והמלצה תודה של אוניברסיטת ויסקונסין ביוטכנולוגיה במרכז DNA רצף המתקן למתן הגברה, רצף מתקנים ושירותים, קייטלין קרלסון, ג'ניפר המיומנות, ג'ייק אוטו, וכן מקס Haase למתן סיוע טכני עם אנליזה מולקולרית. עבודה זו נתמכה על ידי שירות המחקר החקלאי-USDA הופקעו קרנות (מחקר מידע המערכת הנוכחית 3655-21220-001). תמיכה נוספת סופק על ידי הקרן הלאומית למדע (תחת גרנט מס DEB-1442148), DOE הגדול אגמים Bioenergy המרכז לחקר (DOE משרד המדע בער דה-FC02-07ER64494), לבין משרד החקלאות המכון הלאומי של מזון חקלאות (פתח פרוייקט 1003258). C.T.H. הוא חוקר הספסל למדעים ביו ועמית של אלפרד Toepfer סגל, הנתמך על-ידי בוטח צדקה הספסל ועל קרן אלכסנדר פון הומבולדט, בהתאמה.

1. לבחון את ההשפעה של החשיפה פטריות על Bumble דבורים המושבה הצלחה באמצעות שדה כלוב ניסויים <ol><li>סט למעלה 10 כלובי רשת בשדה נטועים שיבולת שועל. נחפור תעלה סביב כל הכלוב, חופר לכל ארבעה קצוות של הכלוב רשת באדמה כדי להבטיח כי דבורים לא יכול לברוח. מלאי את הכלובים עם צמחים בעלי פרחים בעציץ, אשר ידועים להיות מושך דבורים (למשל כוסמת, borage, אליסון, קוסמוס, חמניות) ( איור 2).</li>
	<li>תוספת הכלובים עם מגש אחד (36 ס מ x 42 ס מ) תלתן, בלום. אשכול פרחוני המשאבים בתוך פינה אחת של הכלוב, כובש שטח כ 2.5 מ' x 1 מ' Vegetate שטח הכלוב שנותרו על ידי שיבולת שועל.</li>
	<li>להקצות באופן אקראי הדבורה מושבות, כל העובדים המכיל, מיטה זוגית, טיפול (פטריות המתנה/נעדרים, N = 5 מושבות לכל טיפול, הכולל 10 מושבות), ואז למקם אותם בתוך כלוב שדה (N = 1/כלוב) 29 ימים (23 ביוני -21 יולי 2014).</li>
	<li>אוריינט בתיבות המושבה כך המושבה &#39; s פתחים הצבע לדרום, כדי לספק תנאים אופטימליים ניווט הדבורים. לסבסד את המושבות עם סוכר מים שלפוחיות, בתוך התיבות כוורת להשלמת צוף זמינות.</li>
	<li>החל מבוסס chlorothalonil פטריות ברמה שדה רלוונטי (20 גרם/ליטר) כדי צמחים פורחים בכלובים טיפול 5 פטריות, תוך שימוש ביד שנערך ריסוס חומרי הדברה, פעמיים במהלך המחקר (יום 0 ו- 13). מעיל הפרחים בצורה אחידה, כך אין נוזל נוסף לאנאפוליס פרחוני משטחים ( איור 3).</li>
	<li>בתום המחקר כלוב שדה, להסיר את המושבות וטופל דרב מהכלובים בעבודת יד, מגניב הכוורות על-ידי הצבת במקפיא-20 ° C עבור 20 דק.</li>
	<li>להסיר דבורים באמצעות מלקחיים סטרילי ולהקליט את המספר של הזחלים, גלמים, נשים בוגרות (אני. e. איוראו), וזכרים בוגרים. באמצעות איזון האנליטי להקליט את משקל יבש של אמא מלכה, הזחלים, גלמים, נשים בוגרות (קרי איוראו), הזכרים הבוגרים.</li>
</ol> 2. לבחון את ההשפעות של החשיפה פטריות על קהילות מיקרוביאלי האבקה-מהוראות Bumble דבורים קינים באמצעות מעבדה המבוסס על ניסויים Vivo ב <ol><li>Pulverize שנרכשו באופן מסחרי אבקה אבקה באמצעות תקן מעבדה-טחנת הכדור. לחטא אבקה אבקת למסמס ב-70% אתנול, ולאפשר לו להתאדות במשך הלילה תחת אור UV. לוודא עקרות של אבקה על-ידי ציפוי ~0.5 מ"ג במדיה אגר למטרות כלליות.
	<ol><li>כדי היבשה אבקה מעוקר, באמצעות פיפטות מעוקר, הוסף שדה רלוונטי במינון של פטריות: propiconazole-14.3%; azoxystrobin ב 22.9% עבור טיפולים (0.74 µL ו- 0.65 µL בהתאמה / יום / כוורת). מערבבים היטב בעזרת מקלות עץ מעוקר.</li>
	</ol></li> <li>מקום 6 ניסיוני כוורות (n = 3 עבור בקרה וטיפול) ב- benchtop מעבדה נקייה, היגיינה נשמר בטמפרטורת החדר. כל יום שוקלים 4.27 גר' אבקה 34 , 35 מעורבב עם קוטלי פטריות (עבור טיפולים) או במים סטריליים (עבור פקד) בתוך ברדס באמצעות הטכניקה aseptic רגיל.
