L’auteur remercie l’installation de séquençage ADN Université du Wisconsin Biotechnology Center permettant l’amplification et installations de séquençage et de services, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto et Max Haase pour fournir une assistance technique avec analyse moléculaire. Ce travail a été soutenu par les fonds de l’USDA-Agricultural Research Service ouvert (Current Research Information System #3655-21220-001). A été confortée par la National Science Foundation (sous le Grant No. DEB-1442148), le centre de recherche de bioénergie DOE Great Lakes (DOE Bureau des sciences DE BER-FC02-07ER64494) et l’USDA National Institute of Food et Agriculture (Hatch projet 1003258). C.T.H. est un érudit de Pew en Sciences biomédicales et Alfred Toepfer Faculté Fellow, appuyé par le Pew Charitable Trusts et la Fondation Alexander von Humboldt, respectivement.

1. examiner l’effet de l’exposition au fongicide sur Bumble Bee Colony succès à l’aide de Cage expériences sur le terrain <ol><li>Set up dix cages en treillis dans un domaine planté d’avoine. Creuser une tranchée autour de chaque cage et creusez tous les quatre bords de la cage de maille dans le sol pour s’assurer que les abeilles ne peuvent pas s’échapper. Les cages avec des plantes à fleurs en pot, qui sont connus pour être attractive pour les abeilles (p. ex. sarrasin, bourrache, alyssum, cosmos et tournesol) en stock ( Figure 2).</li>
	<li>Supplément les cages avec un seul plateau (36 x 42 cm) du trèfle en fleurs. Regrouper les ressources florales dans un coin de la cage, occupant un espace environ 2,5 m x 1 m. végéter la surface restante de la cage de l’avoine.</li>
	<li>Attribuer au hasard le bourdon, colonies, chaque contenant les travailleurs et une seule reine, un traitement (fongicide présent/absent, N = 5 colonies par traitement, totales 10 colonies), ensuite les placer dans une cage de champ (N = 1/cage) pendant 29 jours (23 juin -21 juillet 2014).</li>
	<li>Orienter les cases de la colonie telle que la colonie &#39; ouvertures s pointent vers le sud pour fournir les abeilles avec des conditions optimales de navigation. Subventionner les colonies avec les réservoirs d’eau de sucre, placées dans les cases de la ruche pour compléter la disponibilité de nectar.</li>
	<li>Appliquer axée sur le chlorothalonil fongicide au niveau champ pertinent (20 g/L) pour plantes à fleurs dans les cages de traitement cinq fongicide, à l’aide d’une main tenue pulvérisateur de pesticide, deux fois au cours de l’étude (jour 0 et 13). Enduire les fleurs uniformément tels qu’aucun autre liquide n’adhère aux surfaces florales ( Figure 3).</li>
	<li>À l’issue de l’étude de cage sur le terrain, enlever les colonies b. impatiens de cages à la main, refroidir les ruches en plaçant dans le congélateur -20 ° C pendant 20 min.</li>
	<li>Enlever les abeilles à l’aide de la pince stérile et noter le nombre de larves, les nymphes, les femelles adultes (je. e. butineuses) et les mâles adultes. À l’aide d’une balance analytique enregistrer le poids sec de la Reine mère, larves, nymphes, femelles adultes (c.-à-d. les fouilleurs de poubelles) et les mâles adultes.</li>
</ol> 2. Examiner les effets de l’exposition fongicide sur les communautés microbiennes dans les passages de Pollen de Bumble Bee nids à l’aide de laboratoire selon des essais In Vivo <ol><li>Pulverize acheté dans le commerce pollen à une poudre fine à l’aide d’une norme ball-Moulin de laboratoire. Stériliser en poudre pollen par trempage dans l’éthanol à 70 %, ce qui lui permet de s’évaporer du jour au lendemain sous la lumière UV. Vérifier la stérilité du pollen en ensemençant ~0.5 mg sur milieux gélosés polyvalent.
	<ol><li>à la sec, pollen stérile, à l’aide de pipettes stérilisés, ajoutez dosage pertinent de champ de fongicide : propiconazole à 14,3 % ; azoxystrobine à 22,9 % pour les traitements (0,74 µL et 0,65 µL respectivement / jour / la ruche). Mélangez bien à l’aide de bâtons en bois stérilisés.</li>
	</ol></li> <li>Place 6 ruches expérimental (n = 3 chaque de contrôle et de traitement) dans un laboratoire propre et hygiénique de benchtop maintenu à température ambiante. Chaque jour environ 4,27 g de pollen 34 , 35, mélangé avec des fongicides (pour les traitements) ou d’eau stérile (pour contrôle) à l’intérieur d’une hotte à l’aide de la technique d’asepsie standard.
	<ol><li>à l’aide des trappes fournis par le côté de la boîte en carton renfermant des ruches, introduire le pollen à l’intérieur de la ruche. Compléter les ruches avec une solution stérile de sucre chaque semaine. Continuer l’alimentation régime pendant quatre semaines.</li>
	</ol></li> <li>à la fin de l’étude en laboratoire, refroidir les ruches en plaçant dans le congélateur-20 ° C pendant 20 min. gratter le pollen-application des dispositions contenues dans les chambres de couvée à l’aide de forceps stérilisé et spatules et en place dans des tubes stériles de stockage. Conserver à-80 ° C. comte et enregistrer le poids des travailleurs et de la Reine-mère au début et fin de l’expérience (étape 1.7).</li>
	<li>Kits d’isoler l’ADN d’échantillons de pollen-disposition en utilisant l’isolement d’ADN disponible dans le commerce (voir Table des matières pour plus de détails).
	<ol><li>Ajouter 0,25 g de pollen-disposition d’extraction tubes, brièvement vortex mixer.</li>
		<li>Faire un 200 mg/mL solution de lysozyme dans l’eau distillée désionisée, suffisant pour 50 µL/échantillon. Agiter vigoureusement à la solution entièrement forme.</li>
		<li>Ajouter 50 µL de la solution de lysozyme aux tubes d’extraction avec échantillon dedans et bien mélanger en retournant plusieurs fois. Incuber le tube pendant 10 min à 37 ° C dans un bain d’eau. Si précipité a formé, chauffer la solution à 60 ° C jusqu'à dissolution avant utilisation.</li>
		<li>Ajouter 70 µL de solution de lyse aqueuse aux tubes d’extraction, fixer horizontalement sur un socle de vortex à plat avec du ruban adhésif et vortexer pendant 10 min. centrifuger les tubes à 10 000 g pendant 30 s à température ambiante.</li>
		<li>Transférer le surnageant dans un tube de prélèvement propre de 2 mL. Ajouter 250 µL de solution de précipitation de protéine et vortex pour 5 s. Incuber à 4 ° C pendant 5 min dans un bain de glace. 
		Remarque : Attendez entre 400 µL à 500 µL de liquide surnageant. Surnageant peut encore contenir certaines particules.</li>
