We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

Hôpital Maisonneuve-Rosemont - Protokolle für alle Tierstudien wurden von der Animal Care Committee am Centre de recherche genehmigt. 1. Die Ernte Maus Thymus für Herstellung von Thymus-Scheiben und Einzelzellsuspensionen <ol><li> Euthanize die Maus mit CO 2 durch Genickbruch folgte. </li><li> In einer Laminar-Flow-Haube, Pin mit der Maus Bauchseite zu einer Dissektion Brett. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Entfernen überschüssigen Alkohols durch Abtupfen mit Gaze ethanol vom Eintritt in den Brusthöhle zu verhindern und um das Gewebe zu beschädigen. </li><li> Heben Sie die Haut an der Unterseite des Brustbeins mit einer Pinzette und einen Schnitt durch die Haut. Erweitern Sie den Schnitt der Haut nach oben in jedem forelimb. </li><li> Machen Sie einen zusätzlichen Schnitt an der Basis des Brustbeins die Membran aus dem Brustkorb zu trennen. Dann schneiden Sie jede Seite des Brustkorbs in Richtung des Schlüsselbeins. Klappen Sie den Brustkorb über in Richtung des Kopfes der Brusthöhle ausgesetzt wird. Die beiden LappenThymus liegen auf der Oberseite des Herzens. </li><li> Entfernen Sie das Bindegewebe um den Thymus Lappen mit einer Pinzette, Mikro-Dissektion Schere und / oder scharf gebogenen Schere. Verwenden Sie ein Paar feine Spitze gebogenen Pinzette die einzelnen Lappen zu heben von unten oder über Bindegewebe bleiben. Hinweis: Verwenden Sie nicht den Thymus direkt erfassen. </li><li> Legen Sie die Thymus Lappen in einem 15 ml konischen Röhrchen mit PBS und beiseite stellen auf Eis, bis sie benötigt. </li></ol> 2. Agarose Embedding und Vibratom Aufschneiden von Thymic Lobes <ol><li> Bereiten Sie 4% igen Lösung für die Einbettung durch Lösen von 2 g mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in 50 ml sterilem PBS und microwaving auf eine niedrige Einstellung, bis die Agarose vollständig gelöst hat. Decken Kolben mit Alufolie und in einem Wasserbad bei 55 ° C bis zur Verwendung. </li><li> In einem Gewebekulturabzug, herzustellen vollständigem RPMI-1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum (FBS), 4 mM L Glutamin, 1x Penicillin / Streptomycin enthält, und 10 &amp; mgr; M2-Mercaptoethanol. </li><li> 1,5 ml vollständiges RPMI-1640-Medium pro Vertiefung zu einer 6-Well-Zellkulturplatte und legen einen Zellkultureinsatz in jeder Vertiefung. Stellen Sie den Teller zur Seite in einem Inkubator bei 37 ° C, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Sie einen matschigen Eiswasser-Bad mit Wasser und Eis in einem Eiskübel. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig alle restlichen Bindegewebe um jede feine Spitze Pinzette Thymus Lappen. Tun Sie dies, während der Thymus Lappen in PBS in einer Gewebekulturschale eingetaucht ist, nach der Übertragung auf ein Gewebe mit PBS getränkten Wischtuch, oder unter einem Binokular. </li><li> Lassen Sie die Agarose unter 40 ° C abkühlen, wenn der Kolben nur warm anfühlt ist, zu vermeiden, dass die Gewebe Überhitzung. Gießen des abgekühlten 4% Agarose in eine Gewebeform bis zu einer Höhe von ca. 1 cm. </li><li> Verwenden Sie ein Paar Pinzette vorsichtig den Thymus Lappen auf ein Gewebe übertragen wischen und rollen Sie sie vorsichtig, um zu trocknen, ohne das Gewebe zu schädigen. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe trocknet vollständig oder es wird aus dem Agarose gleiten während des Schneidens. </li><li> Schieben Sie die Lappen in die Agarose und positionieren sie entweder horizontal (zur Erhöhung der Oberfläche jeder Scheibe) oder vertikal (zur Erhöhung der Anzahl der Scheiben) am unteren Ende der Form. Legen Sie die Form in Eiswasser für 5-10 min die Agarose zu ermöglichen, sich zu verfestigen. </li><li> Während dieser Zeit bereiten die Vibratom zum Schneiden von Pufferwanne Montage, die Montage des Objektplatte und Einsetzen des Vibratom Klinge. Legen Sie ein Stück Labor Band auf der Probenscheibe. Sterilisieren Sie die sauber, montiert Arbeitsplatz mit 70% Ethanol. </li><li> Nachdem die Agarose erstarrt, invertieren die Form und drücken Sie sanft in seiner Mitte die Agarose eingebettet Lappen freizugeben. </li><li> Mit einem scharfen Messer die überschüssige Agarose rund um die Lappen zu verlassen ~ 2 mm Agarose zu trimmen auf jeder Seite und ~ 0,5 cm an der Unterseite. </li><li> Sichern Sie sich Agaroseblock mit einem Tropfen Gewebekleber auf das Stück Klebeband auf der Probenscheibe. Mehrere Blöcke können auf das Band geklebt werden. </li><li> Richten Sie die Vibratom Klinge with die Spitze des Agaroseblock. Füllen Sie den Pufferwanne mit sterilem PBS, bis die Klinge und Agarose-Block (s) vollständig eingetaucht sind. </li><li> Abschnitt die Agarose eingebetteten Gewebeschnitten mit einer Dicke von 400 bis 500 &amp; mgr; m zu erhalten. Stellen Sie die Vibratom bis 0.225 mm / s Geschwindigkeit, Frequenz von 100 Hz und 5 ° Winkel. </li><li> Verwenden Sie einen gebogenen Spatel die Thymus-Scheiben in eine Gewebekulturplatte mit steriler PBS zu sammeln, wie sie geschnitten werden. Entsorgen Sie die erste und die letzte Scheibe. </li><li> Untersuchen Sie die Scheiben unter einem Lichtmikroskop mit 4-facher Vergrößerung. Wählen Sie die Scheiben mit intakten Thymusgewebes und umgebende Agarose (1A). </li><li> Übertragen Sie die Scheiben auf der Platte vorbereitet in Schritt 2.3 durch eine Pipettenspitze vorsichtig die Thymus-Scheibe aus dem gebogenen Spatel auf die Zellkultureinsatz zu gleiten. Jeder Einsatz kann ~ 3 Scheiben aufnehmen. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben berühren einander nicht oder die Zellkultureinsatz Wände. </li><li> Pflegen Sie die Platte bei 37 ° C, bis sie benötigt. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Herstellung von Thymozyten zum Umlegen <ol><li> Isolieren thymic Keulen wie in 1 beschrieben die Lappen Dissociate manuell eine Einzelzellsuspension unter Verwendung einer sterilisierten 15 ml Gewebemühle mit 5 ml steriler PBS, enthaltend 2% FBS gefüllt zu machen. Übertragen, um die Zellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1x ACK - Lysepuffer (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA) bei Raumtemperatur für 3 min roten Blutkörperchen zu lysieren. </li><li> Das Rohr wird bis 15 ml mit PBS 2% FBS enthält. Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml PBS, enthaltend 2% FBS und Pass-Zellen durch ein 255 &amp; mgr; m-Mesh-Filter. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C und Resuspendieren des Zellpellets in PBS, enthaltend 2% FBS bei einer Konzentration von 1 x 10 7 Zellen pro ml. </li><li> Beschriften Sie die Zellen mit Zellfarbstoffe wie Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) nach Herstellerprotokolle, wenn nicht Thymozyten von Mäusen, die congenic Markern oder genetisch fluoreszierenden Reporter codiert zu unterscheiden von Scheibe körpereigenen Zellen. </li><li> Nach dem letzten Waschen der markierten Zellen, Zellpellet in komplettem RPMI-1640 - Medium bei 1-3 x 10 6 Zellen pro 15 ul. </li></ol> 4. Übereinander Thymozyten auf den Thymus Scheiben <ol><li> rund um die Thymus-Scheiben auf dem Einsatz Verwenden Sie eine Pipette jede Flüssigkeit abzusaugen. Hinweis: Achten Sie darauf, zu vermeiden, die Agarose zu beschädigen. Wenn die Agarose beschädigt wird, werden die überlagerten Thymozyten nicht durch den Verlust von Oberflächenspannung der Schichtoberfläche anschließen. </li><li> Ohne die Scheibe mit der Pipettenspitze berühren, Overlay 15 ul Thymozyten in Abschnitt 3 hergestellt, auf jede Thymus in Scheiben schneiden. </li><li> Inkubieren Sie die plate bei 37 ° C für 2 h, damit die Zellen in die Thymus-Scheiben zu migrieren. </li><li> Nach 2 Stunden, spülen Sie die Thymus-Scheiben 3-mal mit 1 ml PBS Überschuss überlagertem Thymozyten zu entfernen, die noch nicht in das Gewebe gewandert sind. </li><li> Die Platte bei 37 ° C, bis die Thymus-Scheiben bereit sind, geerntet werden, in der Regel 1-72 Stunden je nach Experiment. </li></ol> 5. Die Dissoziation von Thymic Scheiben für die Durchflusszytometrie <ol><li> Bereiten Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen für jede Scheibe durch Zugabe von 150 ul PBS, das 2% FBS. </li><li> 1 ml PBS, enthaltend 2% FBS auf das Gewebekultureinsatz mit den Thymus Scheiben und sanft rühren mit einem gebogenen Spatel die Scheiben von der Oberfläche der Zellkultureinsatz zu lösen. </li><li> Übertragen Sie die Scheibe aus dem Einsatz auf dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem gebogenen Spachtel. </li><li> Manuell stören die Scheibe ein Mikrozentrifugenröhrchen Probe zerstoßen. Zugabe von 150 &amp; mgr; l PBS, enthaltend 2% FBS auf ein Endvolumen von 300ul. </li><li> Filtern Sie das dissoziierte Gewebe durch ein 40 um-Filter in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Die gefilterten Zellen sind bereit für die Durchflusszytometrie - Analyse gefärbt werden 40. </li><li> Filterzellen ein zweites Mal, bevor sie auf einer Flussdurchlass Zytometer um sicherzustellen, daß all die Agarose entfernt und verstopft nicht Durchflusszytometers. </li><li> Erwerben Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer und Analyse von Daten , wie zuvor 40 beschrieben wurde. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Thymus Scheiben und repräsentative Ergebnisse effizienter positive und negative Selektion von überlagerten Vorselektion MHC-Klasse-I-restringierten TCR transgene Thymozyten durch Durchflusszytometrie. Dieses System wurde mit ähnlichem Erfolg verwendet , um eine positive Selektion von MHC - Klasse - II-restringierte CD4 + T - Zellen von Vorselektion DP Thymozyten 32 und, in Gegenwart von Agonist - Antigen, negative Selektion und thymic T...

