저자는 위스콘신 대학교의 생명 공학 센터 DNA 시퀀싱 시설을 기술 지원 확대 및 시퀀싱 시설 및 서비스, 케이 틀린 칼 슨, 제니퍼 요령, 제이크 오토, 및 최대 세 제공을 위한 감사 합니다. 분자 분석입니다. 이 작품은 미국 농 무부 농업 연구 서비스 충당 기금 (현재 연구 정보 시스템 #3655-21220-001)에 의해 지원 되었다. 추가 지원 (보조금 번호 아래 국립 과학 재단에 의해 제공 되었다 DEB-1442148), 미상 그레이트 호수 Bioenergy 연구 센터 (과학 BER 드-FC02-07ER64494의 암컷 사무실), 미국 농 무부 식품과 농업 (해치 프로젝트 1003258). C.T.H. 생물 의학에는 Alfred Toepfer 교수 동료, 퓨 자선 트러스트와 알렉산더 폰 훔볼트 재단에 의해 지원 되는 각각 퓨 학자 이다.

1. 윙윙 거리 다 꿀벌 식민지 성공을 사용 하 여 필드 케이지 실험에서 살 균 제 노출의 효과 검사 필드에서 <ol><li>세트 10 최대 메쉬 케이지 귀리 심어 져. 각 케이지 주위에 참호를 파고 하 고 꿀벌도 주 할 수 있도록 지상으로 메쉬 케이지의 모든 4 개의 가장자리를 파고. 재고, 꽃 화분 (예: 메 밀, borage, 냉이, 코스모스와 해바라기) 꿀벌을 매력적인 것으로 알려진와 케이지 ( 그림 2).</li>
	<li>보충에 꽃 클로버의 단일 트레이 (36 cm x 42 cm)와 감 금 소. 감 금 소, 귀리에 의해 약 2.5 m x 1 m. 단조로운 나머지 케이지 영역 공간을 점령의 한 구석에 꽃 리소스 클러스터.</li>
	<li>무작위로 할당 범블 비 식민지, 각 포함 된 노동자와 단일 여왕, 치료 (균 현재/결 석, N = 치료 당 5 식민지, 총 10 식민지), 필드 케이지 내에서 그들을 장소 (N = 1/케이지) 29 일 (6 월 23 일 -2014 년 7 월 21 일).</li>
	<li>동양 식민지 상자는 식민지 &#39; 남쪽 꿀벌 최적의 탐색 조건 제공으로 가리키도록 s 구멍. 설탕 물 방광, 과즙 가용성을 보완 하기 위해 하이브 상자 내부에 배치와 함께 식민지 보조금.</li>
	<li>적용 균 chlorothalonil 기반 5 균 치료 장에 꽃 식물 분야 관련 수준 (20 g/L), 연구 (0, 13 일) 기간 동안 두 번 농약 분무기를 개최 손을 사용 하 여. 아니 더 액체 꽃 표면 ( 그림 3)에 고착 되도록 균일 하 게 꽃을 코트.</li>
	<li>필드 케이지 연구의 결론에는 연습장에서 B. 봉 식민지를 손으로 제거, 20 분-20 ° C 냉장고에 배치 하 여 두 드러 기를 냉각</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여 꿀벌을 제거 하 고 애벌레, 번데기, 성인 여성 수를 기록 (나. e. 채집), 그리고 성인 남성. 어머니 여왕, 애벌레, pupae, 성인 여성 (즉 채집), 그리고 성인 남성의 건조 중량을 기록 분석 균형을 사용 하 여.</li>
</ol> 2. 엉망으로 꿀벌 둥지를 사용 하 여 실험실 기반 Vivo에서 시험의 꽃가루 규정에 미생물 지역 사회에 살 균 제 노출의 효과 검사 <ol><li>Pulverize 상업적으로 구입한 꽃가루는 표준을 사용 하 여 정밀한 분말에 실험실 볼-밀입니다. UV 빛 아래에서 하룻밤 증발을 70% 에탄올에 몸을 담글 하 여 가루 꽃가루를 소독. ~0.5 mg 범용 한 천 매체에 도금 하 여 꽃가루의 무 균을 확인 합니다.
	<ol><li>건조, 소독된 꽃가루, 소독된 펫을 사용 하 여 추가 균의 필드 관련 된 복용량: 14.3%;에서 propiconazole 치료에 대 한 22.9%에서 azoxystrobin (0.74 µ L 및 0.65 µ L 각각 / 일 / 하이브). 잘 소독된 나무 막대기를 사용 하 여 혼합.</li>
	</ol></li> <li>장소 6 실험 하이브 (n = 3 각 제어 및 치료에 대 한) 깨끗 하 고 위생 실험실 벤치탑 실내 온도에 유지에서. 매일 무게 꽃가루 34 , 35 (치료)에 대 한 살 균 제 또는 표준 무 균 기술을 사용 하 여 후드 안쪽 (컨트롤)에 대 한 살 균 물과 혼합의 4.27 g.
	<ol><li>트랩 문 바깥쪽 두 드러 기, 골 판지 상자의 측에 의해 제공를 사용 하 여 두 드러 기 안에 꽃가루 소개. 매주 소독된 설탕 솔루션으로 두 드러 기를 보충 한다. 4 주 동안 정권 먹이 계속.</li>