		<li>Centrifuger les tubes à température ambiante pendant 1 min à 10 000 x g et transférer jusqu'à 600 µL du surnageant dans un tube de prélèvement propre de 2 mL. Ajouter 200 µL de solution de suppression d’inhibiteur aqueux, brièvement, vortex et incuber à 4 ° C pendant 5 min. centrifuger les tubes à température ambiante pendant 1 min à 10 000 x g. transférer jusqu'à 750 µL de liquide surnageant dans un tube de prélèvement propre de 2 mL.</li>
		<li>Ajouter 1200 µL de solution aqueuse de lier le surnageant et vortexer pendant 5 s. charger environ 675 µL du liquide surnageant sur un filtre de spin et centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Jeter le débit par.</li>
		<li>Répéter 2.4.7. deux fois par. 
		Nota : Un total de trois charges pour chaque échantillon traité sont nécessaires.</li>
		<li>Ajouter 500 µL éthanol et centrifuger à température ambiante pendant 30 s à 10 000 x g. jeter le débit à travers et centrifuger à nouveau à température ambiante pendant 1 min à 10 000 x g. Place spin filtre dans un tube de prélèvement propre de 2 mL.</li>
		<li>Ajouter 100 µL d’élution tampon au centre de la membrane filtrante. Centrifuger à température ambiante pendant 30 s à 10 000 x g. jeter le filtre de l’essorage. Magasin prélevés ADN entre-20 ° C et -80 ° C</li></ol></li> <li>usage isolé ADN pour l’ordonnancement de.
	<ol><li>Quantifier et de normaliser l’ADN isolé à 2 ng/µL par analyse fluorimétrique.
		Réactions <ol><li>Prepare en trois exemplaires pour chaque échantillon prélevé comparer les quantités relatives de 28 s (plante), analyser sa (champignons) et 16 s (bactérienne) composants de chaque échantillon de pollen-disposition 36. S’assurer que chaque réaction contienne 10 ng d’ADN total x 2 du mélange principal de colorant à base de cyanine asymétriques et 2,5 µL de chaque des amorces et inverses paires 28KJ/28, b 37 pour plante et ITS1/ITS5.8R pour l’ADN fongique 38 .</li>
		</ol></li> <li>Amplifier l’ADN en utilisant les paramètres suivants : dénaturation préalable 2 min à 50 ° C, dénaturation initiale de 2 min à 95 ° C, 40 cycles de (15 s à 98 ° C, 15 s à 58 ° C, 60 s à 72 ° C), suivie par une courbe fonte.</li>
		<li>Préparer un protocole PCR 2-step, imbriqué à l’aide de bibliothèques de séquençage de prochaine génération ciblant l’ARNr 16 s région variable V3/V4 et STI / 5,8 s espaceur ARNr.
		<ol><li>Ajouter 12,5 µL d’ADN à 5 pmol de chaque amorce et 2 x mélange principal. Faire des réactions distinctes pour chaque région (16 s ou STI ; voir tableau 1). Modifier des amorces spécifiques de région comme décrit précédemment 39 ,, 40, d’ajouter des séquences nucléotidiques spécifiques séquenceur Adaptateur porte-à-faux pour les séquences de gène-spécifique.</li>
			<li>Exécuter amplification initiale en utilisant les paramètres suivants : dénaturation initiale de 3 min à 95 ° C, 25 cycles de (30 s à 95 ° C, 30 s à 55 ° C, 30 s à 72 ° C), extension finale 5 min à 72 ° C.</li>
			<li>Qui suit initial d’amplification, vérifiez la taille de la bibliothèque et la quantité de mobilité électrophorétique et nettoyer à l’aide d’un 1 x volume en phase solide réversible immperles d’obilization pour enlever les amorces résiduels et les réactifs de la réaction. Piscine de 16 ans et les amplicons quantitativement pour créer un pool de l’amplicon unique pour chaque échantillon.</li>
			<li>Ajouter des adaptateurs spécifiques séquenceur et dégustez duals spécifiques utilisant les amorces suivantes (voir tableau 1). Ajouter 2,5 µL d’ADN amplifié à 5 pmol de chaque amorce et 2 x mélange principal. Effectuer l’amplification de bibliothèque en utilisant les paramètres suivants : dénaturation initiale de 3 min à 95 ° C, 8 cycles de (30 s à 95 ° C, 30 s à 55 ° C, 30 s à 72 ° C), extension finale 5 min à 72 ° C.</li>
		</ol></li> <li>PCR suivant, bibliothèques propre finis à l’aide d’un volume de 1 x de billes d’immobilisées réversible en phase solide. Évaluer la qualité et la quantité des bibliothèques finis à l’aide de mobilité électrophorétique et fluorimétrie, respectivement. Normaliser les bibliothèques à 2 µM et piscine avant séquençage.</li>
		<li>Effectuer le séquençage de nouvelle génération sur une plate-forme analogue aux cartes ajoutées dans la PCR secondaire, avec une longueur adaptée pour couvrir l' amplicon ensemble 41.</li>
	</ol></li> <li>Séquence annotation et l’analyse de la composition microbienne.
	<ol><li>Moissonneuses paire-fin les données du séquençage (R1 et R2) en contigs unique pour les bibliothèques tout séquencées. Après la fusion des fichiers fois R1 et R2, format fasta unique pour chacune des bibliothèques est produite. 
		Remarque : Cette étape et les processus décrits ci-dessous (sauf indication contraire) sont effectuées en Mothur version 1.38.0 38.</li>
		<li>D’écran chaque fichier fasta pour supprimer des bases ambiguës et inattendu de longues séquences long homopolymères. 
		Remarque : Les paramètres pour le dépistage et le retrait de la séquence sont maxambig = 0, maxlength = 600 et maxhomop = 8 pour les deux gènes. Supprimer des séquences identiques, mais garder une table menace séparément pour toutes les bibliothèques (alias comte table Mothur).</li>
		<li>Alignement des séquences uniques de la bibliothèque du gène 16 s contre la version de base de données SILVA 123 et la STI génothèque contre la de base de données unir ses 42. 
		Remarque : Les séquences doivent être annotées au niveau du Royaume au niveau du genre.
		<ol><li>Par la suite, cluster alignés séquences avec la fonction pre.cluster à l’aide de diff = 5 et supprimer les chimères.</li>
		</ol></li> <li>Classer les séquences à l’aide de la méthode Wang 43 basé sur les unir ses (pour le gène ITS) taxonomie fichiers (valeur seuil de 80 %) et SILVA (pour le gène 16 s).</li>
		<li>Charger dans R 44 les tableaux de menace (un par gène) générés lors du processus de classification en Mothur. À chaque niveau taxinomique, obtenir l’abondance relative par bibliothèque pour une analyse plus approfondie des changements de population microbienne. 
		Remarque : À chaque niveau taxinomique, fusionner les groupes taxonomiques lorsque l’abondance relative est inférieure à 2 % pour toutes les répétitions expérimentales.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Recherches sur les effets des fongicides sur la santé des abeilles sont restées un aspect peu étudiée de stratégies de lutte antiparasitaire. Notre étude vise à combler cette lacune à l’aide d’un ensemble de techniques complémentaires qui isolent explicitement les facteurs possibles baisses de l’abeille. La planification, la justification et le rendu de ces expériences sont détaillées ci-dessous.
Il est important de s’assurer qu’aucune abeille n’est autorisés à s’é...