T - Zellen differenzieren durch eine Reihe von Entwicklungs Intermediate in den Thymus während welcher Zeit sie mehrere Prüfpunkte auftreten, die die Erzeugung eines funktionellen, selbst tolerant T - Zell - Repertoire 1-3 gewährleisten. Positive Selektion fördert das Überleben von Thymozyten mit T - Zell - Rezeptoren (TCR) in der Lage zu erkennen, mit geringer bis moderater Affinität, Peptid durch Haupthistokompatibilitätskomplex - Moleküle (MHC) auf die kortikale Thymusepithelzellen (cTEC) 2,3 dargestellt. Negative Selektion und regulatorischen T (T reg) Zellentwicklung trägt zur Schaffung der Selbsttoleranz über die Eliminierung oder Abzweigung von Thymozyten , die stark auf Selbst Peptid reagieren presented by MHC 2,4. Unreife CD4 + CD8 + doppelt positiven (DP) Thymozyten TCRs exprimieren, die den Auswahlprozess unterscheiden sich zu reifen T - Zell - Subpopulationen, die meisten davon sind MHC - Klasse - I-restringierte CD8 + zytotoxische passierenoder MHC - Klasse - II-restringierten CD4 + Helfer einzigen positiven (SP) T - Zellen, bevor die Thymusdrüse austretenden Effektor - Funktionen in den sekundären lymphatischen Organen 1-3 auszuführen. Zusätzlich zu der Komplexität der T - Zell - Entwicklung ist die dynamische Migration und zelluläre Begegnungen von Thymozyten ganzen Stromazellen Netzwerk 5-9 entwickeln. Diese Stromazellen spielen verschiedene Rollen in Thymozyten Entwicklung und zwischen den Thymus kortikalen und medullären Regionen unterschiedlich verteilt , in denen positive und negative Selektion 10 auftreten. Obwohl positive Selektion in erster Linie in der Rinde nimmt, gibt es vermehrt Hinweise, dass DP Thymozyten zur Medulla migrieren und weiterhin TCR-Signale zu verlangen, bevor sie sich zu reifen T-Zellen differenzieren was darauf hindeutet, dass die Medulla notwendig, zusätzliche Signale für die Fertigstellung der positiven Selektion und Abstammung liefern kann Differenzierung 11,12. Des Weiteren,Erleichtern Deletion autoreaktiver Thymozyten 13,14 trotz der Anwesenheit von spezialisierten Mark Thymus - Epithelzellen (mTEC) , die und Gegenwart gewebe beschränkt Antigene exprimieren, ein großer Teil der negativen Selektion auftritt in der Hirnrinde in Reaktion auf ubiquitär exprimierten Selbst Peptid präsentiert von dendritischen Zellen 15,16. So müssen genaue Modelle der T-Zell-Entwicklung stellen eine äußerst Thymus Mikro organisiert, mit intakter Rinde und Mark Regionen, die die Interaktion zwischen Thymozyten und Stromazellen erleichtert und unterstützt thymocyte Migration, da diese Zellen positive und negative Selektion unterzogen werden. Zur Ergänzung der ex vivo - Analysen von Thymozyten als Mittel zum Studium positive und negative Selektion, eine Reihe von in vitro, in situ und in vivo Modelle der T - Zellentwicklung wurden 17-22 entwickelt. Es war notorisch schwierig zu rekapitulierenpositive Selektion in vitro, aber Co - Kultur von Stammzellpopulationen oder T - Zell - Vorläufer mit Stromazellen Notch - Liganden exprimieren, insbesondere OP9-DL1 / 4 - Zellen, hat die Fähigkeit , T - Linie Engagement und begrenzte positive Selektion macht es einen unschätzbaren in - vitro - Modell zu unterstützen, Studie T - Zell - Entwicklung 23-25. Einschränkungen dieses Systems gehören jedoch die Tatsache, dass diese Zellen die einzigartige Peptid Maschinen für die Verarbeitung fehlt in Thymus-Stroma-Zellen und die dreidimensionale Thymus-Mikroumgebung gefunden. Obwohl technisch umständlich, in situ und in - vivo - Modellen von Thymus - Auswahl einige der Barrieren in Bezug auf in - vitro - Systemen zu überwinden. Reaggregieren Thymus - Organkulturen (RTOC) enthalten Mischungen von Thymozyten und Thymus - Stroma - Zellen 18,26,27 definiert. Diese Thymus-Epithelzellen-reaggregates halten MHC-Klasse-I und II-Expression und developme unterstützennt beider herkömmlichen Zelluntergruppen T, aber immer noch kortikalen und medullären Strukturen nicht