We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

HOPITAL Maisonneuve - 로즈 몬트 - 모든 동물 연구를위한 프로토콜 센터 드 공들인에서 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 흉선 조각의 제조 및 단일 세포 현탁액 1. 수확 마우스 흉선 <ol><li> 자궁 경부 전위 다음 CO 2와 마우스를 안락사. </li><li> 층류 후드에서 절개 보드 마우스 복부 측면을 고정. 70 % 에탄올로 마우스를 분무. 흉강을 입력하고 조직을 손상 에탄올을 방지하기 위해 거즈로 뿌리며 마치에 의해 초과 알코올을 제거합니다. </li><li> 포셉 한 쌍의 흉골의 기지에서 피부를 들어 올려 피부를 통해 상처를합니다. 각 앞다리 위쪽으로 피부의 상처를 확장합니다. </li><li> 흉곽에서 다이어프램을 분리하는 흉골의 기지에서 추가 컷을 확인합니다. 그런 다음 쇄골을 향해 흉곽의 각면을 잘라. 흉강을 노출 머리를 향해 흉곽을 뒤집습니다. 두 돌출부흉선은 심장의 상단에 거짓말. </li><li> 집게, 마이크로 해부 가위를 사용하여 흉선 로브 주위의 결합 조직을 제거 및 / 또는 날카로운 곡선 가위. 아래에서 또는 결합 조직을 나머지를 통해 개별 로브를 들어 올릴 좋은 팁 곡선 포셉 한 쌍을 사용합니다. 참고 : 직접 흉선을 파악하지 마십시오. </li><li> PBS를 포함하는 15 ML 원뿔 관에서 흉선 로브를 놓고 필요할 때까지 얼음에 따로 설정합니다. </li></ol> 2. 아가로 오스 임베딩 및 흉선 로브의 Vibratome 슬라이스 <ol><li> 멸균 PBS 50ml에 2g 저 융점 아가로 오스를 용해 아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지 낮은 설정에은 전자 레인지에 의해 삽입을 위해 4 % 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 사용할 준비가 될 때까지 55 ° C에서 물을 욕조에 알루미늄 호일 및 장소 플라스크를 커버. </li><li> 조직 배양 후드에서, 전체의 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640 용지 (FBS), 4- 밀리미터 L 글루타민, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 μM 준비2- 머 캅토 에탄올. </li><li> 6 웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 1.5 ㎖의 RPMI-1640 완료된 미디어를 추가하고 각 웰의 세포 배양 삽입물을 놓는다. 필요할 때까지 37 ° C에서 인큐베이터에서 따로 접시를 설정합니다. </li><li> 얼음 양동이에 물과 얼음과 눈 녹은 얼음 수조를 준비합니다. </li><li> 조심스럽게 좋은 팁 집게를 사용하여 각 흉선 로브를 둘러싼 나머지 모든 결합 조직을 제거합니다. 조직 상으로 전송이 PBS에 담가, 또는 해부 현미경 와이프 ​​후 흉선 로브는, 조직 배양 접시에 PBS에 잠긴 상태에서이 작업을 수행합니다. </li><li> 아가로 오스는 조직의 과열을 방지하기 위해, 플라스크 터치 단지 따뜻한 40 ° C, 이하 식히십시오. ~ 1cm의 높이 조직 금형에 아가로 냉각 된 4 % 붓는다. </li><li> 신중하게 조직 닦아 조직을 손상없이 건조 부드럽게 롤에 흉선 로브를 전송하는 집게 한 쌍을 사용합니다. 조직이 완전히 건조되었는지 확인하거나이 슬라이스 동안 아가로 오스 밖으로 밀어 것입니다. </li><li> 조심스럽게 아가로 로브를 삽입 가로 몰드의 하단 (슬라이스의 수를 증가시키는) 수직 (각각의 조각의 면적을 증가시키기 위해) 또는 그 중 하나의 위치. 아가로 오스가 고형화 할 수 있도록 5 ~ 10 분 동안 얼음 물에 금형을 놓습니다. </li><li> 이 시간 동안, 버퍼 트레이 장착 검지 디스크를 조립하고, vibratome 블레이드를 삽입함으로써 슬라이싱 용 vibratome 준비. 시편 디스크에 실험실 테이프의 조각을 놓습니다. 70 % 에탄올로 세정, 조립 작업을 소독. </li><li> 아가로 오스 응고되면, 부드럽게 아가로 오스 포함 로브를 해제의 중심에서 몰드를 눌러 반전. </li><li> 하단에 ~ 0.5 cm를 엽 각 측에 아가로 오스의 ~ 2mm을 떠나 주변을 초과 아가로 오스를 손질하기 위해 날카로운 칼날을 사용합니다. </li><li> 시편 디스크에서 테이프의 조각에 조직 접착제 한 방울 각 아가로 오스 블록을 고정합니다. 여러 블록 테이프에 접착 될 수있다. </li><li> vibratome 블레이드 위스콘신에 맞 춥니 다아가 블록의 상단 토륨. 블레이드와 아가로 오스 블록 (들) 완전히 몰입 될 때까지 멸균 PBS로 버퍼 트레이를 입력합니다. </li><li> 제 아가로 오스 포함 된 조직은 400 ~ 500 ㎛의 두께로 슬라이스를 얻을 수있다. 0.225 mm / sec의 속도, 100 Hz의 주파수, 5 ° 각도로 vibratome를 설정합니다. </li><li> 그들은 잘라 멸균 PBS를 함유 한 조직 배양 플레이트에 흉선 슬라이스를 수집 절곡 주걱을 사용한다. 첫 번째와 마지막 조각을 폐기하십시오. </li><li> 4 배 배율의 광학 현미경 하에서 조각을 검사합니다. 