AV è stato sostenuto da un lungo periodo borsa di studio postdottorato EMBO. La ricerca in laboratorio Martin è finanziato da una sovvenzione del CER di partenza (GeometryCellCycle) e una borsa di studio Science Foundation nazionale svizzero (31003A_155944) per SGM.

Analisi al microscopio di lievito di fissione riproduzione sessuale 1. Carta Preparazione <ol><li> Preparare terreno minimo sporulazione (MSL-N) 15 mescolando i seguenti componenti: Glucosio: 10 g / L, KH 2 PO 4: 1 g / L, NaCl 0,1 g / L, MgSO 4 · 7H 2 O: 0,2 g / L. Aggiungere Oligoelementi (10.000X): 100 l / L, vitamine (1,000x): 1 ml / L, e 0,1 M CaCl 2 &#160; ml / L. Filtro-sterilizzare utilizzando un formato di filtro 0,22 micron pori e conservare a temperatura ambiente (RT). <ol><li> Utilizza il seguente Vitamine (1,000x) stock: pantotenato: 1 g / L, acido nicotinico: 10 g / L, inositolo: 10 g / L, biotina: 10 mg / l. Filtro-sterilizzare utilizzando un formato di filtro 0,22 micron pori e conservare a 4 ° C. </li><li> Utilizzare i seguenti oligoelementi (10.000X) stock: Acido borico: 5 g / L, MnSO 4: 4 g / L, ZnSO4 · 7H 2 O: 4 g / L, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 g / l , MoO 3: 0,4 g / L, KI: 1 g / L, CuSO 4· 5H 2 O: 0,4 g / L, acido citrico: 10 g / L. Filtro-sterilizzare utilizzando un formato di filtro 0,22 micron pori e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare MSL-N agarosio 2% (usato per fare camere pad agarosio) combinando 10 ml di MSL-N con 0,2 g di agarosio. Melt per ~ 2 minuti ad alta potenza in un forno a microonde fino a quando si scioglie agarosio e aliquote da 0,5 ml in tubi microcentrifuga. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare terreno minimo sporulazione con azoto (MSL + N) da MSL-N aggiungendo (NH 4) 2 SO 4: 1 g / L, Leucina: 0,225 g / L, adenina: 0,225 g / L, Uracil: 0,225 g / L . Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro dimensione dei pori di 0,22 micron. Conservare a temperatura ambiente. Nota: leucina, adenina e uracile vengono aggiunti a questo mezzo per consentire la crescita di ceppi auxotrofi. Ulteriori supplemento di aminoacidi dovrebbe essere incluso se il ceppo utilizzato porta un auxotrofia distinta (per esempio his3Δ). Si prega di notare, inoltre, che il lavoro con ceppi completamente prototroph è consigliato, in quanto solotali ceppi permetteranno alta efficienza di accoppiamento. </li><li> Preparare 200 ml VALAP per la sigillatura della camera. In un becher aggiungere pesi uguali di lanolina, vaselina (o altro vaselina), e paraffina. miscela di calore a bassa temperatura e mescolare di tanto in tanto fino a quando completamente mescolato. Aliquota del mix in diversi piccoli capsule di Petri. Conservare a temperatura ambiente. </li></ol> 2. I ceppi Coltura lievito di fissione per esperimenti di accoppiamento (Figura 1). <ol><li> Giorno 1, Sera: Seminare ceppi appena striate da un supporto solido in provette di coltura contenente 3 ml di MSL + N. Utilizzare tubi a fondo piatto di circa 2,5 cm di diametro. Utilizzare altri tubi di coltura o di boccette con volume di cultura adattato. Incubare per una notte (O / N) con agitazione a 25 ° C, 200 giri al minuto. Se si lavora con ceppi heterothallic, inoculare separatamente. <ol><li> Diluire sospensioni cellulari in mezzi la mattina seguente per garantire che le culture hanno densità ottica misurata a 600 nm (OD 600) di 0,4-0,8 sera. Nota:OD 600 misurazioni come proxy di concentrazione cellulare di lievito di fissione sono lineari nel range di circa 0,1-1,0. Per il nostro OD spettrofotometro 600 = 0.1 corrisponde a 1,4 x 10 6 cellule per ml. Così, se OD iniziale 600 legge sono al di fuori di questo intervallo campioni devono essere diluiti / concentrato per misurazioni affidabili. </li></ol></li><li> 2 ° giorno, da sera: Diluire le cellule in 20 ml di MSL + N media per OD 600 = 0,025 in 100 ml flaconi. Incubare ceppi O / N a 30 ° C, 200 giri al minuto. Nota: colture di cellule wild-type dovrebbe raggiungere OD 600 ~ 0,8 la mattina seguente (15 ore più tardi). Se si lavora con ceppi con tempo più lungo di generazione regolare la diluizione di conseguenza. </li><li> 3 ° giorno, Mattina: Misura OD 600 per verificare che le culture hanno densità cellulare di OD 600 ~ 0.8. Se si lavora con ceppi heterothallic, mescolare un numero uguale di cellule partner. Cellule pellet a 1.000 xg, trasferire in un 1,5 mltubo. Lavare le cellule tre volte in 1 ml di terreno MSL-N. Risospendere le cellule in 3 ml di terreno MSL-N e diluire le cellule ad OD 600 = 1.5. <ol><li> Per monitorare l&#39;accoppiamento tra le cellule sorelle montare direttamente le cellule per l&#39;imaging (vedi protocollo sezione 2.4). Utilizzare ceppi H90 homothallic, in quale tipo di accoppiamento di commutazione avrà luogo durante le divisioni mitotiche che si verificano dopo deprivazione di azoto. montaggio immediato di celle del pad agarosio assicura che, dopo la divisione cellulare, sorella-cellule rimangono accanto all&#39;altro. </li><li> Per monitorare polarizzazione cellulare (dinamiche esplorative e shmooing) incubare 1-3 ml di coltura cellulare a 30 ° C, 200 rpm per 3-4 ore prima di celle di montaggio per l&#39;imaging. All&#39;interno di questi 3-4 ore, si sono verificati l&#39;ultima divisione mitotica. A poche cellule saranno hanno avviato la polarizzazione, ma la maggior parte saranno solo iniziando la loro dinamica di polarizzazione esplorativi. </li><li> Per monitorare la fusione cellula-cellula incubare 1-3 ml di coltura cellulare a 30 ° C, 200 rpm per 4-6 hr prio alle cellule di montaggio per l&#39;imaging. </li><li> Monitorare eventi post-fusione incubare 1-3 ml di colture cellulari a 30 ° C, 200 rpm per 8 ore prima di celle di montaggio per l&#39;imaging. </li><li> Per monitorare la risposta ad una concentrazione di feromone specifico (solo per ceppi heterothallic) incubare 3 ml di coltura cellulare a 30 ° C, 200 rpm per 3-4 ore prima di celle di montaggio per l&#39;imaging. <ol><li> Rimuovere la provetta MSL-N-contenente dal blocco C di calore 95 ° (vedere la sezione Protocollo 2.4.1. Di seguito). Aggiungere P-factor o fattore M alla concentrazione desiderata direttamente in agarosio fuso MSL-N. Mescolare bene nel vortex prima della preparazione immediata pad. </li><li> Dopo il montaggio cella, incubare il pad per 15-30 minuti a 25 ° C prima di imaging. P-factor e fattore M i feromoni sono stati utilizzati da una soluzione stock di 1 mg / ml in metanolo. Nota: Se si lavora con mutante ceppi tempi di incubazione possono variare. Aggregazione delle cellule può verificarsi dopo incubazione prolungata in m liquidoedia e può essere particolarmente forte in alcuni ceppi mutanti. cellule aggregata non possono essere individuati sul pad agarosio in un unico strato e quindi sono difficili da autofocus e immagine. In caso di forte aggregazione cellulare montare celle pastiglie agarosio dopo lavaggi e risospensione in mezzi azoto privo (come nella sezione protocollo 2.3.1.) E incubare a 30 ° C prima di imaging. </li></ol></li></ol></li><li> Le cellule di Imaging di montaggio: <ol><li> Preparare MSL-N pastiglie agarosio 16 fondendo una aliquota in un 95 ° C di calore-blocco per 10-15 minuti e aggiungendo 200 microlitri tra due vetrini separati da distanziali (Figura 1B). Utilizzare distanziatori con uno spessore di ~ 0,5 mm. Per rendere distanziatori, utilizzare strisce ritagliate di cartone, come quello fornito con enzimi di restrizione. </li><li> Pellet 100 microlitri di cellule a 1.000 xg per 1 minuto, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in residuo medio 2-4 microlitri. NON risospendere in terreno fresco come ritardaaccoppiamento. </li><li> Dopo 2-3 minuti rimuovere con cautela distanziali e il vetrino superiore. Se diversi ceppi devono essere montati, preparare la cellula si concentra prima di preparare il pad agarosio. </li><li> Aggiungere 1 ml di cellule per il pad e attendere che il calo inizia l&#39;essiccazione (~ 1 min) prima di coprire con il coperchio slip e sigillatura con VALAP. </li><li> Lasciate che il pad riposare per almeno 30 minuti prima di imaging a 25 ° C o RT. </li><li> Per ottenere una miscela di cellule in varie fasi di accoppiamento, fare un tampone subito dopo lavaggi in MSL-N (vedi Sezione 2.3.) E incubare a 18 ° CO / N (~ 15 ore). Questo approccio è utile per l&#39;imaging cellule nelle fasi di accoppiamento distinte con alta risoluzione temporale o campioni con segnale debole. </li></ol></li></ol> Imaging 3. Live-cell di accoppiamento cellule di lievito <ol><li> Regola immagine Impostazioni di acquisizione. Nota: le impostazioni di acquisizione di immagini qui presentate sono state ottimizzate per la piattaforma DeltaVision composto da una Olympus IX-71 personalizzatomicroscopio invertito con Plan Apo 60X / 1.42 NA o U-Plan Apo 100X / 1.4 obiettivi NA, una macchina fotografica CoolSnap HQ2 e un Insight SSI 7 colori unità combinata illuminatore. L&#39;hardware è controllato da Softworx V4.1.2, che consente anche di autofocus digitale. <ol><li> Assicurarsi che gli intervalli di autofocus non superano 15 min dal Z-deriva nel tempo più lungo può superare la capacità del sistema software autofocus. Se si utilizza un sistema di autofocus basato su hardware, utilizzare intervalli più grandi. </li><li> Regolare intervallo di imaging. Prendere immagini ogni 10 min per ~ 15 hr come punto di partenza quando si lavora con un fluorescente contrassegnati proteine ​​per la prima volta. Questo intervallo offre una buona panoramica di tutto il processo di accoppiamento senza vasta sbiancamento. <ol><li> Immagine con 5 min intervalli più brevi o più precisamente a eventi temporali come la fusione. intervalli più brevi richiedono fluorofori forti che permettono ridotti tempi di esposizione e poco sbiancamento. Per l&#39;imaging con intervalli inferiori a 1 min evitare di O / N microscopiae invece preparare una miscela di tutte le fasi di accoppiamento come descritto nel protocollo sezione 2.4.6. </li></ol></li><li> Regolare il tempo di esposizione dell&#39;immagine. tempi di esposizione di prova tra i 50 e 300 msec. Lo scopo di trovare un equilibrio tra il rapporto e photobleaching segnale-rumore da ottenere un elevato numero di punti temporali con un segnale percepibile (tipicamente oltre 100). </li><li> Regolare Z-sezionamento. Sezioni ogni 0,3 micron che coprono 5 micron di fornire una buona profondità di imaging. Si noti che ulteriori aumenti foto-danni Z-sezionamento, che può essere minimizzata utilizzando il OAI (asse integrazione ottica - un&#39;unica acquisizione spazzata di profondità campione totale). Buon sistema di messa a fuoco automatica riduce la necessità di molti Z-sezioni ed è altamente raccomandato. </li></ol></li><li> Suggerimenti per Studiare comportamenti di accoppiamento Tipo-specifici: <ol><li> Per i ceppi heterothallic, usa h- e h + cellule esprimenti fluorofori distinti, in modo che i due tipi di cellule possono essere distinti. Utilizzare qualsiasi fluoropho geneticamente codificatori espresso come una versione citosolica o fusione di una proteina endogena, anche se abbiamo avuto un buon successo con sfGFP, una variante veloce pieghevole di GFP 17. Proteine ​​endogene di solito sono contrassegnati alla loro locus genomico endogeno per ricombinazione omologa 14. </li><li> Per i ceppi homothallic, esprimere una proteina fluorescente citosolica geneticamente codificato sotto il controllo di promotori specifici tipo di accoppiamento come quelle dei geni dei recettori feromone map3 e MAM2 per guidare l&#39;espressione in cellule P e M rispettivamente. I promotori di map3 e MAM2 sono inattivi durante la crescita vegetativa e sono indotte su di azoto fame 18,19. Costrutti guida l&#39;espressione di GFP citosolico o mCherry sotto il controllo di tali promotori sono generalmente integrati in un locus genomico (ura4, leu1) che non interferisce con la normale progressione del ciclo sessuale 12. </li></ol></li&gt; <li> Usa tipo di accoppiamento specifici fluorofori citosoliche (come nel protocollo sezione 3.2.2) per determinare una tempistica precisa di fusione cellulare visualizzato come il trasferimento del segnale fluorescente da una cellula socio all&#39;altro. </li></ol> 4. Quantificazione di accoppiamento e Fusion efficienze <ol><li> Per quantificare l&#39;accoppiamento e la fusione efficienze 11,12, le cellule del punto subito dopo MSL-N lavare su MSL-N pad agarosio, come al punto 2.3.1, e lasciare per 24 ore a 25 ° C prima di imaging (Figura 1A). Usando questo protocollo una homothallic wild-type efficienza ceppo di accoppiamento raggiunge ~ 60% e l&#39;efficienza di fusione del 99%. Per verificare se qualsiasi riduzione di questi valori osservati nei ceppi mutanti riflettono un fenotipo terminale o un ritardo, ripetere l&#39;esperimento con un tempo di incubazione 36 ore. </li><li> Calcolare l&#39;efficienza di accoppiamento come <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq1.jpg" /> coppie di accoppiamento includono zigoti, ASCI, e le coppie di cellule non fuse identificati dala loro posizione e crescita verso ogni altri. </li><li> Calcolare l&#39;efficienza fusione come <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq2.jpg" /> Nota: accoppiamenti accoppiamento fuso sono identificati dalla loro capacità di formare spore se è noto che il mutante in esame non influenza sporulazione. Se sporulazione non può essere utilizzato come read-out, la fusione è determinata osservando la diffusione di un marcatore citosolico espressa in un solo partner di accoppiamento in entrambi i partner. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Condizioni ambientali, e la disponibilità di nutrienti, in particolare, influenzano pesantemente la fisiologia fissione lievito. L&#39;azoto fame è necessario per l&#39;impegno per la riproduzione sessuale e porta a notevoli cambiamenti nella progressione del ciclo cellulare mitotico (Rif. 21 e Figura 2) inizialmente. Alla rimozione azoto popolazione in crescita esponenziale, dimensione delle celle a divisione diminuisce rapidamente (Figura 2C) e la maggior parte delle cell...

Anche se lo scambio genetico tra due cellule è l&#39;evento centrale nella riproduzione sessuale, si basa su una catena di eventi che promuovono la differenziazione cellulare, permettono di scelta del partner, svolgono la fusione cellula-cellula e mantenere la stabilità genomica. Così il ciclo di vita sessuale si presenta come un sistema modello per studiare una serie di questioni biologiche riguardanti gli interruttori di sviluppo, risposta a stimoli estrinseci, fusione della membrana plasmatica, la segregazione dei cromosomi, ecc Esplorando il lievito di fissione ciclo sessuale di studiare questi fenomeni porta i vantaggi della genetica potenti del sistema modello, ben stabiliti approcci high-throughput e sofisticato microscopio. Sex in fissione lievito è un evento heterotypic tra una P-cellulare e una M-cellula tipi di accoppiamento distinti. I due tipi di cellule in modo differenziale esprimono un numero di geni 1,2, compresi quelli per la produzione del P secreto e M-feromoni, feromone-recettori map3 e MAM2 così come feromone-proteases Sxa1 e Sxa2. Ceppi Homothallic, come il ceppo H90 comunemente usato, trasportano le informazioni genetiche per entrambi i tipi di accoppiamento in un singolo genoma e cellule subiscono un complesso schema di commutazione tipo di accoppiamento nell&#39;intero ciclo mitotico (valutata in Rif. ​​3). Molteplici isolati di heterothallic lievito di fissione che cambiano raramente o mai il tipo di accoppiamento sono comunemente utilizzati 4, il più prominente H + N (P-type) e h -S (tipo M) ceppi. Nel lievito di fissione, l&#39;ingresso nel ciclo di vita sessuale è sotto stretta regolamentazione nutrizionale. Solo le cellule di lievito di fissione azoto-fame arrestano riproduzione mitotico e producono feromoni diffusibili per segnalare la presenza di un partner di accoppiamento e promuovere ulteriori fasi del ciclo sessuale (rivisto in Rif. ​​5). Azoto privazione de-reprime il regolatore trascrizionale chiave di accoppiamento Ste11 che agisce come un interruttore di sviluppo e promuove eXpression di accoppiamento specifici geni tra cui il recettore feromone e il feromone geni di produzione 6,7. Impegno feromone-recettore attiva la proteina recettore accoppiato G-alfa ed a valle di segnalazione MAPK che migliora ulteriormente Ste11 attività trascrizionale 8-10, aumentando così la produzione di feromoni in un feedback positivo tra i partner di accoppiamento. Livelli di feromone sono cruciali per indurre diversi stati di polarizzazione delle cellule regolando l&#39;organizzatore maestro di polarità delle cellule, la Rho-famiglia GTPasi Cdc42 11. Dopo l&#39;esposizione a basse concentrazioni di feromoni, attiva Cdc42 viene visualizzato nella patch dinamici esplorare la periferia cellulare, e nessuna crescita cellulare si osserva in questa fase. I livelli aumentati di feromoni promuovere la stabilizzazione dell&#39;attività Cdc42 ad una singola zona e la crescita di una proiezione polarizzata, chiamata shmoo, che porta le cellule socio a contatto. Successivamente, i due partner di accoppiamento aploidi si fondono per formare uno zigote diploide. Un recente lavoro rivela °e esistenza di una struttura actina nuova essenziale per la fusione che è assemblato dal formin accoppiamento indotta Fus1 12. Questa focalizzazione fusione concentra tipo V miosina processi dipendenti e posiziona il macchinario degrado parete cellulare, permettendo così rimodellamento della parete cellulare per consentire il contatto membrana plasmatica senza lisi cellulare 12. Al momento della fusione cellula-cellula, i nuclei vengono a contatto e sottoposti cariogamia. Un importante dynein-dipendente movimento avanti e indietro del nucleo all&#39;interno della zigote (il movimento coda di cavallo) promuove quindi l&#39;abbinamento di omologhi cromosomi 13,14, che è seguito da meiosi. Infine, i quattro prodotti della meiosi sono confezionati in singole spore durante sporulazione. A causa della sua complessità e le numerose fasi, monitoraggio dettagliato di accoppiamento è stato impegnativo. Due difficoltà notevoli sono che l&#39;intero processo richiede ben oltre quindici ore e che le cellule sono difficili da sincronizzare. questi difficulties sono aggirate da approcci di microscopia unicellulari. Qui un protocollo generale per indagare il ciclo di vita sessuale di lievito di fissione è presentato. Con piccoli aggiustamenti, questo protocollo permette lo studio di tutte le varie fasi del processo, vale a dire l&#39;induzione di accoppiamento prodotto del gene, la polarizzazione delle cellule e abbinamento tra sorelle cellule dopo il passaggio da tipo di accoppiamento e tra i partner non-sorella, la fusione cellula-cellula, e post-fusione coda di cavallo il movimento, la meiosi e sporulazione. Questo metodo permette di 1) facilmente visualizzare fluorescently tag proteine ​​nel corso del tempo pre, durante e post-fusione; 2) discriminare il comportamento delle cellule di tipo opposto accoppiamento; e 3) misura e quantificare parametri come shmooing, l&#39;accoppiamento, la fusione o l&#39;efficienza sporulazione.

<table><tbody><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71381</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>AppliChem</td><td>A2088,0025</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>AppliChem</td><td>A0963,0100</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>AppliChem</td><td>A1716,0100</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>AppliChem</td><td>A0967,0250</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A1038,0250</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A3514,0250</td><td></td></tr><tr><td>Molybdenum oxide (VI) (MoO&lt;sub&gt;3)&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69850</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>AppliChem</td><td>A3872,0100</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A1034,0500</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2344,0500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.01217.1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td></td></tr><tr><td>Adenine Hemisulfat Salt, mini 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126-100G</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7387</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Reactolab</td><td>92045-74-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Reactolab</td><td>7005600</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopy of fission yeast sexual lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

Lievito di fissione la crescita e l&#39;accoppiamento Dynamics dopo la rimozione di una fonte di azoto Come fame di azoto è un prerequisito per l&#39;inizio della riproduzione sessuale in lievito di fissione, il ceppo selvatico homothallic H90 è stato monitorato su passaggio da medio di azoto-privato ricco di azoto (figura 2), seguendo il protocollo descritto nella Figura 1. In breve, le cellule sono state coltivate O / N a fase esponen...

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Microscopia del ciclo di vita sessuale del lievito di fissione | Biologia | Video

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia di lievito di fissione del ciclo di vita sessuale

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Ricerca

Genetica

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Biologia

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualizzazione degli organelli di lievito con marcatori proteici fluorescenti

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Visualizzazione degli organelli di lievito con marcatori proteici fluorescenti

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

Biochimica

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Analisi spazio-temporale di Cytokinetic Eventi in lievito di fissione

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

Congelamento rapido con dispositivo di congelamento a sandwich per una buona conservazione ultrastrutturale di campioni biologici in microscopia elettronica

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Microscopia di lievito di fissione del ciclo di vita sessuale

Riepilogo

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Visualizzazione degli organelli di lievito con marcatori proteici fluorescenti

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Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

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