ausreichend definiert. Fötalem Thymus - Organkultur (FTOC) ist ein beliebtes Modell der T - Zell - Entwicklung , die mit Thymozyten über hanging-drop Kultur lymphodepleted Thymus Lappen oder durch Injektion von Thymozyten in lymphoreplete thymic Keulen und unterstützen effiziente Entwicklung von CD4 + und CD8 + T ausgesät werden können Zellen im Laufe der Zeit in Kultur 18,28-31. Bei Beginn der Kultur von fötalen Thymus Lappen gibt es einen Mangel von mTEZ, aber definierten kortikalen und medullären Strukturen können im Laufe der Zeit in Abhängigkeit von Bedingungen zu entwickeln. Eine wichtige Überlegung ist, dass dieses Modell bevorzugt im Vergleich zu Erwachsenen-T-Zell-Entwicklung fötalen unterstützen. Schließlich ist intrathymischen Injektion von definierten Thymus-Vorstufen in erwachsenen Mäusen technisch anspruchsvoll, aber stellt klar, eine Umgebung zu unterstützen T - Zell - Entwicklung in vivo. Diese in situ und in - vivo - Modelle sind hervorragende Werkzeuge to Studie T-Zell-Entwicklung und ihre Verwendung sollte an einem Experiment-by-Experiment Basis betrachtet werden. Thymus - Scheiben haben sich jedoch heraus kürzlich als vielseitiges, komplementärer Modell thymic Auswahl in situ mit der Möglichkeit zu untersuchen einzigartig, komplex aufzunehmen, und in der Regel einen höheren Durchsatz Experimenten. Thymus - Scheiben , die Integrität der kortikalen und medullären Regionen zu erhalten und einen Rahmen von Stromazellen bereitzustellen , die Thymozyten Migration während der Entwicklung sowie effiziente positive und negative Selektion 11,32-39 unterstützt. Thymocyte Subsets oben auf Thymus - Scheiben wandern in das Gewebe und in die entsprechenden Mikroumgebungs Nische 34,37 hinzugefügt. Das überlagerte Thymozyten aus Thymus-slice endogene Zellen über kongenen Marker oder Fluoreszenzmarkierungen unterschieden werden und kann in Kultur für mehrere Tage aufrechterhalten werden. Thymic Scheibe organotypischen Kulturen können verwendet werden, um verschiedene Aspekte zu studierenvon T-Zell-Entwicklung, einschließlich Thymus-Selektion, Thymozyten Verhalten (Migration und zellulären Wechselwirkungen) und Thymocyten-Lokalisierung, unter anderem. In Anbetracht der Fähigkeit ~ 20 Thymus - Scheiben zu erzeugen pro Maus, ist die Skalierbarkeit von Experimenten im Allgemeinen größer als andere in situ Modelle von Thymus - Auswahl. Obwohl die Herstellung von Thymus slices spezialisierte Ausrüstung erfordert, wie dem Vibratom und die Lebensdauer der Thymus-Scheiben in Kultur begrenzt ist, zu einem Verlust von Zellen im Laufe der Zeit über den Zelltod aufgrund und das Fehlen einer einkapselnden Membran bereitzustellen thymic Scheiben ein ausgezeichnetes Modell zur Analyse von Thymus Auswahl von synchronisierten Populationen von Thymozyten innerhalb eines reifen Thymus-Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Herstellung von Thymus-Scheiben (einschließlich Ernten des Thymus, Agarose Einbettung von Thymus Lappen und Vibratom Schnitte des eingebetteten Gewebe), Isolation und Überlagerung von Thymozyten und Dissoziation von Thymus-Scheiben für die Durchflusszytometrie-Analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50080</td>
			<td>Low melting temperature agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td>
			<td>Polyciences</td>
			<td>18986</td>
			<td>22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Prep Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m Cell Culture Inserts&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-glutamine</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-110</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F19922-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Inox Tip</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td>Fine tip curved forceps, size .17&#160;X .10mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5090&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