Géré et espèces d’abeilles sauvages connaissent des baisses généralisées, avec des implications majeures pour les deux systèmes naturels et agricoles1. Malgré les efforts concertés pour comprendre les causes de ce problème, les facteurs à l’origine de miel abeille baisses ne sont pas encore bien compris2,3,4. Pour certaines espèces d’abeilles sauvages, indigènes, la situation est devenue grave5,6. Si les populations d’abeilles ne saurait être maintenues lorsqu’elles se croisent avec l’agriculture industrielle, leurs populations continuent de baisser et les cultures nécessitant des pollinisateurs (35 % de la production mondiale7) durera réduit les récoltes.
Alors que de nombreux facteurs potentiels tels que l’exposition aux pesticides, maladies et habitat perte1,4,8,9,10 ont été impliqués en déclin d’abeille miel, On connaît assez l’effet interactif de ces facteurs de stress sur la santé des abeilles indigènes, au sein ou à proximité des systèmes agricoles. De nombreux efforts de recherche actuels continuent de se concentrer sur les insecticides, (p. ex., néonicotinoïdes11,12), bien que des recherches antérieures indiquent que fongicides peuvent également jouer un rôle dans le déclin de l’abeille en altérant la formation de la mémoire, réception olfactive13, nid reconnaissance14, l’activité enzymatique et fonctions métaboliques15,16,17. Dans le monde, fongicides continuent de s’appliquer aux cultures de floraison pendant la floraison. Des études récentes démontrent que les abeilles ramener couramment des résidus de fongicide à la ruche18, en effet, des études ont montré une forte proportion des ruches testés contenaient des résidus fongicide19,20. Poursuite des travaux a révélé que les résidus fongicide sont associée à des taux élevés de miel abeille la mortalité larvaire21,22,23 et la présence de « pollen enseveli » au sein de colonies, qui bien que non toxique, est dépourvu d’activité microbienne et nutritionnellement compromis24. Malgré le fait que fongicides ont longtemps été considérés comme « abeille-safe », il est désormais établi que l’exposition aux fongicides seul peut causer des pertes sévères colonie dans une espèces de bourdons native, Bombus impatiens25.
Pour établir le lien de causalité entre l’exposition de fongicide et colonie de mortalité, modus operandi de ces produits chimiques doivent être déterminées. Comme en témoigne les sols26, sédiments27et28de milieux aquatiques, en ciblant les champignons, fongicides probables modifient fongique abondance et la diversité au sein de pollen-dispositions, invoquant ainsi une très importante communauté shift qui peut fortement favoriser les bactéries. Sans concurrents fongiques ou antagonistes, certaines bactéries pathogènes peuvent proliférer relativement non coché, facilitant la détérioration des dispositions en matière de pollen. Recherches antérieures a démontré que les microorganismes, en particulier les levures et les champignons, servent de symbiotes nutritionnels pour abeilles29,30,31, protéger contre les parasites et agents pathogènes32 ,33et prévoir la conservation à long terme du pollen magasins. Fongicides, par conséquent, peuvent nuire indirectement abeilles immatures en perturbant la communauté microbienne qui est nécessaire pour fournir ces services, et/ou en augmentant la sensibilité aux agents pathogènes et parasites opportunistes12. Avec l’augmentation des demandes sur la production alimentaire, les cultures dans le monde entier sont à peindre chaque année avec des fongicides pendant la floraison, soulignant la nécessité de comprendre l’ampleur de ces effets induits par le fongicide.
À ce jour, les lacunes de connaissances primaires relatives aux abeilles indigènes microbienne écologie peut être représenté par les questions suivantes : dans quelle mesure le fongicide modifie-t-elle la communauté microbienne au pollen d’abeille-dispositions ? Quels sont les impacts en aval de la consommation de pollen avec une communauté microbienne profondément altérée ? En gardant ces questions pertinentes sur le plan écologique, des expériences ont été élaborés avec les principaux objectifs de révéler 1) que seuls les résidus fongicide peuvent causer la colonie grave déclin dans une espèce d’abeilles indigènes ; 2) le degré auquel des communautés microbiennes dans les dispositions en matière de pollen sont altérées par fongicides et 3) Comment la santé des abeilles est affectée par une communauté microbienne gravement altérée. Les objectifs expérimentaux ont été définies pour répondre aux questions ci-dessus en utilisant une combinaison d’expériences de laboratoire - et sur le terrain. À l’aide d’état-of-the-art métagénomique et techniques moléculaires avec les méthodes traditionnelles d’observation sur le terrain, cette recherche vise à reconstituer les effets potentiels des fongicides sur la santé des abeilles.
Le premier objectif de cette étude est de démontrer que l’exposition fongicide seule peut entraîner des pertes de colonie importante parmi les espèces d’abeilles indigènes. Une étude portant sur les cages de grand champ a été utilisée pour étudier les effets de l’exposition de fongicide sur la croissance de la colonie Bombus impatiens, une abeille indigène omniprésente et abondante aux États-Unis (Figure 1, Figure 2, Figure 3). L’hypothèse a été que les ruches traitées par des fongicides présentera une aptitude inférieure et démographie atypique par rapport aux ruches non exposés. Données tirées de cette expérience appuient cette hypothèse, en démontrant que des résidus de fongicide dans le pollen peuvent être la seule cause des pertes de colonie profonde dans un natif bumble bee espèces25. Le deuxième objectif de cette étude est d’étudier la réponse du microbiome du pollen à l’exposition de fongicide. Il est possible que la composition de la communauté des microbes dans pollen-dispositions exposées aux fongicides sera différente de celle du pollen non traitée. Alors que la diversité et l’abondance de champignon devraient diminuer considérablement, bactéries ou une seule espèce fongique dominante augmentera probablement incontrôlée en l’absence d’autres champignons concurrentes. Grâce à une série d’essais in vivo , ces changements dans la composition des communautés microbiennes seront analysées à l’aide de métagénomique.