	<ol><li>באמצעות הדלתות שסופקו על-ידי הצד של תיבת קרטון תוחמת את הכוורות, להציג את האבקה בתוך הכוורות. תוספת ההייבס עם סוכר סטיריליים פתרון בכל שבוע. המשך האכלה המשטר במשך ארבעה שבועות.</li>
	</ol></li> <li>המסקנה של המחקר במעבדה מבוסס, מגניב הכוורות על-ידי הצבת במקפיא-20 ° C עבור 20 דקות מגרדים החוצה האבקה-הוראות הנכלל צ'יימברס שבוחרים באמצעות מלקחיים סטיריליים שפכטלים ומקום אחסון סטריליים צינורות. בחנות-80 ° ג ספירת ולהקליט המשקל של העובדים ואת המלכה האם-ההתחלה והסוף של הניסוי (שלב 1.7).</li>
	<li>לבודד דנ א מהדגימה אבקה-הוראה באמצעות בידוד ה-DNA זמינים מסחרית ערכות (לפרטים, ראה טבלה חומרי).
	<ol><li>להוסיף 0.25 גרם של אבקה-הוראה על החילוץ צינורות, בקצרה מערבולת לערבב.</li>
		<li>להפוך 200 מ"ג/מ"ל ליזוזים פתרון יונים מים מזוקקים, מספיק למדגם/50 µL. טלטל נמרצות כדי פתרון הטופס לגמרי.</li>
		<li>להוסיף 50 µL של הפתרון ליזוזים הצינורות חילוץ עם מדגם זה, ומערבבים היטב על ידי היפוך מספר פעמים. דגירה הצינור 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים. אם התמיסה הקימה, חום פתרון עד 60 ° צלזיוס עד התפרקה לפני השימוש.</li>
		<li>µL להוסיף 70 פירוק מימית לפתרון צינורות החילוץ, לאבטח בצורה אופקית על משטח מערבולת גרר עם קלטת, מערבולת במשך 10 דקות צנטריפוגה צינורות ב g x 10,000 ל 30 s בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי mL 2 אוסף. להוסיף 250 µL של חלבון משקעים פתרון, מערבולת של Incubate ס' 5 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמבט קרח. 
		הערה: מצפה בין µL 400 עד 500 µL של תגובת שיקוע. תגובת שיקוע עדיין עשויה להכיל כמה חלקיקים.</li>
		<li>Centrifuge הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 1 דקה ב 10,000 x g, להעביר עד 600 µL של תגובת שיקוע צינור נקי mL 2 אוסף. להוסיף 200 µL של פתרון להסרת מעכב מימית, בקצרה, מערבולת, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק צנטריפוגה הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות ב- 10,000 x ג' להעביר עד 750 µL של תגובת שיקוע לתוך צינור נקי mL 2 אוסף.</li>
		<li>1200 להוסיף µL של bind מימית פתרון תגובת שיקוע, ו מערבולת עבור 5 ס לטעון כ 675 µL של תגובת שיקוע על גבי ספין ומסנן צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את הזרימה.</li>
		<li>חוזר 2.4.7. פעמיים. 
		הערה: בסך הכל שלושה מטענים עבור כל דגימה מעובד נדרשים.</li>
		<li>להוסיף 500 µL אתנול, צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך 30 s ב- 10,000 x ג למחוק את הזרימה, ו צנטריפוגה שוב בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות ב- 10,000 x ג מקום ספין מסנן בשפופרת איסוף mL 2 נקייה.</li>
		מאגר <li>להוסיף 100 µL של • תנאי למרכז של קרום מסנן. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך 30 s ב 10,000 x ג למחוק את המסנן ספין. חנות שנאספו DNA בין-20 ° C ל-80 מעלות צלזיוס</li></ol></li> <li>שימוש מבודד DNA עבור רצף.
	<ol><li>Quantify, ואת לנרמל מבודד דנ א נג 2/µL על ידי ניתוח fluorometric.
		תגובות <ol><li>הכן דולר עבור כל דגימה שחולצו להשוות את כמויות יחסיות של 28S (צמח), לנתח שלה (פטריות), ורכיבים 16 (חיידקים) של כל מדגם אבקה-סעיף 36. ודא כי כל התגובה מכילה 10 ng של DNA הכולל, 2 x של cyanine סימטרית צבע המבוסס על מיקס מאסטר 2.5 µL כל תחל ואחורה זוגות 28KJ/28B 37 למפעל, ITS1/ITS5.8R עבור ה-DNA פטרייתי 38 .</li>
		</ol></li> <li>דנ א להגביר שימוש בפרמטרים הבאים: 2 דקות דנטורציה טרום ב 50 מעלות צלזיוס, 2 דקות דנטורציה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס, 40 מחזורי של (15 s ב 98 ° C, 15 s-58 ° C, 60 s ב-72 מעלות), ואחריו עיקול להמיס.</li>