Thymic Auswahl erfolgt in einem einzigartigen und Thymus - Mikro hoch organisierte was zur Erzeugung eines funktionellen, selbst tolerante T - Zell - Repertoires. In - vitro - Modellen T - Linie Engagement und Entwicklung zu studieren , haben wertvolle Einblicke in diesen Prozess. Jedoch fehlt es diesen Systemen die vollständige dreidimensionale thymic milieu notwendig T - Zell - Entwicklung und sind daher unvollständig Approximationen in vivo Thymus - Selektion. Einige der Herausforderungen im Zusammenhang mit Modellierung T - Zell - Entwicklung kann durch die Verwendung in situ Modelle überwunden werden , die eine intakte Thymus - Mikroumgebung schaffen , die vollständig Thymus Auswahl der Entwicklung eines T - Zellen unterstützt. Thymic Scheibe organotypischen Kulturen ergänzen in - situ - Techniken existieren. Thymus-Scheiben, die Integrität der Thymus kortikalen und medullären Regionen erhalten und eine Plattform Entwicklung von überlagerten Thymozyten einer definierten Entwicklungsstadium oder endogener T c zu studierenells innerhalb eines reifen Thymus-Mikroumgebung. Aufgrund der Fähigkeit, ~ 20 Scheiben zu erzeugen pro Maus, präsentieren Thymus-Scheiben einen einzigartigen Vorteil in Bezug auf Skalierbarkeit für Hochdurchsatz-Experimenten. die Vielseitigkeit dieses Verfahren weiter verbessert die relative Leichtigkeit thymic Scheiben und Potential bei der Erzeugung von verschiedenen Thymus Subsets oder andere Zellpopulationen aus verschiedenen genetischen Hintergründen zu überlagern. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Thymus Scheiben, Isolierung und Überlagerung von Thymozyten und Dissoziation von Thymus-Scheiben für die durchflusszytometrische Analyse. Dieses System kann auch als auch visualisieren Thymozyten Migration, Thymozyten-stromal Zell-Wechselwirkungen und TCR-Signale mit Thymus Auswahl durch Zwei-Photonen-Mikroskopie assoziiert zu studieren nicht-konventionellen T-Zell-Entwicklung angepasst werden.