그대로 흉선 조직과 주변 아가로 오스 (그림 1A)와 슬라이스를 선택합니다. </li><li> 부드럽게 세포 배양 인서트 상 절곡 주걱에서 흉선 슬라이스 슬라이드 피펫 팁을 사용함으로써 단계 2.3에서 제조 한 판에 조각을 전송. 각 삽입 ~ 3 조각을 수용 할 수 있습니다. 슬라이스가 서로 또는 세포 배양 삽입 벽을 만지지 않도록합니다. </li><li> 필요할 때까지 37 ° C에서 접시를 유지한다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. 오버레이 형태 흉선 세포의 준비 <ol><li> 섹션 1에서 설명한 바와 같이, 2 % FBS를 함유하는 멸균 PBS 5ml를 가득 멸균 15ml의 조직 분쇄기를 사용하여 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 수동 로브 떼어 놓다 흉선 돌출부를 분리. 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 545 XG에서 세포를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고, 적혈구를 용해시키기 위해 3 분 동안 실온에서 1X ACK 용해 완충액 (0.15 M NH4Cl를 10 mM의 KHCO 3, 0.1 밀리미터 나 2 EDTA) 1 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> PBS 2 % FBS를 포함하여 15 ml의 튜브를 입력합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 545 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 2 % FBS를 함유하는 PBS 10 ㎖로 세포를 재현 탁하고, 255 ㎛의 메쉬 필터로 셀을 통과한다. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 39 ° C에서 5 분 동안 545 XG에 세포를 원심 분리기 및 CONCENTR에서 2 % FBS를 함유하는 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁ml의 당 1 × 10 7 세포의 ATION. </li><li> 휴대 전화 등의 카르복시의 숙신 이미 딜 에스테르 염료 (CFSE) 슬라이스 내생 세포로부터 구별하는 congenic 마커 또는 유전자 인코딩 된 형광 기자를 표현하는 쥐의 흉선 세포를 사용하지 않을 경우 제조 업체의 프로토콜에 따라 함께 세포를 레이블. </li><li> 표지 된 세포의 최종 세척 후, 15 μL 당 1-3 × 106 세포에서 완전 RPMI-1640 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 4. 흉선 조각에 흉선 세포를 오버레이 <ol><li> 삽입의 흉선 조각을 둘러싼 액체를 대기음 피펫을 사용합니다. 참고 : 아가로 오스가 손상되지 않도록주의하십시오. 아가로 오스가 손상된 경우 포개어 흉선 의한 표면 장력의 손실 슬라이스 표면에 부착하지 않을 것이다. </li><li> 피펫 팁 오버레이 각 흉선 슬라이스에 섹션 3에서 제조 된 흉선 세포의 15 μl를 슬라이스를 건드리지 않고. </li><li> 인민 해방군을 품어2 시간 동안 37 ° C에서 테는 세포가 흉선 조각으로 마이그레이션 할 수 있습니다. </li><li> 2 시간 후, 아직 조직으로 마이그레이션하지 않은 초과 중첩 흉선 세포를 제거하는 1 ml의 PBS로 흉선 조각을 3 회 씻어. </li><li> 흉선 조각이 수확 될 준비가 될 때까지 실험에 따라 일반적으로 1-72 시간을 37 ° C에서 접시를 품어. </li></ol> 유동 세포 계측법에 대한 흉선 조각 5. 해리 <ol><li> 2 % FBS가 포함 된 PBS 150 μl를 추가하여 각 슬라이스에 대한 microcentrifuge 관을 준비합니다. </li><li> 흉선 슬라이스로 조직 배양 인서트 2 % FBS를 함유하는 1 ml의 PBS를 첨가하고 부드럽게 세포 배양 인서트의 표면으로부터 슬라이스 분리 굴곡 주걱으로 교반 하였다. </li><li> 굴곡 주걱을 사용하여 microcentrifuge 관에 삽입에서 슬라이스를 전송합니다. </li><li> 수동으로 microcentrifuge 관 샘플 유봉을 사용하여 슬라이스를 방해. 최종 부피 (300)는 2 % FBS를 함유하는 PBS 150 μl를 추가μL. </li><li> 새로운 마이크로 원심 튜브에 40 μm의 필터를 통해 해리 조직 필터. 여과 된 세포는 유세포 분석 (40)에 대한 물들 일 준비가 된 것입니다. </li><li> 사이토 모든 아가가 제거되고 사이토 흐름을 방해하지 않도록하기 위해 흐름들을 전달하기 전에 세포를 두 번째 필터. </li><li> 유세포에 세포를 수집하고 (40) 이전에 설명한 바와 같이 데이터를 분석한다. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에서 우리는 흉선 조각 및 유동 세포 계측법에 의해 중첩 사전 선택 MHC 클래스 I 제한 TCR 유전자 변형 흉선 세포의 효율적인 양성 및 음성 선택의 대표적인 결과의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 시스템은 작용제 항원 음성 선별 및 흉선 T에 등록 개발 11,12의 존재하에 예비 선택 DP의 흉선 (32)로부터 MHC 클래스 II 제한 CD4 + T 세포의 양성 선별을 ...