	</ol></li> <li>20 분 긁어 소독된 집게 주걱을 사용 하 여 브루 드 챔버 내에 포함 된 꽃가루 규정 밖으로-20 ° C 냉장고에 놓고 멸 균 저장 관에서 두 드러 기 연구소 기반 연구의 결론에 냉각. 스토어-80 ° C. 수 및 기록 노동자와 시작 및 실험 (단계 1.7)의 끝에 여왕 어머니의 무게.</li>
	<li>상용 DNA 격리를 사용 하 여 꽃가루 제공 샘플에서 DNA 분리 키트 (자세한 자료 표 참조).
	<ol><li>조항의 꽃가루-추출 0.25 g 튜브, 짧게 소용돌이를 섞어 추가.</li>
		<li>는 Lysozyme 솔루션 50 µ L/샘플에 대 한 충분 한 이온을 제거 된 증류수에 200 mg/mL 확인합니다. 완전히 양식 솔루션을 적극적으로 악수.</li>
		<li>, 샘플 추출 관을 lysozyme 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 여러 번을 반전 하 여 잘 혼합. 물 욕조에 37 ° C에서 10 분 동안 튜브를 품 어. 침전을 형성 하는 경우 열 솔루션을 사용 하기 전에 해산 될 때까지 60 ° C.</li>
		<li>추출 관에 수성 세포 솔루션의 추가 70 µ L 테이프, 평판 소용돌이 패드에 가로로 보안 및 30에 대 한 10000 x g에서 10 분 원심 분리기에 대 한 소용돌이 관 실 온에서 s.</li>
		<li>깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브는 상쾌한 전송. 250 µ L 단백질 강 수 솔루션, 그리고 소용돌이의 얼음 욕조에 5 분 동안 4 ° C에서 5 미 품 추가. 
		참고: 상쾌한의 500 µ L 400 µ L 사이 기대 합니다. 상쾌한 여전히 몇 가지 입자를 포함할 수 있습니다.</li>
		<li>10000 x g에서 1 분 동안 실내 온도에 튜브 원심 하 고 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브에 상쾌한의 최대 600 µ L를 전송. 수성 억제제 제거 솔루션, 짧게, 소용돌이의 200 µ L을 추가 하 고 5 분 원심 분리기 10000 x g.에 1 분 동안 실내 온도에 튜브는 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브로 상쾌한의 750 µ L까지 전송 4 ° C에서 품 어.</li>
		<li>상쾌한, 그리고 5와 동을 수성 바인딩 솔루션의 추가 1200 µ L s. 스핀 필터, 실내 온도에 1 분 동안 10000 x g에서 원심 분리기에 상쾌한의 약 675 µ L 로드. 삭제를 통해 흐름.</li>
		<li>반복 2.4.7. 두 번. 
		참고: 각 샘플 처리에 대 한 3 중의 총은 필요.</li>
		<li>추가 500 µ L 에탄올, 및 30에 대 한 상 온에서 원심 분리기 10000 x g.에서 s, 흐름을 무시 하 고 g. 장소 스핀 필터 청소 2 mL 컬렉션 튜브에서 x 10, 000에서 1 분 동안 실내 온도에 다시 원심.</li>
		<li>차입의 추가 100 µ L 버퍼 필터 멤브레인의 중심입니다. 30에 대 한 상 온에서 원심 분리기 s 10000 x g. 스핀 필터 삭제. 스토어-20 ° C-80 ° C 사이의 DNA 수집</li></ol></li> <li>사용 절연 DNA 시퀀싱.
	<li>계량, <ol>그리고 fluorometric 분석에 의해 고립 된 DNA 2 ng / µ L를 정상화.
		각 추출 샘플 28S의 상대적 양을 비교 3 중에 <ol><li>준비 반응 (공장), 그 (곰 팡이), 분석 및 각 화분 제공 샘플 36의 16S (세균성) 구성 요소. 10 각 반응에 포함 되어 있는지 확인 전체 DNA, 비대칭 cyanine 염료 기반 마스터, 믹스의 2 배 및 2.5 µ L 각 정방향 및 역방향 뇌관 쌍 28KJ/28B 37 식물 및 균 dna ITS1/ITS5.8R ng 38 .</li>
		</ol></li> <li>다음 매개 변수를 사용 하 여 증폭 DNA: 50 ℃, 95 ℃에서 2 분 초기 변성에서 2 분 전 변성의 40 주기 (15 98 ° C, 15에서 s s 58 ° C, 60에서 72 ° C에), 용융 곡선 뒤.</li>