Thymus slices Unterstützung Analyse verschiedener Aspekte der T-Zell-Entwicklung, wie beispielsweise positive und negative Selektion. Für eine erfolgreiche Versuche, die Qualität des Thymus-Scheibe von größter Bedeutung. Somit sollte thymic Scheiben untersucht werden , um die Integrität des Thymusgewebe zu gewährleisten , und dass die Agarose die Thymus - slice (1a Abbildung) intakt umgibt. Oberflächenspannung kann beeinträchtigt werden, wenn ...

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Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Wir beschreiben die Herstellung von Thymus-Scheiben, die in Kombination mit Durchflusszytometrie verwendet werden können positive und negative Selektion der Entwicklung T-Zellen zu modellieren. Thymus Scheiben können auch für die in situ - Analyse von Thymozyten Migration, Lokalisierung angepasst werden und Signalisierung über Immunofluoreszenz und Zwei-Photonen - Mikroskopie.

Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Aufrufe.  Hôpital Maisonneuve-Rosemont.  Wir beschreiben die Herstellung von Thymus-Scheiben, die in Kombination mit Durchflusszytometrie verwendet werden können positive und negative Selektion der Entwicklung T-Zellen zu modellieren. Thymus Scheiben können auch für die in situ - Analyse von Thymozyten Migration, Lokalisierung angepasst werden und Signalisierung über Immunofluoreszenz und Zwei-Photonen - Mikroskopie. 