T 세포는 기능성 자기 저항성 T 세포 레퍼토리 1-3의 생성을 위해 여러 체크 포인트가 발생하는 시간 동안 흉선 발달 중간체 일련 구별. 긍정적 인 선택은 대뇌 피질의 흉선 상피 세포 (CTEC) 2,3에 주요 조직 적합성 복합체 분자 (MHC)에 의해 제공 온건 친 화성 펩타이드에 저와, 인식 할 수있는 T 세포 수용체 (TCR)와 흉선 세포의 생존을 촉진한다. 음의 선택 및 규제 T (T REG) 세포 개발은 MHC 2,4 제시 자체 펩타이드에 강력하게 대응 흉선 세포의 제거 또는 전환을 통해 자기 관용의 설립에 기여한다. 미성숙 한 CD4 + CD8 + 더블 양성 (DP)은 성숙한 T 세포의 소집단으로 선정 과정을 통과 차별화 TCR도를 발현하는 흉선 세포,있는 MHC 클래스 I가 제한 CD8 + 세포 독성 대부분입니다또는 MHC 클래스 차 림프 기관 1-3 이펙터 기능을 수행하는 흉선을 종료하기 전에 CD4 + 헬퍼 단일 양성 (SP) T 세포를 II 제한. T 세포 개발의 복잡성을 추가 동적 이동과 간질 셀 네트워크에 걸쳐 5-9 흉선 개발 셀룰러 조우한다. 이러한 기질 세포는 흉선 세포 개발에 뚜렷한 역할을하고 차별적 긍정적이고 부정적인 선택 (10)를 발생하는 흉선 피질과 수질 영역 사이에 분포한다. 긍정적 인 선택은 주로 피질에서 발생하지만, DP의 흉선 세포는 골수로 마이그레이션하고는 수질이 긍정적 인 선택과 혈통의 완료에 필요한 추가 신호를 제공 할 수 있음을 시사 성숙한 T 세포로 분화하기 전에 TCR 신호를 필요로 계속 축적 증거가있다 분화 11, 12. 더욱이,자기 반응성 흉선 세포 (13, 14)의 삭제를 용이하게 표현 전문 수질 흉선 상피 세포 (mTEC)와 현재의 조직 제한 항원의 존재에도 불구하고, 부정적인 선택의 큰 비율은 보편적으로 자기 펩타이드는 수지상 제시 표현에 대한 응답에서 피질에서 발생 세포 (15, 16). 따라서, T 세포 발달의 정확한 모델은 흉선 세포 및 간질 세포 사이의 상호 작용을 용이하게하고, 이러한 세포를 양성 및 음성 선별을 거쳐으로서 흉선 세포 이동을 지원 그대로 피질 및 수질 영역으로 고도로 조직화 흉선 미세 환경을 제공해야한다. 생체 보완 반응계에서, 포지티브 및 네거티브 선택, 시험관들을 연구하는 수단으로서 흉선 세포 분석 및 T 세포 발달의 생체 내 모델에서 17-22을 개발되어왔다. 요점을 되풀이하기 어렵기로 악명이있다긍정적 인 체외에서 선택하지만, 노치 리간드를 발현하는 줄기 세포 집단 또는 기질 세포와 T 세포 전구체의 공 배양, 특히 OP9-DL1가 / 4 세포로 체외 모델에에게 귀중한을 T 계보의 헌신과 제한된 양의 선택을 지원하는 기능이 있습니다 연구 T 세포 개발 23-25. 이 시스템의 한계는, 그러나, 이들 세포는 흉선 간질 세포에서 발견되는 고유 펩타이드 처리 장치 및 입체 흉선 미세 부족하다는 점을 포함한다. 기술적으로 복잡, 시험 관내 시스템에 관한 장벽들을 극복 할 수있는 동일계 및 흉선 선택의 생체 내 모델에서 비록. 재 응집 흉선 기관 배양 (RTOC)는 흉선 세포와 흉선 간질 세포 18,26,27의 혼합물 정의가 들어 있습니다. 이 흉선 상피 세포 reaggregates는 MHC 클래스 I 및 II 식을 유지하고 developme에 지원할 수 있습니다NT를 모두 기존의 T 세포 하위 집합으로, 그러나 아직도 피질과 수질 구조를 정의 부족합니다. 태아 흉선 기관 문화 (FTOC)은 lymphoreplete 흉선 로브에 lymphodepleted 흉선 로브 또는 흉선 세포의 주입을 통해 매달려 ​​놓기 문화를 통해 흉선 세포의 시드와 CD4 +와 CD8 + T의 효율적인 개발을 지원할 수있는 T 세포 발달의 인기 모델입니다 문화 18,28-31에서 시간이 지남에 따라 세포. 태아 흉선 로브의 문화의 개시에 mTECs의 소수가 있지만, 정의 피질과 수질 구조는 조건에 따라 시간이 지남에 개발할 수 있습니다. 중요한 고려 사항이 모델 우선적 성인 T 세포 발달 대 태아 지원할 수 있다는 것이다. 마지막으로, 성인 마우스에서 정의 된 흉선 전구체의 intrathymic 주입은 기술적으로 도전하지만 명확하게 지원하는 환경을 제공합니다 생체 내에서 T 세포의 발달. 현장 및 생체 모델이 우수한 도구 t이다O 연구 T 세포의 발달 및 사용은 실험별로 실험을 기초로 고려되어야한다. 흉선 슬라이스 그러나 최근 고유 복잡하며, 일반적으로 높은 처리 실험을 수용 할 가능성 시츄 흉선 선택을 연구하는 다목적 상보 모델로 떠오르고있다. 흉선 슬라이스 피질 및 수질 영역의 무결성을 유지 및 개발뿐만 아니라 효율적인 양성 및 음성 선별 11,32-39 동안 흉선 세포 이동을 지원하는 간질 세포의 프레임 워크를 제공한다. 흉선 조각 꼭대기에 추가 흉선 세포의 부분 집합은 조직에 자신의 적절한 미세 환경 틈새 34, 37로 마이그레이션 할 수 있습니다. 오버레이는 흉선 congenic 표지 또는 형광 라벨을 통해 슬라이스 내인성 흉선 세포로부터 구별 할 수 있고, 몇 일 동안 배양 유지할 수있다. 흉선 슬라이스의 Organotypic 배양 물은 다양한 양상을 연구하기 위해 사용될 수있다다른 사람의 사이에서 흉선 선택, 흉선 세포 행동 (이동과 세포의 상호 작용), 및 흉선 세포 현지화를 포함한 T 세포 개발. 마우스 당 20 ~ 흉선 슬라이스를 생성 할 수있는 능력이 주어 실험의 확장 성 흉선 선택 시츄 모델에서 다른 것보다 일반적으로 크다. 흉선 조각의 제조 전문 등 vibratome 같은 장치, 및 세포 사멸을 통해 시간에 따른 세포의 손실 및 캡슐화 막 부족으로 인해 제한되어 배양 흉선 슬라이스의 수명 시간을 필요로하지만, 흉선 슬라이스 우수한 모델을 제공 성숙한 흉선 미세 환경 내에서 흉선 세포의 동기화 인구의 흉선 선택의 분석. 여기에서 우리는 유세포 분석을위한 흉선 조각, 격리 및 흉선 세포의 오버레이 및 해리 (흉선, 흉선 로브의 아가로 오스 삽입 및 내장 조직 vibratome 절편을 수확 포함) 흉선 조각의 준비에 대해 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50080</td>
			<td>Low melting temperature agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td>
			<td>Polyciences</td>
			<td>18986</td>
			<td>22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Prep Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m Cell Culture Inserts&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-glutamine</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-110</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F19922-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Inox Tip</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td>Fine tip curved forceps, size .17&#160;X .10mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5090&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