		<li>להכין 2-צעד, מקוננת PCR פרוטוקול באמצעות ספריות הדור הבא רצפי פילוח של rRNA 16 אזור משתנה V3/V4 ו- ITS / 5.8s אזור מרווח rRNA.
		<ol><li>µL להוסיף 12.5 של ה-DNA ל- 5 pmol של כל פריימר ו- 2 x מיקס מאסטר. להפוך לתגובות נפרד לכל אזור (16 או ITS; ראה טבלה 1). שינוי אזור ספציפי תחל כפי שתואר לעיל 39 , 40 להוספת מתאם ספציפי הרצפים (sequencer) החריגה רצפי רצפי הגן הספציפי.</li>
			<li>לבצע הגברה הראשונית באמצעות הפרמטרים הבאים: 3 דקות דנטורציה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס, 25 מחזורי של (30 s ב 95 ° C, 30 s-55 ° C, 30 s ב-72 מעלות), 5 דקות הארכה הסופי-72 מעלות צלזיוס</li>
			<li>הבאות הראשוני הגברה, לאמת גודל הספרייה וכמות על ידי ניידות electrophoretic, לנקות באמצעות 1 x נפח מעבדתי imm הפיךחרוזים obilization כדי להסיר תחל שיורית, ריאגנטים התגובה. בריכה מטוסי אף-16, amplicons שלה באופן כמותי כדי ליצור בריכה אמפליקון יחיד עבור כל דגימה.</li>
			<li>להוסיף מתאמי ספציפי הרצפים (sequencer), לטעום באינדקסים ספציפיים כפול באמצעות את תחל הבאים (ראה טבלה 1). להוסיף 2.5 µL של ה-DNA מוגבר pmol 5 של כל פריימר ו- 2 x מיקס מאסטר. לבצע הגברה הספרייה באמצעות הפרמטרים הבאים: 3 דקות דנטורציה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס, 8 מחזורים של (30 s ב 95 ° C, 30 s-55 ° C, 30 s ב-72 מעלות), 5 דקות הארכה הסופי-72 מעלות צלזיוס</li>
		</ol></li> <li>הבאים PCR, ספריות סיים לנקות באמצעות נפח 1 x של מחרוזת הנייח הפיך מעבדתי. להעריך את האיכות והכמות של ספריות סיים באמצעות ניידות electrophoretic ו- fluorometry, בהתאמה. לתקנן ספריות 2 מיקרומטר, בריכת לפני רצף.</li>
		<li>לבצע רצף הדור הבא על פלטפורמה מקביל המתאמים שנוספו ב- PCR המשני, באורך המתאים כדי לכסות את כולו אמפליקון 41.</li>
	</ol></li> <li>רצף ביאור וניתוח הקומפוזיציה מיקרוביאלי.
	<ol><li>לשלב זוג רצף נתונים (R1 ו- R2) לתוך contigs יחיד עבור ספריות הכל ברצף. לאחר מיזוג קבצים R1 ו- R2, מופק קובץ fasta יחיד עבור כל הספריות של. 
		הערה: שלב זה ואת התהליכים המתוארים להלן (אלא אם כן צוין אחרת) מתבצעות ב- Mothur גירסה 1.38.0 38.</li>
		<li>מסך כל קובץ fasta להסיר בסיסים רב-משמעי, רצפים ארוכים לא צפויה, homopolymers ארוך. 
		הערה: הפרמטרים עבור הקרנה, וגם להסרת רצף הם maxambig = 0, maxlength = 600 ו- maxhomop = 8 עבור שני גנים. להסיר רצפים זהים, אך לשמור טבלה contingence בנפרד עבור כל ספריות (המוכר גם בשם הרוזן טבלה ב- Mothur).</li>
		<li>יישור רצפים ייחודי של ספריית הגן מטוסי אף-16 יצאו נגד גירסת מסד הנתונים סילבה 123, ואת הספריה ITS ג'ין נגד מסד הנתונים לאחד שלה 42. 
		הערה: רצפים חייב להיות מבואר מרמת ממלכת לשלב סוג.
		<ol><li>לאחר מכן, אשכולות המיושרים רצפים עם pre.cluster הפונקציה באמצעות diff = 5, ולהסיר כימרות.</li>
		</ol></li> <li>לסווג רצפים בשיטת וואנג 43 בהתבסס על סילבה (עבור ג'ין 16) טקסונומיה לאחד שלה (עבור ג'ין ITS) קבצים (ערך סף של 80%).</li>
		<li>לטעון לתוך R 44 contingence הטבלאות (אחת בכל גן) שנוצר במהלך תהליך סיווג ב- Mothur. בכל רמה בטקסונומיה, לקבל שפע יחסי לכל ספריה עבור ניתוח נוסף של הקהילה מיקרוביאלי שינויים. 
		הערה: בכל רמה בטקסונומיה, מתמזגים יחד קבוצות בטקסונומיה בעת השפע היחסי הוא פחות מ 2% עבור כל החזרות ניסיוני.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

