). </li></ol> 3. העשרה של ממברנה של קולרים ברוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הפעולות 1.1-1.3 כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד NSR הוא עדיין במקום, לאתר את colouration foveal הצהוב שמייצג את אזור המקולה המרכזי (ראה איור 4). באמצעות אגרוף ביופסיה 6 מ&quot;מ סטרילי, למקם אותו מעל אזור foveal ותקיפות חתך למקולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על הביופסיה במקום, לעשות חתך נפרד עם אזמל מקצה עיינית לקצה להב ביופסיה, ולאחר מכן באמצעות פינצטה B, לקלף את חומר עין מסביב כדי להשיג ביופסיה נקייה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות C פינצטה, להסירדיסק 6 מ&quot;מ של רקמה מהאגרוף והמקום על מכסה צלחת פטרי הנקי. מניחים את המכסה צלחת פטרי ואגרוף מקולרי תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את תקליטור NSR הדק (לבדוק מכתים foveal צהוב להסיק דיוק של ביופסיה). השתמש מגרד תא סטרילי כדי להסיר בעדינות את תאי הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הדיסק מקולרי באמצעות לובן העין באמצעות הטיפים של פינצטה, ולקלף לאט דמית העין ומורכבת הקרום של ברוך השתמשתי פינצטה ג שוב, להשתמש במגרד התא להסיר דמית העין לא רצויה ועניין דם מקרומו של ברוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום הקרום של הקולרים ברוך לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהשעות במי ultrapure 1 מיליליטר. בקצרה וורטקס (כ -15 שניות) כדי לעזור lyse כל עניין סלולארי זיהום. צנטריפוגה המדגם XG ב 500 במשך 30 שניות לגלולת הקרום ולשאוב את supernatant. הערה: הקרום של ברוך המועשר המבודדים מהמקולה כעת ניתן להשתמש לproteomicalysis באמצעות פרוטוקולי העיכול המועדפים של המשתמש. </li></ol>

<ol>
	<li>Coleman, H. R., Chan, C. -. C., Ferris, F. L., Chew, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> Lancet. 372, 1835-1845 (2008).</li><li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Glob Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li><li>Coleman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+age-related+macular+degeneration+on+vision-specific+quality+of+life:+Follow-up+from+the+10-year+and+15-year+visits+of+the+study+of+osteoporotic+fractures.">Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures.</a> Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+haplotype+in+the+complement+regulatory+gene+factor+H+(HF1/CFH)+predisposes+individuals+to+age-related+macular+degeneration.">A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (20), 7227-7232 (2005).</li><li>Klein, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+polymorphism+in+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 385-389 (2005).</li><li>Haines, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+variant+increases+the+risk+of+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 419-421 (2005).</li><li>Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+polymorphism+and+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 421-424 (2005).</li><li>Fritsche, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+new+loci+associated+with+age-related+macular+degeneration.">Seven new loci associated with age-related macular degeneration.</a> Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).</li><li>Clark, S., Bishop, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Factor+H+and+Related+Proteins+in+Regulating+Complement+Activation+in+the+Macula,+and+Relevance+to+Age-Related+Macular+Degeneration.">Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration.</a> J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).</li><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+Bruch&#8217;s+membrane.">The dynamic nature of Bruch&#8217;s membrane.</a> Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).</li><li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+factor+H-like+protein+1+as+the+predominant+complement+regulator+in+Bruch&#8217;s+membrane:+implications+for+age-related+macular+degeneration.">Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch&#8217;s membrane: implications for age-related macular degeneration.</a> J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).</li><li>Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+complement+control+protein+factor+H+(beta+1+H).">Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H).</a> Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).</li><li>Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+amino+acid+sequence+of+human+complement+factor+H.">The complete amino acid sequence of human complement factor H.</a> Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).</li><li>Moore, D. J., Clover, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+age+on+the+macromolecular+permeability+of+human+Bruch&#8217;s+membrane.">The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch&#8217;s membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