기능, 자기 허용 T 세포 레퍼토리의 생성의 결과로 독특하고 고도로 조직화 된 흉선 미세 환경에서 흉선 선택 진행한다. T 계보의 헌신과 개발을 연구하는 체외 모델은이 과정에 귀중한 통찰력을 제공하고 있습니다. 그러나, 이러한 시스템은 T 세포의 발달에 필요한 완전한 입체 흉선 환경이 부족하고, 따라서, 생체 내 선택 흉선 불완전 근사치이다. 모델링 T 세포의 개발과 관련된 문제들 중 일부는 전체 T 세포 개발 흉선 선택을 지원 온전한 흉선 미세 제공 시츄 모델을 사용하여 극복 될 수있다. 흉선 슬라이스의 Organotypic 문화는 현장 기술에 기존의 보완. 흉선 조각은 흉선 피질과 수질 지역의 무결성을 보존하고 정의 발달 단계 또는 내인성 T (c)의 중첩 흉선 세포의 개발을 연구 할 수있는 플랫폼을 제공성숙한 흉선 미세 환경 내에서 ELL 학생. 마우스 당 20 ~ 슬라이스를 생성 할 수있는 능력이 주어 흉선 슬라이스 높은 처리량 실험 성 측면에서 고유 한 이점을 제시한다. 또한, 다양한 유전 적 배경에서 다른 흉선의 서브 세트 또는 다른 세포 집단을 오버레이 흉선 조각과 잠재력을 생성하는 상대적 용이성이 방법의 다양성을 향상시킨다. 여기에서 우리는 흉선 조각, 격리 및 흉선 세포의 오버레이 및 유세포 분석을위한 흉선 조각 해리의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 시스템은 흉선 세포 이주, 흉선 세포 - 실질 세포의 상호 작용 및 이광자 현미경 흉선 선택과 연관된 TCR 신호의 비 통상적 인 T 세포의 발달을 연구뿐만 아니라 가시화하도록 구성 될 수있다.