		<li>준비 16S rRNA를 대상으로 차세대 시퀀싱 라이브러리를 사용 하 여 2 단계, 중첩 된 PCR 프로토콜 v 3/V4 변수 지역 및 ITS / 5.8s rRNA 공백 지역.
		<ol><li>5 DNA의 추가 12.5 µ L pmol 각 뇌관 및 마스터 믹스 x 2의. 각 지역 (16S 또는 ITS; 표 1 참조)에 대 한 별도 반응을 확인 합니다. 시퀀서 특정 어댑터 오버행 뉴클레오티드 순서 유전자 특정 시퀀스에 추가 하려면 앞에서 설명한 39 , 40 지역 특정 뇌관 수정.</li>
			<li>다음 매개 변수를 사용 하 여 초기 증폭을 수행: 95 ° C에서 3 분 초기 변성, 25의 주기 (30 s 95 ° C, 30에서 55 ° C, 30에서 s s 72 ° C에서), 72에서 5 분 최종 확장 ° c.</li>
			<li>다음 초기 증폭, 전기 이동 기동성에 의해 라이브러리 크기 및 수량을 확인 하 고 볼륨 단단한 단계의 가역 imm x 1를 사용 하 여 청소obilization 구슬 잔여 뇌관 및 반응 시 약을 제거. 수영장 16 및 양적 각 샘플에 대 한 단일 amplicon 풀을 만들려고 그 amplicons.</li>
			<li>는 시퀀서 특정 어댑터를 추가 하 고 다음 뇌관 (표 1 참조)를 사용 하 여 특정 듀얼 인덱스 샘플. 각 뇌관 및 마스터 믹스 x 2의 5 pmol에 증폭 된 DNA의 2.5 µ L를 추가 합니다. 다음 매개 변수를 사용 하 여 라이브러리 증폭을 수행: 95 ° C에서 3 분 초기 변성, 8의 사이클 (30 s 95 ° C, 30에서 55 ° C, 30에서 s s 72 ° C에), 72에서 5 분 최종 확장 ° c.</li>
		</ol></li> <li>다음 PCR, 단단한 단계의 가역 immobilization 구슬의 1 x 볼륨을 사용 하 여 깨끗 한 완성 된 라이브러리. 전기 이동 기동성, 그리고 fluorometry, 각각 사용 하 여 완성 된 라이브러리의 양과 품질을 평가 합니다. 2 µ M 및 시퀀싱 전에 풀 라이브러리 표준화.</li>
		<li>전체 amplicon 41을 충당 하기 위해 적절 한 길이와 2 차 PCR에 추가 어댑터를 유사 플랫폼에서 다음-세대 시퀀싱을 수행.</li>
	</ol></li> <li>주석 및 미생물 구성 분석 시퀀스.
	<li>모든 시퀀스 된 라이브러리에 대 한 단일 contigs 결합 쌍-엔드 시퀀싱 데이터 (R1 및 R2) <ol>. R1 및 r 2 파일을 병합, 후 각 라이브러리에 대 한 단일 fasta 파일 생성. 
		참고:이 단계 고 (하지 않는 한 달리 명시) 아래에 설명 된 프로세스에서에서 수행 Mothur 버전 1.38.0 38.</li>
		<li>모호한 기지, 예기치 않은 긴 시퀀스, 그리고 긴 homopolymers를 제거 하려면 각 fasta 파일 화면. 
		참고: 심사, 그리고 시퀀스 제거에 대 한 매개 변수는 maxambig = 0, maxlength = 600, 및 maxhomop = 8 두 유전자에 대 한. 동일한 시퀀스를 제거 하지만 모든 라이브러리 (일명 수 표에 Mothur)에 대해 별도로 contingence 테이블.</li>
		<li>123, 실바 데이터베이스 버전에 대 한 유전자 16S 도서관과 42 단결의 데이터베이스 대 한 유전자는 라이브러리의 고유한 시퀀스 정렬. 
		참고: 시퀀스 수 주석 첨부 합니다 왕국 수준에서 속 수준.
		<ol><li>클러스터 시퀀스를 정렬 하는 그 후, 비교를 사용 하 여 함수 pre.cluster = 5, 그리고 키메라 제거.</li>
		</ol></li> <li>왕 43 (16 진)에 대 한 실바와 단결의 (유전자 ITS)에 대 한 분류 파일 (컷오프 값의 80%)에 따라 메서드를 사용 하 여 시퀀스를 분류.</li>
		<li>로드 R 44 Mothur에 분류 과정에서 생성 된 contingence 테이블 (유전자 하나씩). 미생물 커뮤니티 변경의 추가 분석을 위한 라이브러리 당 관계 되는 풍부를 얻을 각 분류학 수준. 
		참고: 각 분류학 수준에서 병합 함께 분류학 그룹 관계 되는 풍부는 모든 실험 반복에 대 한 2% 미만 때.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

