AV foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado de longo prazo EMBO. Pesquisa no laboratório de Martin é financiado por uma bolsa ERC Starting (GeometryCellCycle) e uma subvenção Science Foundation Nacional Suíço (31003A_155944) para SGM.

análise de microscopia de reprodução sexual levedura 1. Preparação de Meios <ol><li> Prepare meio de esporulação Mínimo (MSL-N) 15 por mistura dos seguintes componentes: Glucose: 10 g / l, KH 2 PO 4: 1 g / L, NaCl: 0,1 g / L, MgSO4 · 7H 2 O: 0,2 g / EU. Adicionar oligoelementos (10.000x): 100 uL / L, vitaminas (1.000X): 1 mL / L, e 0,1 M de CaCl2 &#160; ml / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 e armazenar a temperatura ambiente (RT). <ol><li> Utilize a seguinte Vitaminas (1.000x) da: Pantotenato: 1 g / L, ácido nicotínico: 10 g / l, inositol: 10 g / L, Biotina: 10 mg / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C. </li><li> Use os seguintes elementos-traço (10.000 vezes) inventário: Ácido Bórico: 5 g / L, MnSO4: 4 g / L, ZnSO4 · 7H 2 O: 4 g / L, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 g / l , MoO 3: 0,4 g / L, KI: 1 g / L, CuSO4· 5H 2 O: 0,4 g / l, ácido cítrico a 10 g / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Prepare MSL-N de agarose a 2% (utilizado para fazer câmaras bloco de agarose) combinando 10 ml de N-MSL com 0,2 g de agarose. Derreta para ~ 2 min em alta potência em um forno de microondas até dissolver agarose e alíquotas de 0,5 ml em tubos de microcentrífuga. Armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Prepare meio de esporulação mínima com azoto (MSL + N) do MSL-N através da adição de (NH 4) 2 SO 4: 1 g / L, leucina: 0,225 g / L, adenina: 0,225 g / L, uracilo: 0,225 g / L . Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um. Armazenar à temperatura ambiente. Nota: leucina, adenina e uracilo são adicionados a este meio para permitir o crescimento de estirpes auxotróficas. Suplemento de amino-ácido adicional deve ser incluído se a cepa utilizada carrega uma auxotrofia distinta (por exemplo his3Δ). Observe também que o trabalho com cepas plenamente prototrófica é recomendado, já que apenastais estirpes vai permitir alta eficiência de acoplamento. </li><li> Prepare 200 ml valap para vedação de câmara. Numa proveta de adicionar pesos iguais, de lanolina, vaselina (ou outro vaselina), e parafina. mistura de calor a baixa temperatura e mexa ocasionalmente até ficar bem misturado. Alíquota da mistura em vários pequenos pratos de petri. Armazenar à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Cepas A cultura de fissão de levedura para Experimentos de acoplamento (Figura 1). <ol><li> Dia 1, Evening: Inocular estirpes recém-listradas de meios sólidos em tubos de cultura contendo 3 ml de MSL + N. Use tubos de fundo plano de diâmetro de cerca de 2,5 cm. Use outros tubos de cultura ou de frascos de cultura com um volume adaptado. Incubar durante a noite (O / N) com agitação a 25 ° C, 200 rpm. Se trabalhar com linhagens heterotálicas, inocular separadamente. <ol><li> Dilui-se suspensões de células em meios na manhã seguinte para assegurar que as culturas possuem uma densidade óptica medida a 600 nm (DO600) de 0,4-0,8 durante a noite. Nota:OD 600 medições como um proxy de concentração de células de levedura são lineares no intervalo de cerca de 0,1-1,0. Para o nosso espectrofotómetro OD 600 = 0,1 corresponde a 1,4 x 10 6 culas por ml. Assim, se OD inicial de 600 leituras são fora deste intervalo amostras precisa ser diluído / concentrada para medições confiáveis. </li></ol></li><li> Dia 2, Evening: Dilui-se as células em 20 ml de meio MSL + N para DO600 = 0,025 em frascos de 100 ml. Incubar estirpes de O / N a 30 ° C, 200 rpm. Nota: culturas de células do tipo selvagem deve chegar a OD 600 ~ 0,8 na manhã seguinte (15 horas depois). Se estiver a trabalhar com estirpes com maior tempo de geração ajustar diluição em conformidade. </li><li> Dia 3, Manhã: Medida OD600 para verificar que as culturas têm densidade celular de OD600 ~ 0,8. Se trabalhar com linhagens heterotálicas, misture um número igual de células parceiras. células de pelotas em 1000 xg e transferir para um 1,5 mltubo. Lave as células três vezes em 1 ml de meio MSL-N. Re-suspender as células em 3 ml de meio MSL-N e diluir as células a OD 600 = 1,5. <ol><li> Para monitorar o acasalamento entre as células irmã células montar diretamente para geração de imagens (ver Protocolo Secção 2.4). Use estirpes H90 homotálico, em