<table><tbody><tr><td>Natupol Beehive</td><td>Koppert</td><td>USRESM1</td><td>16 hives</td></tr><tr><td>Propiconazole 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazole 14.3%</td></tr><tr><td>Abound</td><td>Syngenta</td><td>4033540</td><td>Azoxystrobin 22.9%</td></tr><tr><td>Chlorothalonil</td><td>Syngenta</td><td>3452</td><td>Fungicide used for trials</td></tr><tr><td>Pollen granules</td><td>Bee rescued</td><td>B004D5650C</td><td>3X 16oz bottles, pollen for trials</td></tr><tr><td>Bacterial strains for inoculation</td><td>Currie Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast strains for inoculation</td><td>Hittinger lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer pairs</td><td>UW Biotech Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Isolation Kit</td><td>Mo Bio</td><td>12830-50</td><td>Commercial DNA isolation kit</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td>DNA quantification tool</td></tr><tr><td>Select Master Mix for CFX</td><td>Thermo Fisher</td><td>4472952</td><td>Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.</td></tr><tr><td>Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio Rad</td><td>1855196</td><td>Instrument used for PCR amplification</td></tr><tr><td>PCR Clean-Up Kit,</td><td>Axygen</td><td>10159-696</td><td>Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes</td></tr><tr><td>DNA 1000 Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Used for sizing and analysis of DNA fragments</td></tr><tr><td>MiSeq Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td>Used for next-generation sequencing</td></tr><tr><td>Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health