꿀벌 건강에 균의 효과에 대 한 조사는 해충 관리 전략의 understudied 측면 남아 있다. 우리의 연구 명시적으로 꿀벌 감소 운전 잠재적인 요소를 분리 하는 보완 기술의 제품군을 사용 하 여이 지식 격차를 해소 하는 것을 목표로. 계획, 근거, 그리고이 실험의 렌더링 아래 자세히 나와 있습니다.
없는 꿀벌이 인구 통계학 분석을 손상 할 것입니다 이후 케이지 실험의 메쉬를 탈출 ...

관리 하 고 야생 꿀벌 종 모두 자연 및 농업 시스템1에 대 한 주요 영향으로 광범위 한 하락 발생 하는. 이 문제의 원인을 이해 하 공동된 노력에도 불구 하 고 꿀 꿀벌 감소를 촉진 하는 요인 없습니다 아직도 잘 이해2,,34. 야생, 네이티브 꿀벌의 특정 종족에 대 한 상황이 긴박 한5,6되고있다. 꿀벌 인구 산업 농업과 교차, 그들의 인구가을 계속 하 고 가루 (전세계 생산7의 35%)을 요구 하는 작물을 감당할 것 이다 때 지속 될 수 없는 수확을 감소.
살충제 노출, 질병, 그리고 서식 지 손실1,4,8,,910 등 많은 잠재적인 요인 꿀 꿀벌 쇠퇴에 연루 되었습니다 동안 상대적으로 작은 네이티브 꿀벌 건강, 또는 농업 시스템 근처에 이러한 스트레스의 대화형 효과 대 한 알려져 있다. 많은 현재 연구 노력은 지난 연구는 균도 역할을 할 수 꿀벌 감소에 메모리 형성을 방해 하 여 나타냅니다 있지만 살충제, (예를 들어, neonicotinoids11,,12)에 초점을 계속합니다 후 각 리셉션13, 둥지 인식14, 효소 활동 및 신진 대사 기능15,,1617. 세계적으로, 균 꽃 중 꽃 작물에 적용 될 계속. 최근 연구는 꿀벌 일반적으로 살 균 제 잔류물 다시가지고 하이브18, 참으로, 연구 시험된 두 드러 기 포함 된 살 균 제 잔류물19,20의 큰 비율을 문서화 했다. 추가 작업은 그 살 균 제 잔류물은 꿀 꿀벌 애벌레 사망률21,,2223 의 높은 속도 식민지, 이내 "꽃가루 안치"의 존재와 관련 계시 했다는 비록 비-독성, 미생물 활동 없는 이며 영양 손상된24입니다. 살 균 제 "비 안전"에 고려 오래는 사실에도 불구 하 고 지금 증거는 혼자 살 균 제에 노출 네이티브 범블 비 종, Bombus 봉25심각한 식민지 손실을 발생할 수 있습니다.
살 균 제 노출 및 식민지 사이의 인과 관계를 설정 하려면 사망률, 이러한 화학 물질의 식 은 결정 될 필요가 있다. 균 류를 대상으로 토양26, 퇴적 물27, 및 수 중 환경28, 입증, fungicides 가장 가능성이 변경 곰 팡이 풍부 하 고 꽃가루-규정, 주요 지역 사회를 호출 함으로써 다양성을 이동 강력 하 게 박테리아를 선호 하는 수 있습니다. 곰 팡이 경쟁 또는 길 항 근, 없이 특정 병원 성 박테리아 상대적으로 되지 않은, 꽃가루 규정의 부패를 촉진 확산 수 있습니다. 과거의 연구 보여주었다 미생물, 효 모 및 filamentous 곰 팡이, 특히 꿀벌29,,3031영양 symbionts 역할 기생충 및 병원 균32 ,33, 꽃가루 점포의 장기 보존을 제공. 살 균 제, 따라서 수 있습니다 직접 해 하지 미 숙 꿀벌 및 기회 주의 병원 체와 기생충12민감성을 증가 하 여 이러한 서비스를 제공 하는 데 필요한 미생물 지역 사회를 방해 하 여. 식량 생산에 대 한 요구 증가 함께 전세계 작물은 되 고 살포 매년 균 같은 균 유발 효과의 정도 이해 하는 필요를 강조 하는 꽃 중.
날짜, 생태 다음과 같은 질문으로 나타낼 수 있습니다 네이티브 벌 미생물에 관한 기본 지식 간격: 어느 정도 살 균 제 변경지 않습니다 꿀벌 꽃가루-규정 내에서 미생물 커뮤니티? 뿌리깊은 변경 된 미생물 지역 사회와 함께 꽃가루를 소모의 다운스트림 영향 입니까? 이러한 생태학적으로 밀접 한 질문에, 실험 1을 공개 하는의 기본 목표와 함께 개발 되었다) 그 살 균 제 잔류물 혼자 네이티브 꿀벌 종; 가혹한 식민지 감소를 일으킬 수 있습니다 2) 꽃가루 조항에 미생물 지역 사회 살 균 제, 및 3 변경 되는 있는 정도) 어떻게 꿀벌 건강 심각 하 게 변경 된 미생물 지역 사회에 의해 영향을 받습니다. 실험 목표는 실험실 및 필드 기반 실험의 조합을 사용 하 여 위의 질문을 해결 하기 위해 정의 되었다. 의 상태--예술 metagenomic 및 현장 관찰의 전통적인 방법과 함께 분자 기술을 사용 하 여,이 연구는 꿀벌 건강에 균의 잠재적인 영향을 목표로 한다.
이 연구의 첫 번째 목적은 혼자 살 균 제 노출 네이티브 꿀벌 종 가운데 중요 한 식민지 손실을 발생할 수 있습니다 설명 하는 것입니다. 큰 필드 연습장을 포함 한 연구 Bombus 봉, (그림 1, 그림 2, 그림 3) 미국에서 유비 쿼터 스, 풍부한 네이티브 꿀벌의 식민지 성장에 살 균 제 노출의 효과 조사 하기 위해 사용 되었다. 그것은 낮은 체력과 비정형 인구 비 노출 두 드러 기에 비해 균 치료 하이브 제시는 가설 했다. 이 실험에서 얻은 데이터 꽃가루 내에서 살 균 제 잔류물 네이티브 범블 비 종25에 깊은 식민지 손실의 유일한 원인이 될 수 있습니다을 보여주는이 가설을 지원. 이 연구의 두 번째 목적은 꽃가루 미생물 살 균 제 노출에 대 한 응답을 조사 하는 것입니다. 균에 노출 되어 꽃가루 규정 내에서 미생물의 커뮤니티 구성 치료 꽃가루의 다른 것을 가정 했다. 곰 팡이 풍요로 움과 다양성은 크게 하락 예상, 박테리아 및/또는 하나의 지배적인 균 종 다른 경쟁 곰 팡이의 부재에서 선택 하지 않은 성장할 가능성이 것입니다. Vivo에서 시험의 시리즈를 통해 미생물 지역 사회 구성에 이러한 교대 metagenomics를 사용 하 여 분석 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Natupol Beehive</td>
			<td>Koppert</td>
			<td>USRESM1</td>
			<td>16 hives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propiconazole 14.3</td>
			<td>Quali-Ppro</td>
			<td>60207-90-1</td>
			<td>Propiconazole 14.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abound</td>
			<td>Syngenta</td>
			<td>4033540</td>
			<td>Azoxystrobin 22.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorothalonil</td>
			<td>Syngenta</td>
			<td>3452</td>
			<td>Fungicide used for trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pollen granules</td>
			<td>Bee rescued</td>
			<td>B004D5650C</td>
			<td>3X 16oz bottles, pollen for trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains for inoculation</td>
			<td>Currie Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains for inoculation</td>
			<td>Hittinger lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pairs</td>
			<td>UW Biotech Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Isolation Kit</td>
			<td>Mo Bio</td>
			<td>12830-50</td>
			<td>Commercial DNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>DNA quantification tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Master Mix for CFX</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4472952</td>
			<td>Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td>Instrument used for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Clean-Up Kit,</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10159-696</td>
			<td>Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 1000 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>Used for sizing and analysis of DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Used for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health