que tipo de acasalamento de comutação terá lugar durante as divisões mitóticas que ocorrem após a privação de azoto. montagem imediata de células sobre a almofada de agarose assegura que, após a divisão celular, associado células permanecer ao lado do outro. </li><li> Para monitorar a polarização celular (dinâmica exploratórios e shmooing) incubar 1-3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 3-4 h antes de células de montagem para imagiologia. Dentro destas 3-4 horas, terá ocorrido a última divisão mitótica. Algumas células vão ter iniciado a polarização, mas a maioria só vai estar começando sua dinâmica de polarização exploratórios. </li><li> Para monitorizar a fusão célula-célula incubar 1-3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 4-6 h priou a células de montagem para imagiologia. </li><li> Monitorar eventos de fusão pós-incubar 1-3 ml de culturas celulares a 30 ° C, 200 rpm, durante 8 h antes de células de montagem para imagiologia. </li><li> Para monitorar a resposta a uma concentração de feromonas específicas (apenas para estirpes heterotálicas) incubar 3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 3-4 h antes de células de montagem para imagiologia. <ol><li> Retire o tubo de microcentrífuga MSL-N contendo a partir do bloco de calor C 95 ° (ver secção Protocolo 2.4.1. Abaixo). Adicionar P-factor ou factor-M na concentração desejada directamente na agarose MSL-N derretido. Misture bem em vortex antes da preparação pad imediata. </li><li> Após a montagem da célula, a almofada incubar durante 15-30 min a 25 ° C antes da imagiologia. -Factor P e factor-M feromonas foram usadas a partir de uma solução stock de 1 mg / ml em metanol. Nota: Se o trabalho com estirpes mutantes tempos de incubação podem variar. A aglomeração das células pode ocorrer após incubação prolongada em m líquidaEDIA e pode ser particularmente forte em algumas estirpes mutantes. células aglutinados não podem ser manchadas sobre almofadas de agarose em uma única camada e, assim, são difíceis de focagem automática e imagem. Em caso de extenso aglutinação celular células em almofadas de agarose montagem imediatamente após lavagens e re-suspensão em meios-falta de azoto (como no protocolo Secção 2.3.1.) E incubar a 30 ° C antes da imagiologia. </li></ol></li></ol></li><li> Montagem Cells for Imaging: <ol><li> Prepare MSL-N almofadas de agarose a 16 por fusão de uma alíquota num bloco de calor a-95 ° C durante 10-15 min e adicionar 200 ul entre duas lâminas de vidro separadas por espaçadores (Figura 1B). Use espaçadores com uma espessura de 0,5 mm ~. Para fazer os espaçadores, de uso tiras cortadas de cartão, como a que está fornecido com enzimas de restrição. </li><li> Pellet 100 ul de células a 1000 x g durante 1 min, remover o sobrenadante e as células em meio de 2-4 ul residual re-suspender. Não re-suspensão em meio fresco em que atrasaacasalamento. </li><li> Após 2-3 min remova cuidadosamente os espaçadores e a lâmina de vidro superior. Se várias cepas são para ser montado, prepare a célula se concentra antes de preparar a almofada de agarose. </li><li> Adicionar 1 ml de células para a almofada e esperar até a queda começa secagem (~ 1 min) antes de cobrir com tampa de deslizamento e selando com valap. </li><li> Deixe que a almofada de se sentar durante pelo menos 30 min antes de imagem a 25 ° C ou TA. </li><li> Para se obter uma mistura de células em vários estágios de acasalamento, fazer uma almofada imediatamente após lavagens em MSL-N (ver secção 2.3.) E incuba-se a 18 ° CO / N (~ 15 h). Essa abordagem é útil para geração de imagens de células em fases distintas de acasalamento com alta resolução temporal ou amostras com sinal fraco. </li></ol></li></ol> Imagem 3. Em células vivas de células de levedura de acoplamento <ol><li> Ajustar as Definições de aquisição. Nota: As configurações de aquisição de imagem aqui apresentados foram otimizados para a plataforma DeltaVision composto por uma personalização Olympus IX-71microscópio invertido com o Plano de Apo 60X / 1,42 NA ou U-Plano de Apo 100X / 1,4 objectivos de NA, uma câmera CoolSnap HQ2 e um 7 cores introspecção SSI unidade combinada iluminador. O equipamento é controlado por softWoRx v4.1.2 que também permite a auto-focagem digital. <ol><li> Assegure-se que os intervalos de focagem automática não excedam 15 min uma vez que o Z-tração sobre um tempo mais longo pode ultrapassar a capacidade do sistema de auto-focagem de software. Se