כאן אנו מתארים את ההעשרה של הקרום של ברוך לניתוח נוסף המאפשר ניתוחים שלאחר מכן, כולל מערבי סופג 11, ספקטרומטר מסה ומאפייני דיפוזיה של הקרום של ברוך ניצול שונה Ussing תאי 11,14. שלבים קריטיים כוללים) הגירוד והשטיפה היסודי של פני השטח הפנימיים של העין כדי להסיר את כל תאי הרשתית ב) גירוד חזר וזהיר של דמית העין הבסיסית ללא גרימתו של ברוך להתפורר וג) שטיפת ברוך נכרת של במי ultrapure כדי להבטיח תמוגה של תאי שיורי. יתר על כן, אם הקרום של ברוך המועשר הוא להיות מנוצל לניתוח proteomic, מיצוי חלבון על ידי טיפול אוריאה הוא יעיל ביותר בפירוק רקמה גמישה זה בהשוואה לשיטות אחרות כגון homogenisation המכני. היסטולוגיה של הקרום של ברוך מועשר מציינת ECM של choriocapillaris לא הוסר. זה להיות לשעברpected כשכבת החיצונית של הקרום של pentilaminar ברוך נוצר על ידי קרומי מרתף תא האנדותל choriocapillaris. ואכן זה יכול להיות יתרון שECM של choriocapillaris נותר שינויים להתרחש בזה בAMD כוללים התצהיר של מורכב השלמה מסוף התקפה מורכבת / קרום (MAC) 15. יש לציין כי לניתוח היסטולוגית מפורט של קרומו של ברוך, המבנה שלה יהיה טוב יותר אם נשמר מחולק בנוכחות לובן העין, דמית העין, וקרומו של ברוך. ואכן, היסטולוגיה מוצגת באיור 2 נועדה אך ורק כדי להדגים את מידת ההעשרה כתוצאה מהטכניקה שתוארה בכתב היד הזה. העשרה ברוך של קולרים דורשת נתיחה זהירה של עיינית, להבטיח כי NSR ובמיוחד הגומה אינם פגומות; אחרת הזדהות ובכך בידוד של המקולה אינה אפשריות. שלמות tissuדואר הוא גם חשוב לתהליך זה ולכן מומלץ שתשמשנה דגימות תחת זמן שלאחר המוות 48 שעות. מידת ההעשרה הנדרשת משתנה בין תורמים ויכולה להיות מושפעת מגיל תורם, זמן שלאחר מוות, והנוכחות של כל פתולוגיה עין. השימוש במונח המועשר הוא מכוון בהכרת הגבלה של הטכניקה, זה להיות ש&#39;טיהור &#39;או&#39; בידוד &#39;של הקרום של ברוך השתמשתי בשיטה זו פשוט אינה אפשרית. ואכן, בהתחשב בכך שECM של choriocapillaris מתמזג הקרום של ברוך שם הפרדה מוחלטת היא לא ריאלי. הבנת השינויים ביוכימיים של רקמות העין בהתאמה חיונית בהבנת התקדמות מחלת עיניים. העשרה ייחודית זה של קרומו של ברוך, מסייעת להבנה זו; מחקרים מתמשכים חוקרים proteome של הקרום של ברוך מקולרי מועשרות באמצעות ספקטרומטר מסה בשלבים שונים של AMDובדגימות שמקורן בנושאים עם גנוטיפים שונים כדי לשפר את ההבנה של פתולוגיה המולקולרית של AMD. כבר הטכניקה המתוארת כאן נעשתה שימוש כדי לזהות בהצלחה FHL-1 כרגולטור השלמה הבולט במחקרי הקרום 11 ועוד של ברוך על קרומו של ברוך מועשרות עשויים לגרום ליותר תובנות חדשות פתולוגיה המולקולרית של AMD.