이러한 양 및 음의 선택과 같은 T 세포 발달의 여러 측면의 흉선 슬라이스 지원 분석. 성공적인 실험 들어, 흉선 조각의 품질이 중요하다. 따라서, 흉선 슬라이스는 흉선 조직의 무결성을 보장하기 위해 검사되어야하고 흉선 슬라이스를 둘러싼 아가 그대로 (도 1a)된다. 아가로 오스는 흉선 조직으로 이전의 수의 상당한 감소를 유발 손상 될 때, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

우리는 유동 세포 계측법와 함께, T 세포 현상의 양 및 음의 선택을 모델링하는데 사용될 수 있고, 흉선 조각의 제조를 설명한다. 흉선 조각은 또한 흉선 세포 마이그레이션, 현지화의 현장에서 분석하도록하고, 면역 및 두 광자 현미경을 통해 시그널링 할 수있다.

준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

preparation-and-applications-of-organotypic-thymic-slice-cultures

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K 조회수.  Hôpital Maisonneuve-Rosemont.  우리는 유동 세포 계측법와 함께, T 세포 현상의 양 및 음의 선택을 모델링하는데 사용될 수 있고, 흉선 조각의 제조를 설명한다. 흉선 조각은 또한 흉선 세포 마이그레이션, 현지화의 현장에서 분석하도록하고, 면역 및 두 광자 현미경을 통해 시그널링 할 수있다. 