חקירות ההשפעות של קוטלי פטריות על דבורה בריאות נשארו היבט understudied של אסטרטגיות ניהול בפשט. המחקר שלנו שואפת את פער הידע זה באמצעות חבילה של טכניקות משלימים במפורש לבודד את הגורמים הפוטנציאליים נהיגה דבורה ירידות. תכנון הרציונל, עיבוד של ניסויים אלה מפורטים להלן.
חשוב לוודא ?...

הצליח, דבורה בר מינים חווים ירידות נפוצה, עם השלכות עיקריים עבור שתי מערכות חקלאיות טבעי1. למרות המאמצים מתואמת כדי להבין את הסיבות לבעיה זו, הגורמים נהיגה דבש דבורים ירידות הם עדיין לא הבין היטב2,3,4. עבור מינים מסוימים של דבורים פראי, מקורית, המצב נהיה קשה5,6. אם אוכלוסיות דבורה לא יכולה להתקיים כאשר הם מצטלבים עם חקלאות תעשייתית, אוכלוסיות שלהם ימשיכו ליפול היבולים הדורשים למאביקים (35% ייצור ברחבי העולם7) ימשיכו מופחת יבול.
בעוד גורמים פוטנציאליים רבים כגון חשיפה לחומרי הדברה, מחלות גידול הפסד1,4,8,9,10 היו מעורבים בהתדרדרות דבורים דבש, יחסית מעט מאוד ידוע על השפעת לחצים אלו אינטראקטיבית על דבורים יליד בריאות, בתוך או ליד ומערכות חקלאיות. מאמצים רבים במחקר הנוכחי להמשיך להתמקד קוטלי חרקים, (למשל, neonicotinoids11,12), למרות שהמחקר העבר מצביע על כך קוטלי פטריות עשוי גם לשחק תפקיד בהתדרדרות דבורים על ידי ופוגע היווצרות הזיכרון, חוש הריח הקבלה13, קן זיהוי14, פעילות אנזים, פונקציות מטבוליות15,16,17. באופן כללי, קוטלי פטריות להמשיך להחיל על היבול פורח במהלך בלום. המחקרים האחרונים תיעדו כי דבורים נפוץ להחזיר פטריות שאריות כוורת18, ואכן, מחקרים הראו שיעור גדול של כוורות שנבדקו הכיל פטריות שאריות19,20. עבודה נוספת חשף את שאריות פטריות קשורה עם שיעור גבוה של דבש דבורים התמותה זחל21,22,23 ואת נוכחותם של "אנטומבד אבקה" בתוך מושבות, אשר למרות שאינם רעילים, נטול פעילות מיקרוביאלית והוא פרוץ תזונתית24. למרות העובדה כי קוטלי פטריות יש מזמן נחשב "דבורה-בטוח", עכשיו יש ראיות כי החשיפה פטריות לבד יכול לגרום הפסדים המושבה חמור של זן דבורה במבל מקורית, וטופל בומבוס25.
כדי לקבוע סיבתיות בין חשיפה פטריות המושבה התמותה, המודוס אופרנדי של כימיקלים אלה צריך להיקבע. כפי שמעידים קרקעות26, משקעים27ו סביבות הימית28, מיקוד פטריות, קוטלי פטריות סביר לשנות השפע פטרייתי, גיוון בתוך אבקה-הוראות, ובכך מפעיל קהילה גדולה משמרת את זה ייתכן מאוד ממליץ חיידקים. ללא מתחרים פטרייתי או היריבים, חיידקים פתוגניים מסוימים יכולים להתרבות יחסית לא מסומן, להקל את קלקול של אבקה-הוראות. מחקרים שנעשו בעבר הוכיחה כי מיקרואורגניזמים, במיוחד שמרים ופטריות filamentous, לשמש אנחנו חיים איתם בסמביוזה תזונתי עבור דבורים29,30,31, להגן מפני טפילים פתוגנים32 ,33, ולספק שימור לטווח ארוך של חנויות אבקה. קוטלי פטריות, לכן, ייתכן בעקיפין לפגוע דבורים ילדותי באמצעות שיבוש הקהילה מיקרוביאלי, יש צורך לספק שירותים אלה ו/או על ידי הגדלת הרגישות פתוגנים וטפילים הזדמנותית12. עם הגדלת דרישות על ייצור מזון, יבולים ברחבי העולם להיות ריססו בכל שנה עם קוטלי פטריות במהלך בלום, דבר המלמד הצורך להבין את סדר הגודל של תופעות כאלה הנוצרות על-ידי פטריות.
עד היום, הפערים הידע העיקריים הנוגעים מיקרוביאלי יליד דבורה אקולוגיה יכול להיות מיוצג על ידי בשאלות הבאות: באיזו מידה פטריות משנה הקהילה חיידקים בתוך דבורה אבקה-הוראות? מהן ההשפעות במורד הזרם של צריכת אבקה עם קהילה מיקרוביאלי שינו עמוקות? לשמור על השאלות האלה שהם נוגעים מבחינה אקולוגית, ניסויים שפותחו עם המטרות של חשיפת 1) את שאריות פטריות לבד יכול לגרום המושבה חמורה שקיעתה של מין יליד דבורה; 2) מידת שבה קהילות מיקרוביאלי בהוראות-אבקה שונו על ידי קוטלי פטריות ו- 3) כיצד דבורה בריאות מושפע על-ידי קהילה מיקרוביאלי שינו באופן חמור. מטרות הניסוי הוגדרו להתייחס אל כל השאלות הנ ל באמצעות שילוב של ניסויים במעבדה שדה מבוססות. מחקר זה באמצעות המדינה-of-the-art metagenomic טכניקות מולקולריות לצד שיטות מסורתיות של התבוננות שדה, שואפת לחבר את השפעת קוטלי פטריות אפשריות על בריאות דבורה.
המטרה הראשונה של מחקר זה היא להדגים כי חשיפה פטריות לבד יכול לגרום הפסדים משמעותיים המושבה בקרב ילידי דבורה מינים. מחקר מעורבים כלובים גדולים שדה שימש לחקור את ההשפעות של חשיפה פטריות על הגידול המושבה של הפרח בומבוס, דבורה מקורית בכל מקום, שפע בארה ב (איור 1, איור 2, איור 3). זה היה שיערו כי כוורות שטופלו פטריות שיציג כושר נמוך, ודמוגרפיה טיפוסיות בהשוואה כוורות שאינו חשוף. והנתונים שהתקבלו בניסוי תמיכה השערה זו, הוכחת כי שאריות פטריות בתוך אבקה יכול להיות הגורם הבלעדי של המושבה עמוקה הפסדים מינים דבורה במבל יליד25. המטרה השנייה של מחקר זה היא לחקור את התגובה של microbiome אבקה פטריות חשיפה. זה זה שיערו כי הרכב הקהילה של חיידקים בתוך אבקה-הוראות נחשפים קוטלי פטריות תהיה שונה מזו של אבקה ללא טיפול. בעוד פטרייתי השפע והמגוון צפויים לירידה משמעותית, חיידקים ו/או בזן פטרייתי דומיננטי אחד סביר יגדל לא מסומן בהיעדרו של פטריות מתחרים אחרים. דרך סדרה של ניסויים ב- vivo , אלה משמרות בהרכב הקהילה מיקרוביאלי ינותחו תוך שימוש metagenomics.