השימוש בנתיחה שלאחר מות רקמות העין אנושית במחקר עיניים הוא מקור רב ערך להבנה של הפתוגנזה מחלת עיניים. ניתוח עיני תורם אנושיים תרם תרומות חשובות להבחנת המנגנונים שבבסיס ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), המהווה את הגורם המוביל לעיוורון בעולם המערבי 1. בעולם, AMD מהווה כ 8.7% מכל העיוורון ועם הזדקנות אוכלוסייה יותר ויותר, זה צפוי להשפיע 196 מיליון אנשים על ידי תוצאות 2,020 2. AMD באובדן הראייה מרכזית ויש לו השפעה עמוקה על עצמאות ואיכות החיים מטופל 3. AMD מוקדם מאופיין בהיווצרות של דרוזן וזה יכול להתקדם לניוון גיאוגרפי (המכונה לעתים AMD &#39;היבש&#39;), או ניאו-וסקולריזציה choroidal (המכונה גם neovascular או &quot;רטוב&quot; AMD). בעוד אנטי VEGF זריקות יכולות לייצב או לשפר את הראייה באני זה AMD neovascularזה לא מרפא, וכיום, אין טיפול קיים לניוון גיאוגרפי. בעוד ריאנטים גנטיים מסוימים הוכחו לשנות סיכון AMD 4 - 8, פחות ידוע על איך גרסאות אלה משפיעות על המקולה ברמה ביוכימית. אתר חשוב בפתוגנזה של AMD הוא קרומו של ברוך. טופס דרוזן בתוך המבנה הזה ומחקרים שונים סיפק ראיות להפעלה משלימות ובסביב הקרום של ברוך ב9 AMD. הקרום של ברוך הוא גיליון של מטריקס שמפריד בין תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מדמו העין, ועומד על כ 4 מיקרומטר עבה. הקרום של ברוך מתמזג choriocapillaris, שכבה דמית העין שמכילה נימים וחיצוניות לזה fenestrated שכבות המכילות כלי דם גדולים יותר 10 (איור 1 א). הקרום של ברוך הוא גיליון pentilaminar של נוסףמטריצה ​​סלולרית (ECM), ומתודולוגיה זו מפרטים כיצד לבודד קרומו של ברוך, יחד עם ECM של choriocapillaris הבסיס (להלן מכונים מועשרים קרומו של ברוך), שהוא במידה רבה decellularized וחופשי מתאי דם אדומים. הקרום של ברוך מועשר שמש לאחר מכן לניסויים סופג והיסטולוגיה מערביים. יתר על כן, המתודולוגיה להעשרת הקרום של ברוך אך ורק מאזור המקולה של העין מתוארת, אשר יהיו בעלי עניין מיוחד לאלה חוקרים את ההיבטים ביוכימיים של AMD.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auxillary objective 0.5x</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>3638</td>
			<td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 6mm</td>
			<td>Oncall Medical Supplies</td>
			<td>SCH-33-36</td>
			<td>6mm Biopsy Punches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td>For membrane enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyroPure Cyrovials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12387999</td>
			<td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>0153</td>
			<td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(A) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4280</td>
			<td>(A) Fine (100mm) and straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4272</td>
			<td>(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4323</td>
			<td>(C) Straight fine points</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GXCAM 5 digital colour camera &#38; GT-Vision software</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>90mm, used as a dish for samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>5595</td>
			<td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