비디오: Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM - / -</sup과 p53의 - / -</sup 마우스

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

연구

면역학 및 감염병학

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates epithelial differentiation. There are many uses for this system. For instance, the ability to grow three-dimensional organotypic raft cultures of keratinocytes has been an important milestone in the study of human papillomavirus (HPV)1. The life cycle of HPV is tightly linked to the differentiation of squamous epithelium2. Organotypic epithelial raft cultures as demonstrated here reproduce the entire papillomavirus life cycle, including virus production3,4,5. In addition, these raft cultures exhibit dysplastic lesions similar to those observed upon in vivo infection with HPV. Hence this system can also be used to study epithelial cell cancers, as well as the effect of drugs on epithelial cell differentiation in general. Originally developed by Asselineau and Prunieras6 and modified by Kopan et al.7, the organotypic epithelial raft culture system has matured into a general, relatively easy culture model, which involves the growth of cells on collagen plugs maintained at an air-liquid interface (Figure 1A). Over the course of 10-14 days, the cells stratify and differentiate, forming a full thickness epithelium that produces differentiation-specific cytokeratins. Harvested rafts can be examined histologically, as well as by standard molecular and biochemical techniques. In this article, we describe a method for the generation of raft cultures from primary human keratinocytes. The same technique can be used with established epithelial cell lines, and can easily be adapted for use with epithelial tissue from normal or diseased biopsies8. Many viruses target either the cutaneous or mucosal epithelium as part of their replicative life cycle. Over the past several years, the feasibility of using organotypic raft cultures as a method of studying virus-host cell interactions has been shown for several herpesviruses, as well as adenoviruses, parvoviruses, and poxviruses9. Organotypic raft cultures can thus be adapted to examine viral pathogenesis, and are the only means to test novel antiviral agents for those viruses that are not cultivable in permanent cell lines.

An in vitro method to mimic in vivo epithelial differentiation is described. Many viruses target epithelial cells as part of their viral life cycle, and this method provides a means of examining virus:host interactions that more closely resembles that which occurs in vivo. This technique can be used with primary keratinocytes, established cell lines, as well as normal or diseased biopsy tissue.

기본 인적 Keratinocytes에서 Organotypic 뗏목 문화의 생성

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be established. The method described below, prepared in accordance with Good Manufacturing Process (GMP) guidelines, is an optimization of the most common ex vivo preparation method for generating large numbers of DCs for clinical studies 2.
Our method utilizes the synthetic TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) to stimulate the DCs. Our previous study established that Poly-ICLC is the most potent individual maturation stimulus for human DCs as assessed by an upregulation of CD83 and CD86, induction of interleukin-12 (IL-12), tumor necrosis factor (TNF), interferon gamma-induced protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), and type I interferons (IFN), and minimal interleukin 10 (IL-10) production.
DCs are differentiated from frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained by leukapheresis. PBMCs are isolated by Ficoll gradient centrifugation and frozen in aliquots. On Day 1, PBMCs are thawed and plated onto tissue culture flasks to select for monocytes which adhere to the plastic surface after 1-2 hr incubation at 37 &deg;C in the tissue culture incubator. After incubation, the lymphocytes are washed off and the adherent monocytes are cultured for 5 days in the presence of interleukin-4 (IL-4) and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) to differentiate to immature DCs. On Day 6, immature DCs are pulsed with the keyhole limpet hemocyanin (KLH) protein which serves as a control for the quality of the vaccine and may boost the immunogenicity of the vaccine 3. The DCs are stimulated to mature, loaded with peptide antigens, and incubated overnight. On Day 7, the cells are washed, and frozen in 1 ml aliquots containing 4 - 20 x 106 cells using a controlled-rate freezer. Lot release testing for the batches of DCs is performed and must meet minimum specifications before they are injected into patients.

The most commonly used method for generating large numbers of autologous dendritic cells (DCs) for use in tumor immunotherapy is described. The method uses IL-4 and GM-CSF to differentiate DCs from monocytes. The immature DCs are stimulated to mature and then loaded with antigens before they are injected back into the patient.

면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM^{- / -과 p53의^{- / - 마우스}}

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

기본 인적 Keratinocytes에서 Organotypic 뗏목 문화의 생성

유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을

준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM - / -과 p53의 - / - 마우스

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

기본 인적 Keratinocytes에서 Organotypic 뗏목 문화의 생성

유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을

에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM^{- / -과 p53의^{- / - 마우스}}