<table><tbody><tr><td>Natupol Beehive</td><td>Koppert</td><td>USRESM1</td><td>16 hives</td></tr><tr><td>Propiconazole 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazole 14.3%</td></tr><tr><td>Abound</td><td>Syngenta</td><td>4033540</td><td>Azoxystrobin 22.9%</td></tr><tr><td>Chlorothalonil</td><td>Syngenta</td><td>3452</td><td>Fungicide used for trials</td></tr><tr><td>Pollen granules</td><td>Bee rescued</td><td>B004D5650C</td><td>3X 16oz bottles, pollen for trials</td></tr><tr><td>Bacterial strains for inoculation</td><td>Currie Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast strains for inoculation</td><td>Hittinger lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer pairs</td><td>UW Biotech Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Isolation Kit</td><td>Mo Bio</td><td>12830-50</td><td>Commercial DNA isolation kit</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td>DNA quantification tool</td></tr><tr><td>Select Master Mix for CFX</td><td>Thermo Fisher</td><td>4472952</td><td>Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.</td></tr><tr><td>Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio Rad</td><td>1855196</td><td>Instrument used for PCR amplification</td></tr><tr><td>PCR Clean-Up Kit,</td><td>Axygen</td><td>10159-696</td><td>Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes</td></tr><tr><td>DNA 1000 Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Used for sizing and analysis of DNA fragments</td></tr><tr><td>MiSeq Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td>Used for next-generation sequencing</td></tr><tr><td>Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health