ניוון מקולרי (AMD) הקשורות לגיל הוא גורם מוביל לפגיעה בראייה בעולם המפותח. המחלה באה לידי ביטוי על ידי ההרס של מרכז הרשתית, הנקרא המקולה, וכתוצאה מכך אובדן הראייה מרכזית. AMD מוקדם מאופיין על ידי הנוכחות של נגעים קטנים, צהבהבים הנקראים דרוזן הרך שיכול להתקדם על AMD מאוחר כגון ניוון גיאוגרפי (יבש AMD) או neovascularisation (AMD הרטוב). למרות השינויים הקליניים מתוארים היטב, וההבנה של השפעות גנטיות על הענקת סיכון AMD מקבלים יותר ויותר מפורטת, אזור אחד חסר התקדמות עיקרית הוא הבנה של ההשלכות של סיכון גנטי ביוכימיים. זה נובע בחלקו קשיים בהבנת הביוכימיה של קרומו של ברוך, מטריקס דק מאוד שפועל כמסנן ביולוגי של חומר מאספקת הדם ופיגום שעליו monolayer תא אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתגורר. דרוזן וORM בתוך הקרום של ברוך ונוכחותם מפריע לזרימה תזונתית לתאי הרשתית. רק על ידי חקירת הרכב החלבון של קרומו של ברוך, ואכן כמה חלבונים אחרים אינטראקציה עם זה, יכול חוקרים מקווים לפענח את המנגנונים ביוכימיים בבסיס היווצרות דרוזן, פיתוח של AMD ואובדן ראייה שלאחר מכן. מאמר זה מפרט שיטות להעשרת או קרום של כל ברוך, או רק מאזור המקולה, כך שהוא יכול לשמש לאנליזה ביוכימית במורד הזרם, ולספק דוגמאות כיצד זה כבר משנה את ההבנה של הביוכימיה קרומו של ברוך.