Serie: Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

Ableitung von Thymuslymphom T-Zell-Linien aus Atm - / -</sup Und P53 - / -</sup Mäuse

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

Schnelle Diagnose der Aviären Influenza Virus bei Wildvögeln: Verwendung eines tragbaren rRT-PCR und gefriergetrocknet Reagenzien in das Feld

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates epithelial differentiation. There are many uses for this system. For instance, the ability to grow three-dimensional organotypic raft cultures of keratinocytes has been an important milestone in the study of human papillomavirus (HPV)1. The life cycle of HPV is tightly linked to the differentiation of squamous epithelium2. Organotypic epithelial raft cultures as demonstrated here reproduce the entire papillomavirus life cycle, including virus production3,4,5. In addition, these raft cultures exhibit dysplastic lesions similar to those observed upon in vivo infection with HPV. Hence this system can also be used to study epithelial cell cancers, as well as the effect of drugs on epithelial cell differentiation in general. Originally developed by Asselineau and Prunieras6 and modified by Kopan et al.7, the organotypic epithelial raft culture system has matured into a general, relatively easy culture model, which involves the growth of cells on collagen plugs maintained at an air-liquid interface (Figure 1A). Over the course of 10-14 days, the cells stratify and differentiate, forming a full thickness epithelium that produces differentiation-specific cytokeratins. Harvested rafts can be examined histologically, as well as by standard molecular and biochemical techniques. In this article, we describe a method for the generation of raft cultures from primary human keratinocytes. The same technique can be used with established epithelial cell lines, and can easily be adapted for use with epithelial tissue from normal or diseased biopsies8. Many viruses target either the cutaneous or mucosal epithelium as part of their replicative life cycle. Over the past several years, the feasibility of using organotypic raft cultures as a method of studying virus-host cell interactions has been shown for several herpesviruses, as well as adenoviruses, parvoviruses, and poxviruses9. Organotypic raft cultures can thus be adapted to examine viral pathogenesis, and are the only means to test novel antiviral agents for those viruses that are not cultivable in permanent cell lines.

An in vitro method to mimic in vivo epithelial differentiation is described. Many viruses target epithelial cells as part of their viral life cycle, and this method provides a means of examining virus:host interactions that more closely resembles that which occurs in vivo. This technique can be used with primary keratinocytes, established cell lines, as well as normal or diseased biopsy tissue.

Generierung von Organotypische Floßkulturen aus primären humanen Keratinozyten

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be established. The method described below, prepared in accordance with Good Manufacturing Process (GMP) guidelines, is an optimization of the most common ex vivo preparation method for generating large numbers of DCs for clinical studies 2.
Our method utilizes the synthetic TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) to stimulate the DCs. Our previous study established that Poly-ICLC is the most potent individual maturation stimulus for human DCs as assessed by an upregulation of CD83 and CD86, induction of interleukin-12 (IL-12), tumor necrosis factor (TNF), interferon gamma-induced protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), and type I interferons (IFN), and minimal interleukin 10 (IL-10) production.
DCs are differentiated from frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained by leukapheresis. PBMCs are isolated by Ficoll gradient centrifugation and frozen in aliquots. On Day 1, PBMCs are thawed and plated onto tissue culture flasks to select for monocytes which adhere to the plastic surface after 1-2 hr incubation at 37 &deg;C in the tissue culture incubator. After incubation, the lymphocytes are washed off and the adherent monocytes are cultured for 5 days in the presence of interleukin-4 (IL-4) and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) to differentiate to immature DCs. On Day 6, immature DCs are pulsed with the keyhole limpet hemocyanin (KLH) protein which serves as a control for the quality of the vaccine and may boost the immunogenicity of the vaccine 3. The DCs are stimulated to mature, loaded with peptide antigens, and incubated overnight. On Day 7, the cells are washed, and frozen in 1 ml aliquots containing 4 - 20 x 106 cells using a controlled-rate freezer. Lot release testing for the batches of DCs is performed and must meet minimum specifications before they are injected into patients.

The most commonly used method for generating large numbers of autologous dendritic cells (DCs) for use in tumor immunotherapy is described. The method uses IL-4 and GM-CSF to differentiate DCs from monocytes. The immature DCs are stimulated to mature and then loaded with antigens before they are injected back into the patient.

Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...