Les producteurs utilisent souvent les pulvérisations pendant la floraison pour protéger les cultures contre les maladies, qui expose les abeilles à des résidus de fongicide. Bien que considéré comme « abeille-safe », il y a des preuves grandissantes que des résidus de fongicide dans le pollen sont associés à des déclins d’abeille (pour les espèces d’abeilles de miel et de bourdons). Alors que les mécanismes restent relativement peu connus, les chercheurs ont émis l’hypothèse que symbioses abeille-microbe sont impliqués. Microbes jouent un rôle essentiel dans la conservation et/ou de transformation de pollen, qui sert de nutrition pour les abeilles larvaires. En altérant la communauté microbienne, il est probable que les fongicides perturbent ces services induite par le microbe et ainsi compromettent la santé des abeilles. Ce manuscrit décrit les protocoles utilisés pour étudier les mécanismes indirects par lequel fongicides peuvent être responsables de déclin de la colonie. Expériences de cage exposition des abeilles aux fleurs traitées par des fongicides ont déjà fourni la première preuve que fongicides causent des pertes de colonies profonde dans un natif bourdon (Bombus impatiens). À l’aide de champ les doses de fongicides, une série d’expériences ont été développés afin de fournir une description plus fine de la dynamique des communautés microbiennes de pollen exposés au fongicide. Changements dans la composition structurelle des assemblages fongiques et bactériennes dans le microbiome du pollen sont étudiés par séquençage de prochaine génération et analyse métagénomique. Expériences élaborées dans cet article ont été conçues pour fournir une interprétation mécaniste de l’incidence des fongicides sur le microbiome du pollen-dispositions. En fin de compte, ces résultats devraient faire la lumière sur la voie indirecte, à travers lequel fongicides peuvent être responsables de déclin de la colonie.