מגדלים מרבים להשתמש פטריות תרסיסים במהלך בלום, להגן על היבולים מפני המחלה, אשר חושף את הדבורים כדי פטריות שאריות. למרות נחשב "דבורה-בטוח", יש עדויות הרכבה פטריות שאריות אבקה משויכים דבורה ירידות (עבור גם דבש bumble דבורים מינים). בעוד המנגנונים עדיין לא ידועים יחסית, החוקרים העריכו כי דבורה-חיידק symbioses מעורבים. חיידקים לשחק תפקיד מרכזי לשימור ו/או עיבוד של אבקה, המשמש תזונה עבור דבורים זחל. על ידי שינוי בקהילה מיקרוביאלי, סביר כי קוטלי פטריות לשבש את שירותי אלה בתיווך חיידק, ובכך לסכן את בריאות דבורה. כתב יד זה מתאר בפרוטוקולים המשמשים כדי לחקור את mechanism(s) עקיף שבאמצעותו קוטלי פטריות עלול לגרום ירידה המושבה. כלוב ניסויים חשיפת דבורים פרחים שטופלו פטריות כבר סיפקו העדויות הראשונות כי קוטלי פטריות לגרום הפסדים המושבה עמוקה מקורית הדבורה (בומבוס הפרח). באמצעות שדה רלוונטי מינונים של קוטלי פטריות, סדרה של ניסויים פותחו כדי לספק תיאור עדינה יותר של הקהילה מיקרוביאלי הדינמיקה של אבקה החשופים פטריות. משמרות בהרכב מבנית של במכלולים פטרייתי ובקטריאליות בתוך microbiome אבקה נחקרות על-ידי הדור הבא רצפי וניתוח metagenomic. ניסויים שפותחו בזאת עוצבו כדי לספק הבנה מכניסטית של כיצד קוטלי פטריות משפיעים על microbiome של אבקה-הוראות. בסופו של דבר, ממצאים אלה צריך לשפוך אור על מסלול עקיף שדרכו קוטלי פטריות עלול לגרום ירידות המושבה.

מחקר שדה הכלוב:
והנתונים שהתקבלו כלוב הניסויים הראו כי המושבות bumble דבורים היה בתגובה פטריות חשיפה משמעותית. ההייבס שטופלו פטריות המיוצר באופן משמעותי פחות עובדים (12.2 ± 3.8, זאת אומרת ± SE) מאשר ההייבס שליטה (43.2 ± 11.2, F1,9= 6.8, p ...

Watch this Scientific Journal Video about Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health at JoVE.com

טכניקות אמפיריות, מטאנומיות וחישוביות מאירות את המנגנונים שבאמצעותם קוטלי פטריות פוגעים בבריאות הדבורים | סביבה | וִידֵאוֹ

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

קונסורציומים חיידקים בתוך bumble דבורים כוורות להעשיר ולשמר אבקה של דבורה הזחלים. באמצעות רצף הדור הבא, יחד עם המעבדה, המבוסס על שדה ניסויים, כתב יד זה מתאר פרוטוקולים המשמשים כדי לבדוק את ההשערה כי שאריות פטריות לשנות את microbiome אבקה, ודמוגרפיה המושבה, המוביל בסופו של דבר אל המושבה הפסד.

אמפירית, Metagenomic, שיטות חישוביות להאיר את מנגנוני הבריאות דבורה איזה פשרה קוטלי פטריות

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

empirical-metagenomic-computational-techniques-illuminate-mechanisms

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Environment

Ecology

Population and Community Ecology

SCIENTISTS IN ACTION

9.6K Views.  USDA-ARS. קונסורציומים חיידקים בתוך bumble דבורים כוורות להעשיר ולשמר אבקה של דבורה הזחלים. באמצעות רצף הדור הבא, יחד עם המעבדה, המבוסס על שדה ניסויים, כתב יד זה מתאר פרוטוקולים המשמשים כדי לבדוק את ההשערה כי שאריות פטריות לשנות את microbiome אבקה, ודמוגרפיה המושבה, המוביל בסופו ש...