재배 자 종종 질병, 살 균 제 잔류물에 꿀벌 노출에 대 한 작물을 보호 하기 위해 꽃 동안 균 스프레이 사용 합니다. 비록 "비-안전한" 것으로 간주, 살 균 제 잔류물 꽃가루에 꿀벌 (꿀, 범블 비 종)에 대 한 감소와 관련 된 장착 증거가 있다. 메커니즘 상대적으로 알 수 없는 동안, 연구원은 비 미생물 공생 관련 된 추측 있다. 미생물 보존 또는 꽃가루는 꿀벌 애벌레에 대 한 영양 역할의 처리에서 중추적인 역할을 한다. 미생물 커뮤니티를 바꿔서 fungicides 이러한 미생물 중재 서비스를 중단 함으로써 꿀벌 건강을 손상 가능성이 높습니다. 이 원고는 간접 따라 장치를 마더보드에 있는 fungicides 식민지 감소 일으킬 수를 조사 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 케이지 실험 균 치료 꽃에 꿀벌 노출 이미 fungicides 네이티브 범블 비 (Bombus 봉)에 깊은 식민지 손실 원인 첫 번째 증거 제공. 균의 필드 관련 된 복용량을 사용 하는 일련의 실험 균 노출 꽃가루의 미생물 지역 사회 역학의 미세한 설명 개발 되었습니다. 곰 팡이 및 세균 assemblages 꽃가루 미생물 내에서 구조 구성의 변화는 다음 세대 시퀀싱 및 metagenomic 분석 조사. 실험 본 개발 fungicides 꽃가루 규정의 미생물에 미치는 영향에 대 한 기계적 이해를 제공 하기 위해 설계 되었습니다. 궁극적으로, 이러한 결과 해야 통해 fungicides 식민지 하락 일으킬 수 간접 통로에 빛을 발산 하 고 있다.