Étude de terrain de cage :
Données obtenues à partir des expériences de cage a montré que les colonies d’abeilles de bourdon avaient une réponse significative à l’exposition de fongicide. Les ruches traitées par des fongicides produit beaucoup moins de travailleurs (12,2 ± 3.8, moyenne ± et) que les ruches de contrôle (43,2 ± 11.2, F1,9= 6,8, p = 0,03) (Fig...

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Des techniques empiriques, métagénomiques et informatiques éclairent les mécanismes par lesquels les fongicides compromettent la santé des abeilles | Environnement | Vidéo

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Les consortiums microbiens dans les ruches de bourdons enrichissent et conserver le pollen pour les larves d’abeilles. Prochaine génération séquençage, ainsi que le laboratoire et les expériences sur le terrain, ce manuscrit décrit les protocoles utilisés pour vérifier l’hypothèse que des résidus de fongicide modifient le microbiome du pollen et la démographie de colonie, conduisant finalement à la colonie perte.

Techniques de calcul empirique et métagénomique éclairent les mécanismes de fongicides compromis Bee santé

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

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Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

Évaluation de l&#39;incidence des produits chimiques sur l&#39;environnement Miel de développement Abeille de l&#39;individu à la colonie Niveau

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

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Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey bee colony numbers have been declining in the United States and many European countries since 1947. A number of factors play a role in this decline, including the unintentional exposure of honey bees to pesticides. The development of new methods and regulations are warranted to reduce pesticide exposures to these pollinators. One approach is the use of repellent chemistries that deter honey bees from a recently pesticide-treated crop. Here, we describe a protocol to discern the deterrence of honey bees exposed to select repellent chemistries. Honey bee foragers are collected and starved overnight in an incubator 15 h prior to testing. Individual honey bees are placed into Petri dishes that have either a sugar-agarose cube (control treatment) or sugar-agarose-compound cube (repellent treatment) placed into the middle of the dish. The Petri dish serves as the arena that is placed under a camera in a light box to record the honey bee locomotor activities using video tracking software. A total of 8 control and 8 repellent treatments were analyzed for a 10 min period with each treatment was duplicated with new honey bees. Here, we demonstrate that honey bees are deterred from the sugar-agarose cubes with a compound treatment whereas honey bees are attracted to the sugar-agarose cubes without an added compound.