Video: Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

הערכת ההשפעה של כימיקלים סביבתיים על התפתחות דבורת דבש מן הפרט אל רמת קולוני

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey bee colony numbers have been declining in the United States and many European countries since 1947. A number of factors play a role in this decline, including the unintentional exposure of honey bees to pesticides. The development of new methods and regulations are warranted to reduce pesticide exposures to these pollinators. One approach is the use of repellent chemistries that deter honey bees from a recently pesticide-treated crop. Here, we describe a protocol to discern the deterrence of honey bees exposed to select repellent chemistries. Honey bee foragers are collected and starved overnight in an incubator 15 h prior to testing. Individual honey bees are placed into Petri dishes that have either a sugar-agarose cube (control treatment) or sugar-agarose-compound cube (repellent treatment) placed into the middle of the dish. The Petri dish serves as the arena that is placed under a camera in a light box to record the honey bee locomotor activities using video tracking software. A total of 8 control and 8 repellent treatments were analyzed for a 10 min period with each treatment was duplicated with new honey bees. Here, we demonstrate that honey bees are deterred from the sugar-agarose cubes with a compound treatment whereas honey bees are attracted to the sugar-agarose cubes without an added compound.

The loss of honey bee colonies presents a challenge to crop pollination services. Current pollinator protection practices warrant an alternative approach to minimize the contact of honey bees to harmful pesticides using repellent chemistries. Here, we provide detailed methods for a visual tracking protocol to screen deterrents for bees.

פרוטוקול מעקב וידאו מסך ההרתעה Chemistries עבור דבורים דבש

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide regulation studies. The risk of exposure to fungicide residues is likely to be especially high if the spray occurs on, or near host plants while the bees are collecting pollen to provision their nests. For species of Osmia that consume pollen from a select group of plants (oligolecty), the inability to use pollen from non-host plants can increase their risk factor for fungicide-related toxicity. This manuscript describes protocols used to successfully rear oligolectic mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, from egg to prepupal stage within cell culture plates under standardized laboratory conditions. The in vitro-reared bees are subsequently used to investigate the effects of fungicide exposure and pollen source on bee fitness. Based on a 2 &#215; 2 fully crossed factorial design, the experiment examines the main and interactive effects of fungicide exposure and pollen source on larval fitness, quantified by prepupal biomass, larval developmental time, and survivorship. A major advantage of this technique is that using in vitro-reared bees reduces natural background variability and allows the simultaneous manipulation of multiple experimental parameters. The described protocol presents a versatile tool for hypotheses testing involving the suite of factors affecting bee health. For conservation efforts to be met with significant, lasting success, such insights into the complex interplay of physiological and environmental factors driving bee declines will prove to be critical.

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Fungicide sprays on flowering plants may expose solitary bees to high concentrations of pollen-borne fungicide residues. Using laboratory-based experiments involving in vitro-reared bee larvae, this study investigates the interactive effects of consuming fungicide-treated pollen derived from host and non-host plants.

במבחנה גידול דבורים בודד: כלי להערכת גורמי סיכון זחל

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in the shikimate pathway, which is virtually universal in plants. The inhibition of the enzyme stops the production of three essential amino acids: phenylalanine, tyrosine, and tryptophan. EPSPS is also present in fungi and prokaryotes, such as archaea and bacteria; thus, the use of GBP may have an impact on the microbiome composition of soils, plants, herbivores, and secondary consumers. This article aims to present general guidelines to assess the effect of GBP on microbiomes from field experiments to bioinformatics analyses and provide a few testable hypotheses. Two field experiments are presented to test the GBP on non-target organisms. First, plant-associated microbes from 10 replicated control and GBP treatment plots simulating no-till cropping are sampled and analyzed. In the second experiment, samples from experimental plots fertilized by either poultry manure containing glyphosate residues or non-treated control manure were obtained. Bioinformatics analysis of EPSPS protein sequences is utilized to determine the potential sensitivity of microbes to glyphosate. The first step in estimating the effect of GBP on microbiomes is to determine their potential sensitivity to the target enzyme (EPSPS). Microbial sequences can be obtained either from public repositories or by means of PCR amplification. However, in the majority of field studies, microbiome composition has been determined based on universal DNA markers such as the 16S rRNA and the internal transcribed spacer (ITS). In these cases, sensitivity to glyphosate can only be estimated through a probabilistic analysis of EPSPS sequences using closely related species. The quantification of the potential sensitivity of organisms to glyphosate, based on the EPSPS enzyme, provides a robust approach for further experiments to study target and non-target resistant mechanisms.