הפרוטוקול שתואר לעיל לתוצרת מועשר תוצאות הקרום של ברוך בבידוד של קרומו של ברוך, ECM של choriocapillaris ומסיר את רוב התאים / הפסולת הסלולרית כולל כל הרשתית (איור 2). הכביסה של הקרום של ברוך המועשרת במים היא צעד מפתח בlysing כל תאי choroidal שנותרו. הלחץ המופעל במבטל של דמית העין מופיע קומפקטי חלק מכמה גרעיני תאים שנותרו לאזור המוגדר כקרום של ברוך (איור 2). Solubilisation של הקרום של ברוך מועשר מאפשר ניתוח במורד הזרם של תכולת החלבון שלו. ההפרדה של להקות חלבון מsolubilised מועשרים הקרום של ברוך השתמשתי 4 - 12% ג&#39;ל SDS-PAGE שיפוע, ואילו לא שימושי בזכות עצמו לזהות את תכולת חלבון, עושה להדגים את היכולת של טכניקה זו כדי למזער חלבוני דם זיהום שarלא במיוחד קשורים (איור 3) דואר. בהקשר זה, נפקד בולט אחד מריצת ג&#39;ל החלבון היא להקה גדולה למדי של אלבומין בסרום אדם (~ 66 KDA) שאחרת עשויה להפוך סופג יותר קשה לפרש מערבי הבא: הניתוח היסטולוגית של הקרום של ברוך מועשרות שמוצג באיור 2 תומכים גם ב זֶה. ואכן, כחלק מהעבודה מתואר בעבר 11, solubilised הקרום של ברוך מסדרה של תורמים פרטיים נבדקו למספר החלבונים באמצעות נוגדנים ספציפיים באמצעות מערבי סופג (איור 3 ג). במקרה שמוצג כאן, נוגדנים (המכונים OX23) 12 מכוונים נגד רגולטור kDa 155 של חסינות מולדת, H גורם משלים שנקרא (FH), שימש והפגינו הנוכחות של להקת משקל מולקולרית נמוכה בדגימות הקרום של ברוך משלוש נפרדים תורמים (איור 3 ג). זה התברר לאחר מכן להיות חלבון כמו H-1 גורם (FHL-1), חלבון 49 kDa הקשורים לFH ונובע מוריאצית אחוי של אותו הגן 13. FHL-1 נראה נוכחי רגולטור משלים העיקרי בקרום של ברוך 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> איור 1. Dissection של העין האנושית וההעשרה של ממברנה של ברוך. () הקרום של ברוך הוא מחסום מטריקס. דמית העין מכילה שכבה של נימי fenestrated שברציפות למזג לתוך הקרום של ברוך (בשם choriocapillaris) ואלה להפריד את שאר דמית העין (המכילים כלי דם גדולים) מאפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) monolayer תא, אשר מבחינה פיזיולוגית תומך בתאי קולטי האור של רשתית נוירו (NSR). (ב) ארבעה חתכים לעיינית האדם עשויים שמאפשרים לו להיפתח ליצירת הר שטוח.זגוגי ניתן להסיר בשימוש בפינצטה. NSR עשוי לרדת יחד עם הזגוגית אך ניתן גם להסיר עם פינצטה. מגרד תא משמש להסרת שכבת תאי הרשתית מהקרום של ברוך בזמן שהוא עדיין מעוגן לדמה העין ולובן עין. מורכב קרום / דמית העין של ברוך ניתן התקלף מלובן העין ובאמצעות מגרד תא חדש, ניתן להסיר דמית העין החיצונית. לשטוף סופי במי ultrapure lyses כל עניין סלולארי שנותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> איור 2. היסטולוגיה של ממברנה של ברוך והחלקים דמית העין. H &amp; E המוכתמות לפני () ואחרי (B) גירוד מבני choroidal החיצוניים מהקרום של ברוך והשטיפה בwa ultrapureter ליצור מועשר קרומו של ברוך. ברים סולם מייצגים 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> איור 3. Solubilisation של ממברנה של מועשרת ברוך לניתוח תוכן חלבון. חלבון () ניתן לחלץ מהקרום של ברוך מועשר על ידי דוגרים ב 8 M אוריאה ל6 שעות ב RT, לפני שdialysed נגד PBS. לניתוח מערבי, חלבונים מכל dialysate הקרום של ברוך יכולים להיות מבודדים באמצעות חרוזים בידוד החלבון וeluted ידי רותח עם Laemmli צמצום מאגר טעינת מדגם. (ב) נציג Coomassie הכחול מוכתם ג&#39;ל SDS-PAGE, מראה שני מסודרים ומדולל solubilised הקרום של ברוך (ע) באמצעות השיטה ד. Escribed ב() כתם מערבי נציג של הקרום של ברוך solubilised מ 3 תורמים פרטיים (C) (נתיבי 1 - 3). חקר לחלבון גורם כמו H-1 (FHL-1) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> איור 4. בידוד של ממברנה של מועשרת ברוך מהמקולה. אזור המקולה של הרשתית הוא אזור 5 מ&quot;מ שיכול להיות מזוהה בקלות על ידי colouration הצהוב של הגומה שמעליה, וקרבתה לדיסק האופטי הסמוך. שימוש בגומה כמדריך, מקום ביופסית 6 מ&quot;מ בעין האנושית רכובה שטוחה לבלו גוש רקמת המקולה 6 מ&quot;מ. הסר את NSR שמעליה ולגרד את תאי הרשתית מהמקולה נכרת. מורכב קרום / דמית העין של ברוך שנותר יכולn להיות התקלף מלובן העין וגירד ביסודיות כדי להסיר דמית העין, lyse נותר חומר תאי על ידי טבילה במי ultrapure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes at JoVE.com

Enrichment of Bruch&#039;s Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

העשרה של ממברנה של ברוך מעיני אדם תורמות

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

enrichment-of-bruch-s-membrane-from-human-donor-eyes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

11.9K Views.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Video: Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

, בידוד והעשרה, ותחזוקה של גזע תאים מדולובלסטומה

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

ממברנה דיי הדמיה אפשרית של ventromedial היפותלמוס נוירונים מעכברים בוגרים ללמוד גלוקוז חישה