The loss of honey bee colonies presents a challenge to crop pollination services. Current pollinator protection practices warrant an alternative approach to minimize the contact of honey bees to harmful pesticides using repellent chemistries. Here, we provide detailed methods for a visual tracking protocol to screen deterrents for bees.

Protocole de suivi vidéo pour les chimies de dissolution d&#39;écran pour les abeilles

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide regulation studies. The risk of exposure to fungicide residues is likely to be especially high if the spray occurs on, or near host plants while the bees are collecting pollen to provision their nests. For species of Osmia that consume pollen from a select group of plants (oligolecty), the inability to use pollen from non-host plants can increase their risk factor for fungicide-related toxicity. This manuscript describes protocols used to successfully rear oligolectic mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, from egg to prepupal stage within cell culture plates under standardized laboratory conditions. The in vitro-reared bees are subsequently used to investigate the effects of fungicide exposure and pollen source on bee fitness. Based on a 2 &#215; 2 fully crossed factorial design, the experiment examines the main and interactive effects of fungicide exposure and pollen source on larval fitness, quantified by prepupal biomass, larval developmental time, and survivorship. A major advantage of this technique is that using in vitro-reared bees reduces natural background variability and allows the simultaneous manipulation of multiple experimental parameters. The described protocol presents a versatile tool for hypotheses testing involving the suite of factors affecting bee health. For conservation efforts to be met with significant, lasting success, such insights into the complex interplay of physiological and environmental factors driving bee declines will prove to be critical.

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Fungicide sprays on flowering plants may expose solitary bees to high concentrations of pollen-borne fungicide residues. Using laboratory-based experiments involving in vitro-reared bee larvae, this study investigates the interactive effects of consuming fungicide-treated pollen derived from host and non-host plants.

In Vitro Élevage des abeilles solitaires : un outil pour évaluer les facteurs de risque larvaire

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in the shikimate pathway, which is virtually universal in plants. The inhibition of the enzyme stops the production of three essential amino acids: phenylalanine, tyrosine, and tryptophan. EPSPS is also present in fungi and prokaryotes, such as archaea and bacteria; thus, the use of GBP may have an impact on the microbiome composition of soils, plants, herbivores, and secondary consumers. This article aims to present general guidelines to assess the effect of GBP on microbiomes from field experiments to bioinformatics analyses and provide a few testable hypotheses. Two field experiments are presented to test the GBP on non-target organisms. First, plant-associated microbes from 10 replicated control and GBP treatment plots simulating no-till cropping are sampled and analyzed. In the second experiment, samples from experimental plots fertilized by either poultry manure containing glyphosate residues or non-treated control manure were obtained. Bioinformatics analysis of EPSPS protein sequences is utilized to determine the potential sensitivity of microbes to glyphosate. The first step in estimating the effect of GBP on microbiomes is to determine their potential sensitivity to the target enzyme (EPSPS). Microbial sequences can be obtained either from public repositories or by means of PCR amplification. However, in the majority of field studies, microbiome composition has been determined based on universal DNA markers such as the 16S rRNA and the internal transcribed spacer (ITS). In these cases, sensitivity to glyphosate can only be estimated through a probabilistic analysis of EPSPS sequences using closely related species. The quantification of the potential sensitivity of organisms to glyphosate, based on the EPSPS enzyme, provides a robust approach for further experiments to study target and non-target resistant mechanisms.

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. In this article, we introduce general guidelines to quantify the effect of GBP on microbiomes, from field experiments to bioinformatics analyses.