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. In this article, we introduce general guidelines to quantify the effect of GBP on microbiomes, from field experiments to bioinformatics analyses.

כימות ההשפעה הפוטנציאלית של מוצרים מבוססי גלייפוסט על מיקרוביום

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ingestion of provisions contaminated with pesticides may increase the mortality rate of the larvae, decrease the collection rate and the population of adult solitary bees in the next year from a demographic perspective. But there are limited studies on the effects of pesticides on the larvae of solitary bees. Therefore, understanding how pesticides influence the larvae of solitary bees should be considered an integral part of pesticide ecological risk assessment. This study presents a method to expose the larvae of solitary bee, Osmia excavata, to lethal or sublethal doses of pesticide, tracking larval weight gain, developmental duration, eclosion ability, and food consumption efficiency conversion of ingested food. To demonstrate the effectiveness of this method, the larvae of O. excavata were fed with provisions containing acute lethal and sublethal doses of chlorpyrifos. Then, the above indexes of the treated larvae were investigated. This technique helps to predict and mitigate the risk of pesticides to pollinators.

The present protocol explains a method to feed pesticide-contaminated provisions to the larvae of the solitary bees, Osmia excavata. The procedure examines the ecotoxicity of the pesticide to the larvae of the solitary bees.

הערכת ההשפעה של חומרי הדברה על הזחלים של הדבורים הבודדות

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

Biochemistry

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

מניפולציה Neuropharmacological של מאופקים חינם-עף דבש דבורים,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Neuroscience

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

ניטור המושבה ברמת ההשפעה של ההדברה לא קטלני על דבש דבורים

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee health, including exposure to viral pathogens. Such viruses can cause a wide variety of devastating effects and can often be challenging to study due to multiple factors that make it difficult to separate the effects of experimental treatments from preexisting background infection. Here we present a method to mass produce large quantities of virus particles along with a high throughput bioassay to test viral infection and effects. Necessitated by the current lack of a continuous, virus-free honey bee cell line, viral particles are amplified in vivo using honey bee pupae, which are extracted from the hive in large volumes using minimally stressful methodology. These virus particles can then be used in honey bee cage bioassays to test inocula viability, as well as various other virus infection dynamics, including interactions with nutrition, pesticides, and other pathogens. A major advantage of using such particles is that it greatly reduces the chances of introducing unknown variables in subsequent experimentation when compared to current alternatives, such as infection via infected bee hemolymph or homogenate, though care should still be taken when sourcing the bees, to minimize background virus contamination. The cage assays are not a substitute for large-scale, field-realistic experiments testing virus infection effects at a colony level, but instead function as a method to establish baseline viral responses that, in combination with the semi-pure virus particles, can serve as important tools to examine various dimensions of honey bee-virus physiological interactions.

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Here we describe two protocols: first to propagate, extract, purify, and quantify large quantities of honey bee non-enveloped virus particles, including a method for removing honey bee pupae and second to test the effects of viral infection using a highly repeatable, high-throughput cage bioassay.

הכנת אינוקולום מועשר בנגיף לזיהום אוראלי של דבורי דבש (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

הערכת הסיכון האגרוכימי למלכות דבורת הדבש המויזות

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

Cost-Effective Method for Safely Handling and Sampling Field-Collected Bees

A Rapid Method to Confine and Safely Handle Bees in the Field

Improving understanding of the basic biology and ecology of many insect pollinators, particularly specialist or rare taxa, is a priority for many researchers. As such, there is often a need to temporarily confine field-collected organisms in a non-injurious manner in order to gain information or support additional studies. This protocol represents a thoroughly tested, quick, and inexpensive field method for safely handling bees of conservation concern that can easily be tailored toward specific project needs, including organism identification, pollen removal, marking, and/or collection of non-lethal tissue samples for genetic analysis. This methodology can serve as an additional option in the researcher's toolbox to use when certain scenarios arise. It is anticipated that this methodology can be adapted for use with other insect species as well as used by individuals of varying experience and skill levels. It can be of great value to researchers studying specialist bees or conducting host-specific studies. The data collection made possible by this protocol will be invaluable to help researchers address critical data gaps for many pollinator species, plant-pollinator network structures, and pollinator conservation and management initiatives.

We demonstrate a tested method for safely handling field-collected bees. This method allows swift manipulation, identification, genetic sampling, and confirmation of plant-insect interactions via pollen collected while sampling. Easily adaptable, this approach offers a cost-effective, non-lethal means to study rare insect groups.

אמפירית, Metagenomic, שיטות חישוביות להאיר את מנגנוני הבריאות דבורה איזה פשרה קוטלי פטריות

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST