Bu çalışma R01MH097949 hibe Ninh tarafından desteklenen ve Otizm bwl ve Norris Pamuk Kanser Merkezi Optik Görüntüleme Paylaşılan Enstrümantasyon Grant P30CA023108 Pilot Grant 7359 konuşur.

Etik Beyanı: Tüm protokoller Dartmouth Kurumsal Biyogüvenlik ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi inceleme kurulları tarafından onaylandı. CRISPR / Cas9 Retrovirus için bir kılavuz Strand (sgRNA) Tasarımı 1. Protokol NOT: (https://benchling.com/ ve http://crispr.mit.edu/) ilgilenilen geni hedef sgRNAlardır oluşturmak için kullanılabilecek birçok kar amacı gütmeyen web siteleri vardır. Bu protokolün amacı, tasarım ve birbirlerine tavlanır ticari bir satıcıdan tek sarmallı oligos sipariş etmektir. Bu tavlanmış oligo PXL transfer vektörüne lige olacaktır. Benchling kullanarak tasarım sgRNAlardır bir örnek için ek bir video 1 Bkz. <ol><li> sgRNAlardır tasarlamaya adamıştır bir web sitesini kullanın. NOT: Örneğin, sitenize entegre ilgilenilen genin başlangıcından yakın bir kodlama / egzonik dizisi giren 20 nükleotid sgRNA üretecektir. duyu ve anti-duyu oligo tasarım 20 nükleotid sgRNA dizisini kullanınsgRNA oluşturmak için sipariş edilecektir s. </li><li> sgRNA oluşturduktan sonra, bir kelime işlemci içine bu diziyi kopyalayın. Zaten bir (yani, G-20 nükleotid sgRNA dizisi) ile başlayan yoksa belgedeki 20 nükleotid sgRNA dizisinin başlangıcına kadar bir G (guanin) ekleyin. Bu U6 organizatörü kapalı iyi transkripsiyonu sağlamak için gereklidir. </li><li> Bu şimdi 20-21 nükleotid dizisinin ters tamamlayıcı belgeler. Sens oligo için, doküman (örneğin, OAKK-G-20 nükleotid sgRNA sekansı) dizisinin 5 &#39;ucuna &quot;OAKK&quot; ekleyin. Bu çıkıntı PXL vektörüne sekansı bağlanması için kullanılır. </li><li> antisens oligo için, 5 &#39;ucuna ürün karması için AAAC ekleyin. PXL vektörüne sekansını ligate etmek Bu çıkıntı kullanın. </li><li> sens ve antisens oligos edinin. oligos aldıktan sonra, DNAse ücretsiz su kullanarak 100 uM stokları yapmak. 4 mikron ile birlikte 10 ul 100 mcM sens ve antisens oligo her karıştırın10x NEB tamponu 2 ve su 16 ul l. NOT: (BBSI çıkıntılar uyumlu olmayan yapışkan uçları gibi) Bunlar sayfa saflaştırma veya 5&#39;phosphorylation gerekmez. <ol><li> daha sonra, bir köpük &quot;Şamandıra&quot; tutucu Bu karışımını içeren tüp şamandıra, 500 ml&#39;lik bir beher içinde, bir kaynama noktasına 200 ml su getirin. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile 95 ° C arasında yavaşça soğuk su izin verin. </li><li> steril su içinde 1.000 aşağıdaki ligasyon içerisinde hemen kullanmak veya -20 ° C de geriye kalan reaksiyon depolamak: Şu anda tavlanmış-oligo karışımı 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Özet pxl, 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de BBSI kısıtlama enzimi ile PX330 vektörü türevi. pxl 2 ug, Bbs1 ve denge su 10x NEB tamponu 2, 1 ul 4 ul ihtiva eden bir 40 ul reaksiyon kullanın. ticari bir kit kullanılarak, rutin jel saflaştırma ile sindirilmiş-pxl Konu. verim 8.5 kB ürün ~ olduğundan emin olun. </li><li> 1000: Bir ticari ligasyon kiti kullanılarak, 1 1 ul Artersindirilir ve jel saflaştırılır-pxl 50 ng ile tavlanmış-oligo. E. yoksun yetkili rekombinasyon içine ligasyon ürünü Dönüşümü E. coli (NEB 5-alfa, klonlama verimlilik). plazmid DNA&#39;smm, dizilişiyle doğru kılavuz varlığı için transformantların koruyucu. </li><li> BstB1 ve Pac1 kısıtlama enzimleri kullanılarak pxl üzerinden U6, kılavuz teli, ve RNA iskele elemanları (sgRNA) sindirmek ve aynı kısıtlama enzimleri ile sindirilmiş floresan protein-T2A-Cas9 viral omurgasına ligate. ligasyon ürünü (NEB 5-alfa maksimum verimlilik) Transform. floresan protein-T2A-Cas9 viral omurga plazmid düşük kopya plazmid ve böylece düşük kopya protokoller kullanılmalıdır. Not: İkinci bir sgRNA Benzer bir pxl kılavuz şerit plazmid Pacl sindirimi ile kişiye ve Pac1 lige edilebilir sindirilen ve dana bağırsak fosfatazı önce ilk kılavuz teli ihtiva eden viral omurga işlemden geçirildi. Viral aktarım plazmid fosfataz tedavisi yardımcı olurikinci bir kılavuzun içermeyen plazmitler kendi kendine bağlanmasını gelen transformantların sayısını azaltır. </li><li> Sıra Nucleobond Xtra maxi hazırlık kiti kullanılarak nihai plazmid ve maksi hazırlık doğrulamak ve şu &quot;Retro / lentiviral Üretim Protokolü - CaPO4 Metodu&quot; kullanılarak bir virüs içine paket. </li></ol> 2. Transfeksiyon için 293FT / 293GP Hücreleri hazırlayın (Retro / lentiviral Üretim - CaPO4 Yöntemi) <ol><li> (Gün 1) hızla 37 ° C su banyosu içinde 10 cm hücre kültürü plakasının her hücre 1 şişe çözülme. lentiviral ambalaj için 293FT hücreleri kullanır. retroviral ambalaj için 293GP (gag / pol) hücreleri kullanın. </li><li> 15 ml konik bir tüp içine cryo tüpten çözülmüş hücrelerinin her pipet ve önceden ısıtılmış CO2 dengelenmiş tamamlama Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı 2 ml. </li><li> 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje hücreler pelet. Süpernatantı aspire ve tam mı 10 ml hücre peletKoy adlı Dulbecco&#39;nun Orta Modifiye. 