필드 케이지 연구:
케이지 실험에서 얻은 데이터 범블 꿀벌 식민지 살 균 제 노출에 대 한 중요 한 응답 했다는 것을 보여주었다. 균 치료 두 드러 기 생산 제어 두 드러 기 보다 훨씬 적은 수의 노동자 (12.2 ± 3.8, 평균 ± SE) (43.2 ± 11.2, F1, 9= 6.8, p = 0.03) (그림 4). 또한, 균 치료 하이?...

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Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

범블 비 하이브 내 미생물 컨소시엄 풍부 하 고 꽃가루 꿀벌 애벌레에 대 한 유지. 살 균 제 잔류물 꽃가루 미생물, 및 궁극적으로 식민지로 이어지는 식민지 인구 통계를 변경 하는 가설을 테스트 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다이 원고 실험실 및 필드 기반 실험 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 손실입니다.

실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

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9.6K 조회수.  USDA-ARS. 범블 비 하이브 내 미생물 컨소시엄 풍부 하 고 꽃가루 꿀벌 애벌레에 대 한 유지. 살 균 제 잔류물 꽃가루 미생물, 및 궁극적으로 식민지로 이어지는 식민지 인구 통계를 변경 하는 가설을 테스트 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다이 원고 실험실 및 필드 기반 실험 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 손실입니다.

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Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of natural proteins have a molecular mass between 40 - 200 kDa1,2, a robust and high-throughput method with a nanometer resolution capability is needed. Negative staining (NS) electron microscopy (EM) is an easy, rapid, and qualitative approach which has frequently been used in research laboratories to examine protein structure and protein-protein interactions. Unfortunately, conventional NS protocols often generate structural artifacts on proteins, especially with lipoproteins that usually form presenting rouleaux artifacts. By using images of lipoproteins from cryo-electron microscopy (cryo-EM) as a standard, the key parameters in NS specimen preparation conditions were recently screened and reported as the optimized NS protocol (OpNS), a modified conventional NS protocol 3 . Artifacts like rouleaux can be greatly limited by OpNS, additionally providing high contrast along with reasonably high&#8208;resolution (near 1 nm) images of small and asymmetric proteins. These high-resolution and high contrast images are even favorable for an individual protein (a single object, no average) 3D reconstruction, such as a 160 kDa antibody, through the method of electron tomography4,5. Moreover, OpNS can be a high&#8208;throughput tool to examine hundreds of samples of small proteins. For example, the previously published mechanism of 53 kDa cholesteryl ester transfer protein (CETP) involved the screening and imaging of hundreds of samples 6. Considering cryo-EM rarely successfully images proteins less than 200 kDa has yet to publish any study involving screening over one hundred sample conditions, it is fair to call OpNS a high-throughput method for studying small proteins. Hopefully the OpNS protocol presented here can be a useful tool to push the boundaries of EM and accelerate EM studies into small protein structure, dynamics and mechanisms.