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

תורם גזירת תרבויות Leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular pressure (IOP) which&#160;can identify various pathogenic paradigms related to the glaucoma pathogenesis. Ex vivo human anterior segment perfusion organ culture models have previously been successfully utilized and applied as effective technologies for the discovery of glaucoma pathogenesis and testing of therapeutics. Preclinical drug screening and research performed on ex vivo human organ systems can be more translatable to clinical research. This article describes in detail the generation and operation of a novel ex vivo human translaminar pressure model called the translaminar autonomous system (TAS). The TAS model can independently regulate ICP and IOP using human donor posterior segments. The model allows for studying pathogenesis in a preclinical manner. It can reduce the use of living animals in ophthalmic research. In contrast to in vitro experimental models, optic nerve head (ONH) tissue structure, complexity, and integrity can also be maintained within the ex vivo TAS model.

We describe and detail the use of the translaminar autonomous system. This system utilizes the human posterior segment to independently regulate the pressure inside the segment (intraocular) and surrounding the optic nerve (intracranial) to generate a translaminar pressure gradient that mimics features of glaucomatous optic neuropathy.

מודל מערכת אוטונומית טרנסלמינארית לאפנולציה של לחץ תוך עיני ותוך גולגולתי במקטעים האחוריים של התורם האנושי

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

הדמיה מולטימודאלית מבוססת OCT של עיני תורם אנושי עבור מחקר AMD

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging could add prognostic value to laboratory findings. In this work, ex vivo OCT and MMI were applied to human donor eyes prior to retinal tissue sectioning. The eyes were recovered from non-diabetic white donors aged &#8805;80 years old, with a death-to-preservation time (DtoP) of &#8804;6 h. The globes were recovered on-site, scored with an 18 mm trephine to facilitate cornea removal, and immersed in buffered 4% paraformaldehyde. Color fundus images were acquired after anterior segment removal with a dissecting scope and an SLR camera using trans-, epi-, and flash illumination at three magnifications. The globes were placed in a buffer within a custom-designed chamber with a 60 diopter lens. They were imaged with spectral domain OCT (30&#176; macula cube, 30 &#181;m spacing, averaging = 25), near-infrared reflectance, 488 nm autofluorescence, and 787 nm autofluorescence. The AMD eyes showed a change in the retinal pigment epithelium (RPE), with drusen or subretinal drusenoid deposits (SDDs), with or without neovascularization, and without evidence of other causes. Between June 2016 and September 2017, 94 right eyes and 90 left eyes were recovered (DtoP: 3.9 &plusmn; 1.0 h). Of the 184 eyes, 40.2% had AMD, including early intermediate (22.8%), atrophic (7.6%), and neovascular (9.8%) AMD, and 39.7% had unremarkable maculas. Drusen, SDDs, hyper-reflective foci, atrophy, and fibrovascular scars were identified using OCT. Artifacts included tissue opacification, detachments (bacillary, retinal, RPE, choroidal), foveal cystic change, an undulating RPE, and mechanical damage. To guide the cryo-sectioning, OCT volumes were used to find the fovea and optic nerve head landmarks and specific pathologies. The ex vivo volumes were registered with the in vivo volumes by selecting the reference function for eye tracking. The ex vivo visibility of the pathology seen in vivo depends on the preservation quality. Within 16 months, 75 rapid DtoP donor eyes at all stages of AMD were recovered and staged using clinical MMI methods.

מחבר זרקור: Ex Vivo OCT מבוסס הדמיה מולטימודאלית של עיני תורם אנושי למחקר על ניוון מקולרי תלוי גיל  

Laboratory assays can leverage prognostic value from the longitudinal optical coherence tomography (OCT)-based multimodal imaging of age-related macular degeneration (AMD). Human donor eyes with and without AMD are imaged using OCT, color, near-infrared reflectance scanning laser ophthalmoscopy, and autofluorescence at two excitation wavelengths prior to tissue sectioning.

אקס ויוו הדמיה מולטימודאלית מבוססת OCT של עיני תורם אנושיות למחקר על ניוון מקולרי תלוי גיל

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...