10 cm hücre kültürü çanak üzerine hücreleri Plate. % 5 karbon dioksit kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe hücreleri. </li><li> (Gün 2) kaplama 24 saat sonra, mevcut medya aspirasyon ve plaka önceden ısıtılmış Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı, 10 ml ilave edilerek plaka ortamı değiştirmek. <ol><li> 24-48 saat medya değişiminden sonra ve hücrelerin bir kez (Gün 3-4), birleşik haline / plaka (10 cm plaka) 2.5-3.0 x 10 6 hücre birleştirilmek üzere hücreleri bölme. </li><li> Hücreleri bölmek için, medya aspire ve PBS 5 ml ile plaka yıkayın. levhaya% 0.25 tripsin 1 ml ilave edilir ve hücreler, plaka duruma gelinceye kadar 37 ° C&#39;de inkübe edin. % 0.25 tripsin reaksiyon nötralize etmek ve 1.5 ml tüp içine hücreleri pipet Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı, 0.5 ml ilave edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri dönerler. Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı, 1 ml hücrelerin tekrar. 10 seyreltin81; PBS 90 ul hücre l. Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Tam Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı ile yeniden plaka 2.5-3.0 x 10 6 hücre / levha. NOT: Hücreler kaplama sonrası% 50 konfluent 24-34 saat ~ olacaktır. onlar ~% 50 konfluent olduğunda hücreleri transfekte. </li></ol></li></ol> 3. (Gün 5) CaPO4 Transfeksiyon ve Viral Parçacık Koleksiyonu <ol><li> Mevcut ortamı aspire ve önceden ısıtılmış Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı, 10 ml ekleyerek, transfeksiyondan önce ortam 2 saat değiştirin. 10 cm plaka medya 10 ml tam olduğundan emin olun. </li><li> 2, 5 ml&#39;lik yuvarlak dipli polistiren tüpler kullanılarak 2 yemekleri için transfeksiyon reaktifleri hazırlayın. İlk tüp &quot;DNA&quot; ve ikinci tüp &quot;2X HBS&quot; etiketleyin. pH 7.4&#39;te Tris-EDTA / ul 1 | ig DNA konsantrasyonu ayarlayın. <ol><li> lentivirüsler, yavaş yavaş transfer vektörü 20 ul (vira ekleyinÇevrede l yapısı), CMVdelta8.9 13 ul, VSV-G 9 ul, moleküler biyoloji sınıf H2O 860 ul ve ilk boru ( &quot;DNA&quot;), 2.5 M CaCI2, 100 ul, sürekli çekme sırasında tüp karıştırın. </li><li> retrovirüslerin için CMVdelta8.9 plazmid ihmal. &quot;DNA&quot;, etiketli bir tüpe 20 ul transfer vektörü, 15 ul, VSV-G, 860 ul Molecular Biology Grade H2O ve 100 ul 2.5 M CaCI2 ekleyin. </li><li> 2x HEPES tamponlu tuz 1 ml ekleyin (pH 7,0; bu pH değeri kesinlikle önemlidir) &quot;2X HBS&quot; etiketli tüpe. </li><li> Yavaşça, &quot;2X HBS&quot; tüp bir defada bir damla &quot;DNA&quot; tüp 1 ml içeriğini ekleyin. &quot;DNA&quot; tüp içeriği eklerken sürekli olarak dizin veya orta parmakla &quot;2X HBS&quot; tüp dokunun. Her damla sonra ortaya CaPO4 veziküller gözlemleyin. Oda sıcaklığında, 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe tüpü. </li></ol></li><li> gece boyunca, 37 ° C inkübe edilir, her biri 10 cm hücre plakasına yavaş damlalar halinde transfeksiyon 1 ml ilave edilir. </li><li> (Gün 6) Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı +% 0.5 FBS 8 ml ve 40 mg kafein / 100 mi ortam ile değiştirin. transfer vektörü bir flüoresan işaretleyici içeriyorsa, florofor sentezleme başarılı bir transfeksiyon gösterir. </li><li> (Gün 7) 10 mi serolojik pipet kullanılarak viral partikülleri ihtiva eden ortam toplamak ve 50 ml konik bir tüp içine dağıtın. 4 ° C&#39;de 50 ml konik tüp saklayın. Her plaka için% 0.5 FBS ortamı 8 ml ekleyin. <ol><li> (Gün 8) Yine, viral partikülleri içeren medya toplamak ve 50 ml konik tüp önceki günkü hasat ile birleştirir. </li></ol></li></ol> 4. Yoğunlaşma ve Virüs saflaştırılması <ol><li> 2 O GKD&#39;li% 40 polietilen glikol 6000 ve 1.5 M NaCI eklenerek 5x polietilen glikol 6000 çözeltisi yapmak üzerinde çözüm Otoklav121 ° C &#39;de 45 dakika süre ile, sıvı döngüsü. soğutma sırasında yavaş yavaş çözeltiye karıştırılır. NOT: Çözelti bulutlu başlatmak ve soğur sonra belli olacak. </li><li> çözünmeyen malzemenin pelet amacıyla 10 dakika boyunca 2,000 x g&#39;de viral süpernatan iki koleksiyon ihtiva eden 50 ml konik tüp santrifüjleyin. 