Quantification de l’impact potentiel des produits à base de glyphosate sur les microbiomes

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ingestion of provisions contaminated with pesticides may increase the mortality rate of the larvae, decrease the collection rate and the population of adult solitary bees in the next year from a demographic perspective. But there are limited studies on the effects of pesticides on the larvae of solitary bees. Therefore, understanding how pesticides influence the larvae of solitary bees should be considered an integral part of pesticide ecological risk assessment. This study presents a method to expose the larvae of solitary bee, Osmia excavata, to lethal or sublethal doses of pesticide, tracking larval weight gain, developmental duration, eclosion ability, and food consumption efficiency conversion of ingested food. To demonstrate the effectiveness of this method, the larvae of O. excavata were fed with provisions containing acute lethal and sublethal doses of chlorpyrifos. Then, the above indexes of the treated larvae were investigated. This technique helps to predict and mitigate the risk of pesticides to pollinators.

The present protocol explains a method to feed pesticide-contaminated provisions to the larvae of the solitary bees, Osmia excavata. The procedure examines the ecotoxicity of the pesticide to the larvae of the solitary bees.

Évaluation de l’effet des pesticides sur les larves des abeilles solitaires

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

Biochimie

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Manipulation neuropharmacologiques de Restrained et vol libre abeilles,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Neurosciences

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Surveiller les effets de la colonie-niveau d’exposition aux pesticides sublétale sur les abeilles à miel

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Biologie

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee health, including exposure to viral pathogens. Such viruses can cause a wide variety of devastating effects and can often be challenging to study due to multiple factors that make it difficult to separate the effects of experimental treatments from preexisting background infection. Here we present a method to mass produce large quantities of virus particles along with a high throughput bioassay to test viral infection and effects. Necessitated by the current lack of a continuous, virus-free honey bee cell line, viral particles are amplified in vivo using honey bee pupae, which are extracted from the hive in large volumes using minimally stressful methodology. These virus particles can then be used in honey bee cage bioassays to test inocula viability, as well as various other virus infection dynamics, including interactions with nutrition, pesticides, and other pathogens. A major advantage of using such particles is that it greatly reduces the chances of introducing unknown variables in subsequent experimentation when compared to current alternatives, such as infection via infected bee hemolymph or homogenate, though care should still be taken when sourcing the bees, to minimize background virus contamination. The cage assays are not a substitute for large-scale, field-realistic experiments testing virus infection effects at a colony level, but instead function as a method to establish baseline viral responses that, in combination with the semi-pure virus particles, can serve as important tools to examine various dimensions of honey bee-virus physiological interactions.

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Here we describe two protocols: first to propagate, extract, purify, and quantify large quantities of honey bee non-enveloped virus particles, including a method for removing honey bee pupae and second to test the effects of viral infection using a highly repeatable, high-throughput cage bioassay.

Préparation de l’inoculum enrichi en virus pour l’infection orale des abeilles mellifères (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Évaluation du risque agrochimique pour les reines d’abeilles mellifères accouplées

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

Cost-Effective Method for Safely Handling and Sampling Field-Collected Bees

A Rapid Method to Confine and Safely Handle Bees in the Field

Improving understanding of the basic biology and ecology of many insect pollinators, particularly specialist or rare taxa, is a priority for many researchers. As such, there is often a need to temporarily confine field-collected organisms in a non-injurious manner in order to gain information or support additional studies. This protocol represents a thoroughly tested, quick, and inexpensive field method for safely handling bees of conservation concern that can easily be tailored toward specific project needs, including organism identification, pollen removal, marking, and/or collection of non-lethal tissue samples for genetic analysis. This methodology can serve as an additional option in the researcher's toolbox to use when certain scenarios arise. It is anticipated that this methodology can be adapted for use with other insect species as well as used by individuals of varying experience and skill levels. It can be of great value to researchers studying specialist bees or conducting host-specific studies. The data collection made possible by this protocol will be invaluable to help researchers address critical data gaps for many pollinator species, plant-pollinator network structures, and pollinator conservation and management initiatives.

We demonstrate a tested method for safely handling field-collected bees. This method allows swift manipulation, identification, genetic sampling, and confirmation of plant-insect interactions via pollen collected while sampling. Easily adaptable, this approach offers a cost-effective, non-lethal means to study rare insect groups.

Techniques de calcul empirique et métagénomique éclairent les mécanismes de fongicides compromis Bee santé

Résumé

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