estiver usando um sistema de focagem baseada em hardware, use intervalos maiores. </li><li> Ajuste o intervalo de imagem. Captar imagens a cada 10 minutos para ~ 15 hr como ponto de partida quando se trabalha com uma proteína fluorescente etiquetado pela primeira vez. Este intervalo fornece uma boa visão geral de todo o processo de acasalamento, sem branqueamento extensivo. <ol><li> Imagem com intervalos de 5 min ou mais curtas para mais precisamente eventos de tempo, como a fusão. intervalos mais curtos exigem fluoróforos fortes que permitam baixos tempos de exposição e pouco branqueamento. Para geração de imagens com intervalos inferiores a microscopia de 1 min evitar O / Ne em vez disso se preparar uma mistura de todas as fases de acoplamento tal como detalhado na Secção 2.4.6 Protocolo. </li></ol></li><li> Ajustar a imagem tempo de exposição. tempos de exposição de teste entre 50 e 300 ms. Destinam-se a estabelecer um equilíbrio entre a relação sinal-ruído e fotodegradação de alcançar um grande número de pontos de tempo com um sinal perceptível (normalmente mais de 100). </li><li> Ajustar Z-seccionamento. Secções cada 0,3 pm, cobrindo 5 uM fornecer uma boa profundidade da imagem. Note-se que aumenta ainda mais foto-lesão de corte Z, que podem ser minimizados através da utilização do OAI (integração eixo óptico - aquisição de um único varrimento da profundidade total da amostra). Bom sistema de foco automático reduz a necessidade de muitas Z-seções e é altamente recomendado. </li></ol></li><li> Dicas para estudar comportamentos específicos-Type Acasalamento: <ol><li> Para as estirpes heterotálicas, usar H- e H + células expressando fluoróforos diferentes, de modo que os dois tipos de células podem ser distinguidas. Use qualquer fluoropho geneticamente codificadoestá expresso como uma versão citosólica ou fusão de uma proteína endógena, embora tenhamos tido um bom sucesso com sfGFP, uma variante de dobrar rápida de GFP 17. Proteínas endógenas são geralmente etiquetado no seu local genómico endógeno por recombinação homóloga 14. </li><li> Para as estirpes homotálico, expressar uma proteína citosólica fluorescente geneticamente codificado sob o controlo de promotores específicos do tipo de acasalamento, tais como os dos genes de receptores de feromonas map3 e mam2 para conduzir a expressão em células P e M, respectivamente. Os promotores de map3 e mam2 estão inativas durante o crescimento vegetativo e são induzidas mediante privação de nitrogênio 18,19. Constructos de condução da expressão de GFP citosólico ou mCherry sob o controlo de um destes promotores são tipicamente integrados num locus genómico (ura4, Leu1) que não interfere com a progressão normal do ciclo de vida sexual 12. </li></ol></li&gt; <li> Use tipo de acasalamento fluoróforos citosólicas específicas (como na Seção Protocolo 3.2.2) para determinar o sincronismo preciso de fusão celular visualizado como a transferência de sinal fluorescente de uma célula parceiro para o outro. </li></ol> 4. Quantificação de acasalamento e fusão Eficiências <ol><li> Para quantificar a eficiência de fusão e de acoplamento 11,12, células no local directamente após MSL-N de lavagem sobre MSL-N almofadas de agarose, tal como no passo 2.3.1, supra, e deixar durante 24 horas a 25 ° C antes da imagiologia (Figura 1A). Usando este protocolo um tipo selvagem estirpe eficiência de acoplamento homotálico ~ atinge 60% e a eficiência de fusão de 99%. Para testar se qualquer redução nestes valores observados em estirpes mutantes reflectir um fenótipo terminal ou um atraso, repetir a experiência com um tempo de incubação 36 h. </li><li> Calcular a eficiência de acasalamento como <img alt="equação1" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq1.jpg" /> pares de acasalamento incluem zigotos, asco, e pares de células não fundidas identificados a partir desua posição e crescimento para cada um dos outros. </li><li> Calcular a eficiência de fusão como <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq2.jpg" /> Nota: pares de acasalamento fundidas são identificados pela sua capacidade de formar esporos, se for conhecido que o mutante sob estudo não influencia a esporulação. Se a esporulação não pode ser utilizado como leitura para fora, a fusão é determinada através da observação da propagação de um marcador citosólica expressa em apenas um dos parceiros de acoplamento em ambos os parceiros. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

condições ambientais e disponibilidade de nutrientes em particular, afetam fortemente a fisiologia da levedura de fissão. Privação de nitrogênio é necessário para compromisso com a reprodução sexual e, inicialmente, leva a mudanças marcantes na progressão do ciclo celular mitótico (Ref. 21 e Figura 2). Após a remoção do azoto população em crescimento exponencial, o tamanho das células em divisão diminui rapidamente (Figura 2C) e a maioria das células dete...

Apesar de intercâmbio genético entre duas células é o evento central na reprodução sexual, ele depende de uma cadeia de eventos que promovem a diferenciação celular, permitem a escolha do parceiro, realizar a fusão célula-célula e manter a estabilidade genômica. Assim, o ciclo de vida sexual se apresenta como um sistema modelo para estudar uma série de questões biológicas sobre interruptores de desenvolvimento, resposta a estímulos extrínsecos, a fusão da membrana plasmática, segregação cromossômica, etc. Explorando a levedura ciclo sexual para estudar esses fenômenos traz os benefícios da genética poderosos do sistema modelo, bem estabelecida abordagens de alto rendimento e de microscopia sofisticado. Sexo em levedura é um evento heterotípica entre uma célula e um P-célula M de tipos de cruzamento distintos. Os dois tipos de células expressam diferencialmente uma série de genes de 1,2, incluindo aqueles para a produção do ácido P- segregada e M-feromonas,-receptores de feromonas map3 e Mam2 bem como feromona-Proteases Sxa1 e Sxa2. Homotálico estirpes, tais como a estirpe H90 comumente utilizado, transportar a informação genética para os dois tipos de acasalamento em um único genoma e as células sofrem um padrão complexo de tipo de acasalamento de comutação ao longo do ciclo de vida do mitótico (revisto em Ref. 3). Vários isolados de levedura heterotálicas que raramente ou nunca mudar tipo de acasalamento também são comumente utilizados 4, o mais proeminente o h + N (P-tipo) e as cepas h S (M-tipo). Em levedura, a entrada no ciclo de vida sexual está sob regulação nutricional rigorosa. Apenas células de levedura de fissão deficientes em nitrogênio prender reprodução mitótico e produzir feromônios difusï¿½eis para sinalizar a presença de um parceiro de acasalamento e promover novas etapas do ciclo sexual (revisto em Ref. 5). privação de azoto de-reprime o regulador transcricional chave de Ste11 de acoplamento que funciona como um interruptor de desenvolvimento e promove expression de acasalamento genes específicos, incluindo o receptor de feromônio e o feromônio genes de produção de 6,7. Engajamento-receptor de feromônio ativa a proteína-acoplado receptor G-alfa e de sinalização MAPK a jusante que aumenta ainda mais Ste11 atividade transcricional 8-10, aumentando assim a produção de feromônio em um feedback positivo entre os parceiros de acasalamento. Níveis de feromonas são cruciais para induzir diferentes estados de polarização celular, regulando o organizador mestre da polaridade celular, a Rho-família GTPase Cdc42 11. Após a exposição a baixas concentrações de feromonas, Cdc42 activo é visualizado em manchas dinâmicos explorando a periferia da célula, e nenhum crescimento de células é observada nesta fase. níveis de feromônio aumento promover a estabilização da actividade Cdc42 a uma única zona e crescimento de uma projeção polarizada, denominado o shmoo, que traz células parceiras em contato. Posteriormente, os dois parceiros de acasalamento haplóide fundir para formar um zigoto diplóide. Um trabalho recente revela the existência de uma estrutura nova actina essencial para a fusão que é montado pela formin induzida por acasalamento FUS1 12. Este enfoque de fusão concentra processos dependentes tipo V-miosina e posiciona a maquinaria degradação da parede celular, permitindo, assim, a remodelação da parede celular para permitir o contacto da membrana plasmática, sem lise celular 12. Após a fusão célula-célula, os núcleos entram em contato e passam por cariogamia. Um movimento de vai-e-vem dependente da dineína proeminente dentro do núcleo do zigoto (o movimento do cavalo-cauda), em seguida, promove o emparelhamento de homólogos do cromossoma 13,14, que é seguido por meiose. Finalmente, os quatro produtos de meiose são embalados em esporos individuais durante a esporulação. Devido à sua complexidade e os numerosos passos envolvidos, monitoramento detalhado do acasalamento tem sido um desafio. Duas dificuldades notáveis ​​são que todo o processo leva bem mais de 15 horas e que as células são difíceis de sincronizar. estes difficulties são contornadas por abordagens de microscopia de uma única célula. Aqui um protocolo geral para investigar o ciclo de