0.45 um düşük protein bağlama şırınga filtresinden (PES veya PVDF) içinden süzme ile, viral ortamı saflaştınlır. </li><li> 5x polietilen glikol kullanarak ortamına 6000 solüsyonu ilave edin (nihai konsantrasyon% 8 polietilen glikol 6000 ve 0.3 M NaCl olmalıdır). Tüp birkaç kez (vorteks yapmak) ters çevirerek karıştırın. zaman zaman yeniden karıştırma, 12 veya daha fazla saat boyunca, 4 ° C de, viral ihtiva eden polietilen glikol çözeltisi inkübe edin. </li><li> (Gün 9) santrifüj 45 dakika boyunca 2500 x g&#39;de viral ihtiva eden polietilen glikol çözeltisi. Süpernatantı çıkarın ve atın ve 2 dakika için tekrar döndürün. Yine, kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> 320 ul ekleyerek peletSteril bir fosfat tamponlu tuzlu su ve gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin (320 ul, 1/100 toplanan virüs ihtiva eden ortam orijinal hacminin th). İsteğe bağlı olarak, 30 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında pelletini. </li><li> Pelet yeniden süspansiye sonra kısım virüsü (5-10 ul, 0.5 ml başına tüp) ve -80 ° C&#39;de (önemli ölçüde titresi azaltacaktır 4 ° C&#39;de çözülme veya depolama dondurma) alikotları dondurma. </li><li> Örneğin, standart protokoller kullanılarak virüs titresi, HEK293T hücreleri, 6 gözlü bir plakanın üzerine bir seyreltme serisi yerine elle 48 saat sonra, floresan kolonileri sayın. </li></ol> CRISPR Virüs 5. Test Etkinliği NOT: Aşağıdaki adımları kullanarak Dizi klonlar fare Neuro2A hücrelerini kullanarak NHEJ tarafından onarılan çift iplikli kırılmalara üretimi için test etmek. Bu modifiye edilmiş hücrelerin yüzdesi ve niteliğini belirlemek için kullanılabilir olması ile Surveyor testlere göre avantajıNHEJ kaynaklanan indellerin arasında. <ol><li> örneğin, Matrigel olarak Coat jelatinimsi protein karışımı ile 3.5 cm hücre kültürü çanağı Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı içinde 1:50 seyreltilmiş ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. jelatinli protein karışımı aspire ve Neuro2A hücreleri plaka. </li><li> Neuro2A hücreleri% 50 kaynaşmaya eriştikten sonra, 10 enfeksiyon çokluğunda CRISPR lentivirüs veya retrovirüs ekleme (örneğin, hücre başına 10 viral partiküller). Not: HEK293 hücreleri gibi Neuro2A hücreleri enfeksiyonu için sevimli değildir, bu nedenle, tek bir enfeksiyon hücreleri lentivirüs ile enfekte olma 100% neden olmaz. Dahası, retrovirüs sadece bölünen hücreler enfekte ve bu nedenle de% 100 enfeksiyona neden olmaz. enfeksiyonun neredeyse% 100 oranına ulaşmak için, virüs ilavesi gerektiği gibi hücreler bölme, birden fazla gün tekrar edilebilir. Alternatif olarak, floresan pozitif hücreler, floresan aktive hücre sıralama kullanılarak izole edilebilir. thBir lentivirüsler ile% 100 enfeksiyon oranını elde etmek için, e en etkili yolu FACS izolasyonu, ardından tek bir enfeksiyon yapmaktır. Bir retrovirüs için 24 saat arayla enfeksiyon 4-mermi gerçekleştirmek ve% 100 enfeksiyonu sağlamak için FACS izolasyonu ile izleyin. </li><li> 1 hafta için hücrelerin enfekte sonra, 10 cm&#39;lik bir tabakta yakınındaki izdiham hücreleri genişletmek ortamı aspire ve fosfat-tamponlu tuzlu su, 5 ml plakayı yıkayın. % 0.25 tripsin 1 ml ilave edilir ve hücreler, plaka duruma gelinceye kadar 37 ° C&#39;de inkübe edin. % 0.25 tripsin reaksiyon nötralize etmek ve 1.5 ml tüp içine hücreleri pipet ve 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de topak hücrelere Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı, 0.5 ml ilave edilir. </li><li> hücrelerin yeniden askıya ve 95 ° C&#39;de inkübe, 50 mM potasyum hidroksit 100 ul ekleyin, DNA&#39;yı izole etmek 5 dakika boyunca ° C. 1 M Tris, pH = 8.0, 10 ul kullanılarak çözelti nötralize. </li><li> PCR CRISPR sgRNA hedef genomik bölgeyi çevreleyen bölgeyi genişletenkullanarak ~ DNA 300 ng yüksek sadakat PCR master karışımı 4 kullanarak adım 5.5 izole edilmiştir. </li><li> Bu tür bir jel DNA kazanım kiti gibi bir% 2.5 agaroz jel ile jel jel saflaştırma kiti kullanılarak uygun bir ebada sahip parça saflaştırmak üzerinde PCR reaksiyonu şu koşullarda yürütülmüştür. PGEM-T kolay şekilde, bir PCR klonlama vektörü içine bağlanır ve yetkin hücreleri 9 dönüşür. </li><li> 24 saat sonra, 15 ml yuvarlak tabanlı bir boru gibi uygun bir antibiyotik (ampisilin, neomisin, vs.) halinde LB suyu 2 ilave edin. LB-plaka tek bir koloni seçmek için steril bir pipet veya döngü kullanarak bireysel kolonisi ile tüp inoküle edin. Expand 250 RPM, 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de tüp çalkalanarak koloni büyür. istenildiği kadar koloni için tekrarlayın. <ol><li> Mini hazırlık kiti kullanılarak, E. DNA izole E. coli ve fare genomu Cas9 hedef bölgeyi analiz etmek için sgRNA hedef genin alan amplifiye etmek için tasarlanmış primerler ile sekansı. </li></ol></li></ol> Yetişkin fare 6. Stereotaksik enjeksiyon Protokolü <ol><li> Cerrahi için hazırlanın NOT: hayatta kalma ameliyatları sırasında steril koşulları sağlamak için önemlidir. Bu enjeksiyon bölgesini sterilize etmek için betadin kullanarak, cerrahi aletleri sterilize ve kapatıldıktan sonra kesi sitesine antibiyotik merhem ekleyerek ısı bu protokolde gerçekleştirilir. Steril eldiven yanı sıra iyice sterilize, özel cerrahi alanı kullanmak da önemlidir. <ol><li> Isı Sterilize cerrahi aletler otoklav veya bir kullanarak sıcak boncuk sterilizatör biri tarafından kullanılmadan önce. cerrahi ve kurtarma sırasında vücut ısısını korumak için ısıtma pedleri açarak kurtarma odasına ve cerrahi alanını hazırlayın. Enjeksiyon için kafatasında delik oluşturmak için kullanılan matkap birleştirin. </li><li> Yük steril PCR tüpü doğrudan virüsü çekerek enjeksiyon iğnesinin içine virüs 4 ul. Kısaca buz viral numuneyi çıkarın. virüs koruyunenjeksiyondan önce en fazla 1 saat boyunca oda sıcaklığında şırıngada. </li></ol></li></ol> 7. Stereotaksik Enjeksiyon <ol><li> cerrahi paketine havalandırma uygun hava akışını sağlamak için açık olduğundan emin olun. indüksiyon odasında izofluran% 4 ile anestezi ile ameliyat için fare hazırlayın. Anestezi ardından, enjeksiyon sitesi hazırlamak için başını tıraş. <ol><li> dilini aşağı taşımak için cımbız kullanarak ve yan stereotaksik alet fare yerleştirin. dişler, daha sonra, yuvaya açılan kulak çubukları emniyete kadar ağzına lokma çubuğunu yerleştirin. fare vücut ısıtma yastığı ve burun burun konisi yer olduğundan emin olun. burun konisi içine doğrudan% 4 izofluran. Cımbız ile ayak kısma ve hiçbir irkilme refleksi olduğunu sağlayarak anestezi onaylayın. </li><li> gözleri yağlamak için yapay gözyaşı uygulayın. Finish pov dönüşümlü mermi ile traş kafa sürüntü ile enjeksiyon bölgesini hazırlamakidone-iyot ve lidokain. </li></ol></li><li> Bir neşter kullanılarak, kafa derisi merkezi boyunca küçük kesi kesti. bregma görselleştirmek yardımcı olmak için gerekirse bir çubukla ve hidrojen peroksit ile kafatası kurulayın. <ol><li> Diseksiyon kapsamı kullanarak, kafatası üzerinde bregma bulmak ve bregma üzerine matkap ucu yerleştirin. Sıfır (veya kaydın) x, y ve z uçakları üzerinde dijital stereotaktik koordinatlar. </li><li> Baş y ekseni kaudal rostral seviye olduğundan emin olmak için, lambda üzerine matkap ucu yerleştirin ve z koordinat bregma ve lambda hem de kabaca eşit şekilde kafasını seviyesi. </li><li> Baş X ekseni üzerinde düzeyde olmasını sağlamak için, y = 1/2 lambda matkap ucu yerleştirin. z koordinatı emin olun sutur her iki tarafında (x = +/- 1 mm) 1 mm eşittir. bir fark olup olmadığını kafatası ayarlayın ve sol lambda sağındaki 1mm de z koordinatı. </li></ol></li><li> İstenilen koordinatlar üzerinde matkap yerleştirin. dentat girus için, koordinat kullanınsy bregma ve x = +/- 1.1 -1.9 =. Sondaj öncesi, sonra yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde, kafatası yoluyla matkap,% 2 izofluran indirin. <ol><li> tüm delik sonra, stereotaksik alet üzerine doldurulmuş şırınga yapıştırın. Görme delik üzerinde şırınga merkezi ve z kafatası koordinat sıfır. </li><li> Yavaşça derin z-derinliği şırınga indirin. dentat girus için, z derinlikleri -2.5, -2.4 ve -2.3 vardır. stereotaksik enjektör ile 0,25 ul / dakikalık bir oranda enjekte başlayın. <ol><li> Enjeksiyon düşük Z-derinlikte tamamlandıktan sonra, daha sonra koordinat sonraki yükseltmek ve tekrar enjeksiyon başlar, 1 dakika bekleyin. Tüm z-enjeksiyon koordinatları enjekte kadar bu modeli devam edin. son enjeksiyondan sonra şırıngayı çıkarmadan önce 2 dakika bekleyin. NOT: Hiçbir yan etki fare beyninde yarımkürede başına virüsün 2 ul kadar enjekte ederek doku üzerinde not edilmiştir. </li></ol></li><li> Diğer delik enjeksiyon tekrarlayın. </li></ol></li><li> Enjeksiyon sonrası, stereotaksik cihazdan fare kaldırmak ve 6-0 ipek dikişlerle kafa derisi sütür. Lidokain ve yaraya bir anti-bakteriyel krem ​​uygulayın. <ol><li> ağrı yönetmek için IP yoldan 0.8-1.0 ml serum fizyolojik + ketoprofen (3-5 mg / kg) enjekte edilir. Sonra ısıtılmış kurtarma odasına fare yerleştirin. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete hayvan iade etmeyin. </li></ol></li><li> cerrahi sonrası günlerde, günlük fare tartmak ve yumuşak gıda ve davranır sağlar. Yarayı kontrol ve genel durumu / tavır not edin. </li><li> Stereotaksik enjeksiyonu takiben, fareler dilim hazırlık elektrofizyoloji 1 ötenazi veya perfüze ve beyinleri çıkarılmış, dilimlenmiş ve analiz 10 immünohistokimya yoluyla lekeli olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive.">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells.">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus.">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).</li><li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes.">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons.">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis?.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?.</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Başarılı viral paketleme için önemli olan bir kaç kritik adımlar vardır. sağlıksız hücreleri büyük ölçüde üretilen virüs miktarını azaltacaktır gibi hücre sağlığı, öncesi ve transfeksiyon sırasında önemlidir. transfeksiyon ve paketleme başarılı olursa, o zaman hücrelerin% 100 fluorofor ifade etmelidir ve hücreler fonksiyonel Sinsityum oluşturmalıdır. Aşama 3.2.4, boru çekme verimli, yüksek titre transfeksiyonu için gerekli olan ve HEPES-tamponlu tuzlu su pH kesin olmalıdır. Viral paketleme için gerekli plazmidler üretmek maksi prepler derece saf olması gerekir. Bu noktaya kadar, son DNA yıkanmasının çökeltilmesi etanol ve Tris-EDTA tamponu içinde yeniden askıya yararlıdır. Kafein, viral alınan güne 6 (basamak 3.4) üzerine ilave edilir olduğu ortam içinde% 2 ya da daha düşük serum miktarını azaltmak için de çok önemlidir. Serum düşük değilse, o zaman son saflaştırılmış virüs serum prot istenmeyen bir miktarda ihtiva edecektirein. polietilen glikol viral partikülleri çökeltme 6000 kullanımı ultra-santrifüj gerekliliğini hariç tutar. Cas9 CRISPR içeren virüsler genellikle sadece bir fluorofor içeren virüsler kat daha az yaklaşık 10 bir titreye sahip olduğunu not etmek de önemlidir. stereotaksik cerrahi için, inhale anestezi kullanımı enjektabl anestezik kıyasla hızlı ve hassas kontrol veya hayvanın bilincini izin verir ve daha geniş bir yaş aralığında anestezi sağlar. Temiz ve steril cerrahi aletler tutmak son derece önemlidir ve tekrarlanabilir hedefleme kafasının hassas konumlandırma gerektirir. stereotaksik alet ve kafatası sıkıca hissediyor başın gözleyin ya da haddeleme olduğundan emin olun. Kafatası stereotaksik koordinatlarını belirlemek için sütür bulmak için kuruması için yararlı olabilir. Ayrıca, koordine stereotaksik her hızı ve hacim ampirik olarak tespit edilmelidir. Bu teknik, (AAVler) .Bu nedenle adeno-bağlantılı virüs ile karşılaştırıldığında, bir lenti- veya retrovirüs yayılması özellikle kısıtlı bir ayrık beyin bölgesi enfekte olduğunda, bu virüsler değerlidir, fakat genel olarak bulaşmasına AAVler ile ilişkili değil de sınırlayan hayvanlarda davranış analizi için kullanılmıştır. Bu protokolde kafein kullanımı büyük ölçüde bu virüslerin titresi artar, ama yine de AAV ambalaj elde titreleri gibi yüksek değildir. Ayrıca, geçici olarak transfekte zaman CRISPR / Cas9 istikrarlı genomik düzenlemeler bile formları olarak stabil entegrasyon florofor ifade sadece bir avantaj olduğunu ve bunun mümkün olduğunu devam eden sonunda hedef etkiler kapalı üretebilir Cas9 ve sgRNA ifadesini. AAVler ile CRISPR / Cas9 sistemi hücre bölünmesi üzerinden gerçekleştirilen genomik değişiklik sağlamak için yeterli olan geçici ifade, ancak, flüorofor sentezleme devam edilmez. len oluşturulmasıTi ve CRISPR / Cas9 sistemini kullanan retrovirüsler organizmaların geniş bir yelpazede herhangi bir yeni genin hedeflenmesi yeteneği vermek olacaktır. Gen düzenleme etkinliği Cas9 bölünmesini hedefleme kılavuz RNA sekansına bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Deneysel dizileme Neuro2A hücreleri enfekte sonrası 10 ila% klonların% 80 indeller içeren olduğu tespit edilmiştir. Neuro2A hücrelerinde hesaplanan Indel frekansları nöronların bu yansıtıcı olup bilinmemektedir. Böyle Benchling olarak rehberlik RNA tasarım yazılımı artık belirli bir hedef dizinin etkinliğini tahmin etmek mümkün olabilir bir &quot;on-hedef&quot; puan içerir. Bu tür &quot;on-hedef&quot; puanları daha yaygın uygulanan olur ampirik CRISPR-Cas9 sistemi olarak nöronlar ve diğer hücre türleri belirlenecek güvenilir ihtiyaçlar için ne derece. Lentivirüs tabanlı transgenik hayvan üretimi lentivirüs-teslim transgenlerin si haline raporları ile değişken başarılı olmuştur11 lenced. DNA CRISPR aracılı gen düzenleme bütün hayvan modelleri oluşturmak için mikrop hattı üzerinden geçirilebilir. Böylece, istikrarlı genomik düzenleme viral teslim fluorophores ve Cas9 transgenlerin susturma rağmen elde olabilir. Bu hedef genomik değişiklikler için etkin bir platform sağlayabilir. CRISPR / Cas9 sisteminin viral teslimat, transgenik organizmalar gerekmeyen iken, bu tekniklerin tamamlayıcıdır. Örneğin, indüktif genetik manipülasyonlar ve nöronal aktivitenin arasındaki ilişkinin içine karmaşık çalışmaları kolaylaştırmak gerektiğini Cre ve Cre bağımlı opto veya kemoterapi-genetik transgenlerin ifade eden bileşik transgenik hayvana böyle viral partikülleri enjekte. İkinci bir örnek, gen gen etkileşimleri taranması için bir girişim bir koşullu nakavt içine bu Cas9 / sgRNA viral partikülleri sunmaktır. Son olarak, bu araştırmanın bir başka heyecan verici rota hasta türetilmiş hücrelerde fenotip ve tedavi bileşiklerin tarama, hangi can olandoğrulamak ve çeşitli hastalıklarda bozulur genetik ağları bulmak için kullanılabilir.

normal fizyoloji ve hastalık patolojisinin temel incelemek için, hassas bir model organizmada gen ekspresyonu işlemek için bir ihtiyaç vardır. ilgi konusu bir genetik eleman, bir rekombinaz tarafından tanınan bölgeleri tarafından takviye edilir, burada, memeli bir model organizmalar için, bu, büyük ölçüde oluşturma ve transgenik farelerin gelişimi üzerinde odaklanmaktadır. Bu durum, bu iki yanında bir gen alana özgü manipülasyon neden olabilir. Bu başarılı bir strateji olsa da, zaman ve kaynak yoğun olduğu; Örneğin, bir floxed gen Cre rekombinaz ve Cre raportör geni ifade olan bir üç transjenik hayvan oluşturma çok çiftleşmesi ve onay gerektirmektedir. Bunun aksine, bir replikasyon stereotaksik enjeksiyonu floxed geni hayvana floresan protein ve rekombinazı kodlayan kusurlu viral parçaları, karmaşık genotipleme veya üretme stratejilerinin 1 gerektirmez. virüs eksprese eden bir floresan protein ve Cre ise Bundan başka, ikinci bir virüs Enco ile birlikte enjekte edilirDing, farklı bir flüoresan proteini, bu hedef genetik manipülasyonu için bir mesafede olan doku kontrolü sağlar. Bu strateji hala knock-in hayvanların kullanılmasını gerektirir iken, viral aracılı RNA temelli stratejiler transgenik hayvanların ihtiyacını aşmak. Örneğin, bir flüoresan protein ve kısa bir saç tokası RNA (shRNA) kodlayan replikasyon eksikli virüsleri stereotaksik enjeksiyonu ilgi konusu bir genin kopyasının güçlü bir azalmaya neden hücrenin endojen RNAi amaçlı kullanılabilir. Ancak, shRNA stratejileri genellikle mütevazı hücresel fenotipleri 2 sonuçlanan ince gen knock-çıkışlar üretir. bir knock-down daha fizyolojik heterozigot gen disfonksiyonu hakkında olsa da, onun azalmış sağlamlığı bir knock-out ile karşılaştırıldığında yeni genlerin fenotipik keşif için ideal değildir. Son zamanlarda ortaya çıkan üçüncü bir tekniktir, ilişkili CRISPR-(Düzenli interspaced Kısa palindromic Tekrar Kümelenmiş) CRISPR / Cas9 (Protein 9) sistemi, bir küçük dışsal RNA ve DNA kesme enzimi hem ekspresyonuna dayanır. CRISPR / Cas9 sistemi yabancı tanımlayan virüs DNA istila ve Cas9 enzimi 3,4 vasıtasıyla bozulmaya için hedeflenmesi için bir yöntem gelişti prokaryotik bağışıklık sistemi için uyarlanmıştır. Bu güçlü genom düzenleme tekniği hedeflenen silmeler, girmeler ve mutasyonları oluşturmak için kullanılabilir; Aşağıdaki protokol, in vivo ifadesini nakavt için ilgi konusu bir gen silme işlemi yapmak için nasıl özetleyecek. Cas9 enzimin bir skafold RNA ile ilgili bölge ile homolog ve bitişik bir kılavuz RNA ile ifade edilmelidir. Bu tekniği kullanarak bir genin nakavt sentetik kılavuz RNA&#39;lar (sgRNA) kullanarak genomunda belirli bir bölgeye Cas9 hedefleyen ve ilgi yerinde çift iplikli sonları (DSBs) indükleyici gerektirir. Bu DSBs sonra homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) hangi le yoluyla endojen hücre onarım makine tarafından tamir ediliryanlış anlamlı veya anlamsız mutasyon üretebilir ve bu nedenle fonksiyonel protein ifade 5 kaybına oluşturabilirsiniz indellerin reklam. Bu sistem genomik değişiklikler üretir, çünkü sadece Cas9 ve sgRNA geçici ifadesini gerektirir. sabit bir flüoresan göstergesi bu şekilde manipüle hücreleri ve soyu tespit etmek için Ancak, arzu edilir. Lenti- ve retrovirüsler kararlı bir şekilde, uzun süreli ekspresyonunu korumak ve mitoz sırasında yavru hücrelere aşağı geçirilir konakçı hücrelere, ilgi konusu DNA&#39;yı entegre avantajına sahiptir. Bu protokol tasarım ve replikasyon kusurlu hale, yüksek titre retrovirüslerin iki tip üretimini tarif etmektedir: insan bağışıklık eksikliği virüsü kaynaklı lentiviral partiküller (lentivirüs) ve murin Maloney Lösemi virüsü (retrovirüs) dayananlar. Bu virüslerin her iki stabil büyük transgenlerin ifade destekleyebilen olsa da retroviral parçacıklar, sadece genomun du entegre olabilirBu nedenle nükleer zarfın bozulması ve halka hücre bölünmesi bir etiket aracı ve doğum tarihini hücreleri 6 olarak kullanılabilir. Lentiviruses viral toplama sırasında kafein 8 kullanımı dahil nispeten düşük titre 7, bu metodoloji, olduğu için bir üne sahip olsa da, rutin 10 9 ve 10 10 parçacıklar / ml titreleri üretir. lenti- ve retrovirüsler diğer bir avantajı, çok büyük parçaları için tolerans. protokolleri takip toplama flüoresan raportör, sgRNAlardır ve Cas9 DNA değiştirme gibi bir flüoresan proteini ifade etmek üzere CRISPR / Cas9 sistemi kullanmak için kodlayan bir lenti tasarımı veya retrovirüs prosedürü özetlenmektedir. Fare stereotaksik nöroşirürji morfolojisi, fonksiyon ve enfekte nöronların bağlantı incelemek için in vivo virüs enjekte etmek için değerli bir yöntemdir. nöronlar viral enfeksiyonun tim uzun bir süre boyunca ifade seviyelerini değiştirmek için kullanılabilirBu gelişim boyunca e, ve sentezleme tam olarak çeşitli ilaç uyarılabilir sistemler ve spesifik Cre tahrik ifade kullanımı ile kontrol edilebilir. Bu özel protokol bir yetişkin fare beyninde ilgilenilen geni nakavt bir sgRNA ve Cas9 ifade eden bir virüs enjekte açıklar. Fareler 48 saat sonrası enjeksiyon içinde görülebilir, viral transgenin bu prosedür ve ifadeden çok hızlı iyileşir. Bununla birlikte, florofor sentezleme 3 hafta sonrası enfeksiyon yakınındaki maksimal seviyeleri ile sonuçlanan hafta boyunca arttırır. Viral stereotaksik enjeksiyonu tabi Fareler davranış, elektrofizyoloji, ya da morfolojik çalışmalar için de kullanılabilir. Genel olarak, bu prosedürlerin amacı stereotaksik cerrahi ve belirli bir sgRNA ve Cas9 ifade eden bir virüs kullanılarak yetişkin fare beyninde bir gen nakavt nasıl göstermektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="519">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Cell Culture Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:64px;width:139px;">293FT cell line</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">R700-07</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;">For Lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">293GP cell line</td>
			<td style="width:93px;">Clontech</td>
			<td style="width:60px;">631458</td>
			<td style="width:228px;">For Retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Iscove&#39;s Modification of DMEM (IMDM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;">10-016-CV</td>
			<td style="width:228px;">Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and&#160; 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="125" rowspan="2" style="height:126px;width:139px;">MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">25-025-CI</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">L-Glutamine solution, 100X (L-Gln)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">25-005-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:139px;">Polystyrene 10cm plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CC7682-3394</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;"> 
			&#160;25-053-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Transfection Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">5ml polystyrene tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">352054</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:139px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">C69-500</td>
			<td style="width:228px;">Make a 2.5 M solution in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">S271-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">HEPES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">BP2939-100</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:139px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">S369-500</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:139px;">(Na2HPO4)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="78" rowspan="2" style="height:78px;width:139px;">2X HEPES Buffered Saline (HBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;">500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Caffeine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">C0750-5G</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.22 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.45 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLHP033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">60CC L/L Syringe</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">MV60CCLL</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">50 ml Conical Tube</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">352098</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">polyethylene glycol&#160;&#160; 6000 (PEG 6000)</td>
			<td style="width:93px;">Millipore</td>
			<td style="width:60px;">528877</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">National Diagnostics</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CL-253</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:60px;">1605-0000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Matrigel</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">CB-40230A</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">353046</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">AC41678-5000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Donor Horse Serum</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:60px;">35-030-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">X100-500ML</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">10ml serological pipette</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">357551</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:60px;">A21311</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">&#160;Stereotaxic Surgery Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:139px;">Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">1CCVLS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">&#160;Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">&#160;JOR580S</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXPARALUBE-O</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">PVP PrepSolution&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">HPIV108208H</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">normal saline&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">DYND500MLSH</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">CTA6</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Triple antibiotic ointment&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXTRIP-OI15</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">MONOJECT&#174; Needles Soft Pack 25g x 5/8&#34;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">25058</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-0 silk sutures</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">MV-711</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

Belirli bir hedefleme sekansı oligo alt HU6 promotörünün PXL klonlama vektörü içine sokulur ve BBSI klonlama siteleri kullanılarak bir kılavuz RNA iskele mansap &quot;CRISPR / Cas9 Retrovirus için bir kılavuz bloğun (sgRNA) Tasarımı Protokolü&quot; izlenerek (Şekil 1, aşama 1). Bu sgRNA sonra pxl kesilmiş ve BstBI ve Pacl siteleri (Şekil 1, Aşama 2) kullanılarak pRubi omurgası içine sokulur. Son olarak, başka bir sgRNA geninin bir alan hedef ve NHEJ üzeri nakavt şansını arttırır pRubi-GUIDE1 (Şekil 1, Aşama 3) ilk kılavuz alt baş yerleştirilebilir pxl klonlanmıştır. Doğru yapıların doğrulanması sekans analizi ile tespit edilmelidir. bu yapı, yapıldığında, &quot;retro / lentiviral Üretim- CaPO4 Yöntem Protokolü&quot; izlenerek virüs içinde paketlenebilir. Başarılı ambalaj v titre etmek için HEK293 hücrelerine virüs enfeksiyonu ile doğrulanırirus. Hiçbir fluorofor ifade yoksa o zaman büyük olasılıkla virüs paketleme sırasında bir hata oluştu. Şekil 2 2 retrovirüsler, bir ifade GFP ve diğer ifade mCherry temsili bir sonucudur, (7 gün eski) yenidoğan fare dentat girus içine birlikte enjekte ve 21 gün sonrası enjeksiyon görüntülenmiş. mCherry veya GFP ile nöronların Etiketleme sadece bir florofor ifade, bir virüs, bir CRISPR ifade aynı dokuda çeşitli genetik manipülasyonlar, morfolojik değerlendirme / Cas9 aracılı KO ve diğer bir kontrol virüsü tanır. Stereotaksik enjeksiyon amaçlanan koordinatlar, dentat girus ayrık enfeksiyon da gösterdiği gibi hassas anatomik seçicilik sağlar. enfeksiyon beyin bölümleri analiz ederken, o doğru anatomik bölge enfekte olduğu saptanmış kadar çevreleyen doku tutmak için önemlidir. enfeksiyon belirtisi yok ise, o zaman enjeksiyon komşu bölgenin bir meydana geldiğini mümkündürD çevresindeki bölümleri tespit edilebilir. Aynı zamanda tam enjeksiyon bölgesini bulmak için iğne parçayı bulmak için yararlı olabilir. In vivo enjekte ve tüm dentat girus boyunca rostral / kaudal eksen bulaşmasını hücrelere yayılabilir eğilimi zaman 3 boyutlu rekonstrüksiyon (Şekil 3) ile analiz olarak VSVg pseudotyped virüsler nadiren kıvrımlarının marjlarının yayıldı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> Şekil 1:. Retroviral pRubi-GUIDE1-Kılavuzu 2-CRISPR yer plazmid için klonlama stratejisi Bu strateji FU temelli lentiviral plasmidler için aynıdır. sgRNA oligos tavlı ve BsbI klonlama sitelerini kullanarak PXL eklenir. Sıralama sgRNA başarıyla PXL takılı olduğundan emin olmak için sonra BstBI ve Pacl ile plazmid sindiremez. (Kara kutu) dışarı bırakılan insert sonra viral geri b klonlanırbir pRubi-GUIDE1 CRISPR (siyah çizgiler noktalı). İkinci sgRNA da PXL içine yerleştirilir ve Pfalc enzimi kullanılarak sindirilmiş olabilir. Bu, daha sonra Pacl sitesi kullanılarak pRubi-GUIDE1 CRISPR vektörü (kırmızı noktalı çizgiler) klonlanır. Elde edilen plazmid daha sonra kılavuz tellerini yanı sıra gerekli olan viral unsurları, destekleyicileri ve fluorophores hem de içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> Şekil 2:. MCherry (kırmızı) veya GFP (yeşil) ifade eden fare kıvrımlarının retroviral enjeksiyonla retrovirüsler, P7 fare dentat girus içine enjekte edildi. 21 gün sonra fareler, perfüze edilmiş ve beyinleri kesitli ve GFP ve mCherry için boyandı. (A) 5X geniş alan floresan görüntü pr gösterirdentat girus enjeksiyon ecision ve etiketleme dentat girus granül nöronların özgünlüğü. hipokampus morfolojisi DAPI (mavi) boyama ile görülebilir. Ölçek çubuğu 200 mikron ölçer. (B) 10X geniş alan floresan görüntü bu yüksek titre lentiviruses olan morfoloji fluorofor ifade ulaşılabilir hücrelerin çok sayıda enfekte olduğunu göstermektedir. Ölçek çubuğu 100 mikron ölçer. GFP veya mCherry ifade (C) Virüsler dentat girus birlikte-enjekte edilmiştir. retrovirüslerin bir sistemin kullanılması ile bir GFP ve mCherry ile işaretlenmiş bir manipülasyon ile işaretlenmiş bir genetik manipülasyon yapmak için bir virüs kullanabilir, ve daha sonra her birinden kaynaklanan virüsün tek ya da ilave değişiklikleri değerlendirmek. Ölçek çubuğu 10 mikron ölçer. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> Şekil 3:. Lentiviral enjeksiyon anatomik yayılması Stereotaksik ko-enjeksiyon<html> GFP-shPten virüsü ve bir yetişkinin beyninin içine bir MCherry kontrol virüsünün PTEN loxP / + fare hipokampusun dentat girus tüm rostral / kaudal ekseni boyunca viral yayılma sonuçlandı. Bu viral yayılma kontür yeniden yazılımı kullanarak 21 seri bölümleri (Z = 50 mm / bölüm) üzerinden takip edildi kapalı olan enjeksiyon ölçüde bir 3D rekonstrüksiyon gösterilir. kontur iz sonra ses ölçümü için 3D görüntüler oluşturmak için uyumlu hale getirilmiştir. Toplam viral yayılım yeşil gösterilir (hacim = 54730800 um 3) ve dentat lokalize yayılması (= 27.275.200 um 3 hacim) mor renkte gösterilmiştir. Virüs iğne izi ve dentat girus rostral / kaudal ekseni dolum yanı sıra iğne izi kesiştiği korpus kallosum boyunca yayılır. Ölçek çubuğu 200 mikron ölçer. les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; Ek Video sgRNAlardır 1. Tasarım retroviral ve lentiviral omurgası içine klonlamak. Bu, sentetik kılavuz RNA (sgRNA) tasarım örneğinde, fare CHD8 genomik sekans, NCBI indirilir. start kodonu ve ekson yapısı daha sonra Vektör NTI içinde görülür. Bu bize ilk kodlama ekson etrafında genomik bölge kopyalayıp Benchling içine bu diziyi girmek için izin verir. Benchling bize bölgedeki tüm potansiyel sgRNAlardır görüntülemenizi sağlar. Ayrıca, biz girişi var genomik bölgeyi gösteren sonra, Benchling bize her kılavuz RNA hedefine ve off-hedefe puanları gösterecektir. Kullanıcı daha sonra en yüksek içi ve dışı hedefe puanları ile kılavuz RNA seçebilirsiniz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection at JoVE.com