More than half of proteins are small proteins (molecular mass &#60;200 kDa) that are challenging for both electron microscope imaging and three-dimensional reconstructions. Optimized negative staining is a robust and high-throughput protocol to obtain high contrast and relatively high resolution (~1 nm) images of small asymmetric proteins or complexes under different physiological conditions.

최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

연구

환경과학

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges widely over sub-Saharan Africa and in parts of the Middle East. Cheetah conservationists face two major challenges, conflict with landowners over the killing of domestic livestock, and concern over range contraction. Understanding of the latter remains particularly poor2. Namibia is believed to support the largest number of cheetahs of any range country, around 30%, but estimates range from 2,9053 to 13,5204. The disparity is likely a result of the different techniques used in monitoring.
Current techniques, including invasive tagging with VHF or satellite/GPS collars, can be costly and unreliable. The footprint identification technique5 is a new tool accessible to both field scientists and also citizens with smartphones, who could potentially augment data collection. The footprint identification technique analyzes digital images of footprints captured according to a standardized protocol. Images are optimized and measured in data visualization software. Measurements of distances, angles, and areas of the footprint images are analyzed using a robust cross-validated pairwise discriminant analysis based on a customized model. The final output is in the form of a Ward's cluster dendrogram. A user-friendly graphic user interface (GUI) allows the user immediate access and clear interpretation of classification results.
The footprint identification technique algorithms are species specific because each species has a unique anatomy. The technique runs in a data visualization software, using its own scripting language (jsl) that can be customized for the footprint anatomy of any species. An initial classification algorithm is built from a training database of footprints from that species, collected from individuals of known identity. An algorithm derived from a cheetah of known identity is then able to classify free-ranging cheetahs of unknown identity. The footprint identification technique predicts individual cheetah identity with an accuracy of &gt;90%.

The cheetah (Acinonyx jubatus) is an iconic, endangered species, but conservation efforts are challenged by habitat shrinkage and conflict with commercial farmers. The footprint identification technique, a robust, accurate and cost-effective image classification system, is a new approach to monitoring cheetahs.

그들의 발자국으로 확인 개인 : 치타를 구경하기

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

식민지 수준에 개인에서 꿀 꿀벌 개발에 대한 환경 화학 물질의 효과를 평가

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

Metagenomic 토양 분석 Nanopore DNA 시퀀싱

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB 및 식물 형질 및 생리 적 연구에 대 한 스펙트럼 루트 이미징: 실험적인 체제 및 프로토콜을 이미징

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye anatomy of insects. These include traditional histological techniques optimized for work on ant eyes and adapted to work in concert with other techniques such as transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). These techniques, although vastly useful, can be difficult for the novice microscopist, so great emphasis has been placed in this article on troubleshooting and optimization for different specimens. We provide information on imaging techniques for the entire specimen (photo-microscopy and SEM) and discuss their advantages and disadvantages. We highlight the technique used in determining lens diameters for the entire eye and discuss new techniques for improvement. Lastly, we discuss techniques involved in preparing samples for LM and TEM, sectioning, staining, and imaging these samples. We discuss the hurdles that one might come across when preparing samples and how best to navigate around them.

This article outlines a suite of techniques in light and electron microscopy to study the internal and external eye anatomy of insects. These include several traditional techniques optimized for work on ant eyes, detailed troubleshooting, and suggestions for optimization for different specimens and regions of interest.

개미 비주얼 시스템의 조사 기법

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis cylindrica (COCY) group. For this purpose, the model species C. explodens is used. Ants belonging to the minor worker caste possess distinctive hypertrophied mandibular glands (MGs). In territorial combat, they use the viscous contents of their enlarged mandibular gland reservoirs (MGRs) to kill rival arthropods in characteristic suicidal &#39;explosions&#39; by voluntary rupture of the gastral integument (autothysis). We show the dissection of worker ants of this species for the isolation of the gastral portion of the wax-like MGR contents as well as listing the necessary steps required for solvent-extraction of the therein contained volatile compounds with subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis and putative identification of metabolites contained in the extract. The dissection procedure is performed under cooled conditions and without the use of any dissection buffer solution to minimize the changes in the chemical composition of the MGR contents. After solvent-based extraction of volatile metabolites contained therein, the necessary steps for analyzing the samples via liquid-injection-GC-MS are presented. Lastly, data processing and putative metabolite identification with the use of the open-source software MetaboliteDetector is shown. With this approach, the profiling and identification of volatile metabolites in MGRs of ants belonging to the COCY group via GC-MS and the MetaboliteDetector software become possible.

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' Formicidae for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Minor workers of the ant species Colobopsis explodens are dissected to isolate the wax-like content stored in their hypertrophied mandibular gland reservoirs for subsequent solvent-extraction and analysis by gas chromatography-mass spectrometry. The&#160;annotation and identification of volatile constituents using the open-source software MetaboliteDetector is also described.

악의 선 저수지 내용 보에서의 절연 ' 개미 (Formicidae) GC-MS와 MetaboliteDetector Volatilome 분석에 대 한 폭발

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ocean temperatures and ocean acidification, corals are increasingly under threat. To tackle these challenges, advances in cell and molecular biology have proven to be crucial for diagnosing the health of corals. Modifying some of the techniques commonly used in human medicine could greatly improve researchers&#39; ability to treat and save corals. To address this, a protocol for in situ hybridization used primarily in human medicine and evolutionary developmental biology has been adapted for use in adult corals under stress.
The purpose of this method is to visualize the spatial expression of an RNA probe in adult coral tissue that has been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This method focuses on removal of the paraffin and rehydration of the sample, pretreatment of the sample to ensure permeability of the sample, pre-hybridization incubation, hybridization of the RNA probe, and visualization of the RNA probe. This is a powerful method when using non-model organisms to discover where specific genes are expressed, and the protocol can be easily adapted for other non-model organisms. However, the method is limited in that it is primarily qualitative, because expression intensity can vary depending on the amount of time used during the visualization step and the concentration of the probe. Furthermore, patience is required, as this protocol can take up to 5 days (and in many cases, longer) depending on the probe being used. Finally, non-specific background staining is common, but this limitation can be overcome.

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

The goal of this protocol is to perform in situ hybridization on adult coral samples that have been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This is a qualitative method used to visualize the spatial expression of an RNA anti-sense probe in paraffin-embedded tissues.

제자리에서 파라핀 포함 성인 산호 샘플에 대 한 교 잡 기술

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on fish populations. Adverse effects monitoring, utilizing biomarkers from the organismal to the molecular level, can be used to assess the cumulative effects on fishes and other organisms. Fish health has been used worldwide as an indicator of aquatic ecosystem health. The necropsy-based fish health assessment provides data on visible abnormalities and lesions, parasites, condition and organosomatic indices. These can be compared by site, season and sex, as well as temporally, to document change over time. Severity ratings can be assigned to various observations to calculate a fish health index for more quantitative assessment. A drawback of the necropsy-based assessment is that it is based on visual observations and condition factors, which are not as sensitive as tissue and subcellular biomarkers for sublethal effects. Additionally, it is rarely possible to identify causes or risk factors associated with observed abnormalities. So, for instance a raised lesion or "tumor" on the fins, lips or body surface may be a neoplasm. However, it could also be a response to a parasite, chronic inflammation or hyperplasia of normal cells in response to an irritant. Conversely, neoplasms, certain parasites, other infectious agents and many tissue changes are not visible and so may be underestimated. However, during the necropsy-based assessment, blood (plasma), tissues for histopathology (microscopic pathology), genomics and other molecular analyses, and otoliths for aging can be collected. These downstream analyses, together with geospatial analyses, habitat assessments, water quality and contaminant analyses can all be important in comprehensive ecosystem evaluations.

The health of wild fishes can be used as an indicator of aquatic ecosystem health. Necropsy-based fish health assessments provide documentation of visible lesions or abnormalities, data used to calculate condition indices as well as the opportunity to collect tissues for microscopic evaluation, gene expression and other more in-depth analyses.

검 시 기반 야생 물고기 건강 평가

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on ...

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired glands that are located in the head of the bee are highly sensitive to the quantity and quality of pollen and pollen substitutes that the nurse bee consumes. The glands get smaller when nurses are fed deficient diets and are large when they are fed complete diets. Because nurse hypopharyngeal gland size is a robust indicator of nurse nutrition, it is essential that those studying honey bee nutrition know how to measure these glands. Here, we provide detailed methods for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal glands. We present comparisons of unstained and stained tissue and data that were used to study the impact of pollen on gland size. This method has been used to test how diet impacts hypopharyngeal gland size but has further use for understanding the role of these glands in hive health.

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Hypopharyngeal gland acinus size is a robust measure of nurse honey bee nutrition. Here, we provide a detailed protocol for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal gland acini.

꿀 꿀벌 (Apis mellifera) 노동자의 Hypopharyngeal 동맥 Acinus 크기 측정

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

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