vida sexual na levedura de fissão é apresentado. Com pequenos ajustes, este protocolo permite o estudo de todas as diferentes etapas do processo, ou seja, a indução de produto do gene de acasalamento, a polarização celular e emparelhamento entre irmãos células após tipo de acasalamento de comutação e entre os parceiros não-irmã, a fusão célula-célula, e pós-fusão horse-tail movimento, a meiose e esporulação. Este método permite 1) visualizar facilmente fluorescente etiquetado proteínas ao longo do tempo pré, durante e pós-fusão; 2) discriminar o comportamento das células do tipo de cruzamento oposto; e 3) medir e quantificar parâmetros como shmooing, mating, fusão ou eficiência esporulação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:219px;">Glucose</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:108px;">G8270-10KG</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05108.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pantothenate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2088,0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nicotinic Acid</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0963,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Inositol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1716,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Biotin</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0967,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MnSO4</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1038,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FeCl2.6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3514,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molybdenum oxide (VI) (MoO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">KI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3872,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CuSO4.5H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1034,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Citric Acid&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2344,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01217.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Adenine Hemisulfat Salt, mini 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Uracil&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Lanolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vaseline</td>
			<td>Reactolab</td>
			<td>92045-74-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraffin</td>
			<td>Reactolab</td>
			<td>7005600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy of fission yeast sexual lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

Fissão crescimento do fermento e Acasalamento Dynamics após a remoção da fonte de nitrogênio Como privação de nitrogênio é um pré-requisito para o início da reprodução sexual na levedura de fissão, estirpe de tipo selvagem H90 homotálico foi monitorada mediante mudança de para médio privado de azoto rico em nitrogênio (Figura 2), seguindo o protocolo apresentado na Figura 1. Resumidamente, as células foram cultivadas O ...

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Microscopia do ciclo de vida sexual da levedura de fissão | Biologia | Vídeo

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

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14.4K visualizações.  University of Lausanne. We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process. 

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Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Biologia

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Levedura Método Embedding Colony

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purificação cromatográfica de Ribossomos Yeast Highly Active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci14. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).
The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a "spore discharge assay", which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.
F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain1. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexual crosses and isolation of recombinant progeny are important research tools for the filamentous fungus, Fusarium graminearum, The techniques necessary successfully carry out these processes are presented.

Desenvolvimento Sexual e descarga de ascósporos em Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Espalhando superfície e Immunostaining de cromossomas da levedura

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Análise espacial e temporal da Cytokinetic Eventos na levedura de fissão

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...