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

designing-packaging-delivery-high-titer-crispr-retro-lentiviruses-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.5K Görüntüleme.  Geisel School of Medicine at Dartmouth College.  CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır. 

Video: Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Non-ventriküler Plazmid Enjeksiyon ve Elektroporasyon Postnatal Rat Beyin Gen Teslimat

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Nörobilim

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Behavioral Neuroscience Kemirgen Stereotaksik Cerrahi ve Hayvan Refahı Sonuç İyileştirmeler

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step of the method is to develop a nervous system simulation of specific reflexive behaviors of an appropriate model organism; here we use the American Lobster. Exteroceptive reflexes mediated by decussating (crossing) neural connections can explain an animal's taxis towards or away from a stimulus as described by Braitenberg and are particularly well suited for investigation using the NXT platform.1 The nervous system simulation is programmed using LabVIEW software on the LEGO Mindstorms platform. Once the nervous system is tuned properly, behavioral experiments are run on the robot and on the animal under identical environmental conditions. By controlling the sensory milieu experienced by the specimens, differences in behavioral outputs can be observed. These differences may point to specific deficiencies in the nervous system model and serve to inform the iteration of the model for the particular behavior under study. This method allows for the experimental manipulation of electronic nervous systems and serves as a way to explore neuroscience hypotheses specifically regarding the neurophysiological basis of simple innate reflexive behaviors. The LEGO Mindstorms NXT kit provides an affordable and efficient platform on which to test preliminary biomimetic robot control schemes. The approach is also well suited for the high school classroom to serve as the foundation for a hands-on inquiry-based biorobotics curriculum.

An approach to neural network modeling on the LEGO Mindstorms robotics platform is presented. The method provides a simulation tool for invertebrate neuroscience research in both the research lab and the classroom. This technique enables the investigation of biomimetic robot control principles.

LEGO Robotlar Sinir Sistemi simülasyonlar Tasarlama ve uygulama

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Fare Hippocampus içine Oligomerik Amiloid-beta Stereotaksik İnfüzyon

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

CNS içine Hedeflenen Madde Teslimat için Fare Mikrocerrahi İnfüzyon Tekniği<i&gt; yoluyla</i&gt; İç Karotis Arter

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to the interphotoreceptor/subretinal compartment that has direct exposure to photoreceptors and the retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injections of plasminogen as well as recent preclinical and clinical trials have demonstrated safety and/or efficacy of delivering viral vectors and stem cells to individuals with advanced retinal disease. Mouse models of retinal disease, particularly hereditary retinal dystrophies, are essential for testing these therapies. The most common injection procedure in rodents is to use small transcorneal or transcleral incisions with an anterior approach to the retina. With this approach, the injection needle penetrates the neurosensory retina disrupting the underlying RPE and on insertion can easily nick the lens, causing lens opacification and impairment of noninvasive imaging. Accessing the subretinal space via a transcleral, posterior approach avoids these problems: the needle crosses the sclera approximately 0.5 mm from the optic nerve, without retinal penetration and avoids disrupting the vitreous. Collateral damage is limited to that associated with the focal sclerotomy and the effects of a transient, serous retinal detachment. The simplicity of the method minimizes ocular injury, ensures rapid retinal reattachment and recovery, and has a low failure rate. The minimal damage to the retina and RPE allows for clear assessment of the efficacy and direct effects of the therapeutic agents themselves. This manuscript describes a novel subretinal injection technique that can be used to target viral vectors, pharmacological agents, stem cells or induced pluripotent stem (iPS) cells to the subretinal space in mice with high efficacy, minimal damage, and fast recovery.

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Subretinal Space erişim için bir alternatif ve Onaylı Enjeksiyon Yöntemi<i&gt; yoluyla</i&gt; Bir transkleral Posterior Yaklaşım

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an approach provides a safe delivery method by-passing the blood brain barrier (BBB), thus allowing treatment with therapeutics with poor BBB-permeability or those for which systemic exposure is not desired, e.g., due to toxicity. CED requires optimization of the catheter design, injection protocol, and properties of the infusate. With this protocol we describe how to perform CED of a solution containing up to 20 &#181;g of an antibody into the caudate putamen of mice. It describes preparation of step catheters, testing them in vitro and performing the CED in mice using a ramping injection program. The protocol can be readily adjusted for other infusion volumes and can be used for injecting various tracers or pharmacologically active or inactive substances, including chemotherapeutics, cytokines, viral particles, and liposomes.

Convection-enhanced delivery (CED) is a method enabling effective delivery of therapeutics into the brain by direct perfusion of large tissue volumes. The procedure requires the use of catheters and an optimized injection procedure. This protocol describes a methodology for CED of an antibody into a mouse brain.

Konveksiyon ile Murine beyin içine antikorların teslimi-gelişmiş teslimat

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. Previously published protocols recommend using straight needles that should be lowered to a maximum of 1-2 mm from the dural surface. The sudden drop in resistance once the dural membrane has been punctured makes it difficult to maintain the needle in a steady position. Our method, instead, employs a needle bent at the tip that can be stabilized against the occipital bone of the skull, thus preventing the syringe from penetrating into the tissue after perforation of the dural membrane. The procedure is straightforward, reproducible, and does not cause long-lasting discomfort in the operated animals. We describe the intracisternal injection strategy in the context of genetic fate mapping of vascular leptomeningeal cells. The same technique can, furthermore, be utilized to address a wide range of research questions, such as probing the role of leptomeninges in neurodevelopment and the spreading of bacterial meningitis, through genetic ablation of genes putatively implicated in these phenomena. Additionally, the procedure can be combined with an automatized infusion system for a constant delivery and used for tracking cerebrospinal fluid movement via injection of fluorescently labelled molecules.

We describe an intracisternal injection that employs a needle bent at the tip that can be stabilized to the skull, thus eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. The approach can be used for genetic fate mapping and manipulations of leptomeningeal cells and for tracking cerebrospinal fluid movement.

İntrasisternal Enjeksiyon Ile Leptomeningeal Hücre Modifikasyonu İndüksiyonu

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...