Die Autoren danken der University of Wisconsin Biotechnologie Center DNA Sequenzierung Anlage für Bereitstellung Amplifikation und Sequenzierung Einrichtungen und Dienstleistungen, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto und Max Haase für die Bereitstellung technischen Hilfe molekulare Analyse. Diese Arbeit wurde von USDA-Agricultural Research Service angeeignet Mittel (aktuelle Research Information System #3655-21220-001) unterstützt. Weiterer Unterstützung wurde von der National Science Foundation (unter Grant Nr. bereitgestellt. Deb-1442148), DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494), und der USDA National Institute of Food und Landwirtschaft (Luke Projekt 1003258). C.T.H. ist ein Pew Gelehrter in den biomedizinischen Wissenschaften und ein Alfred Toepfer Faculty Fellow, bzw. von der Pew Charitable Trusts und der Alexander von Humboldt-Stiftung unterstützt.

1. untersuchen die Wirkung von Fungizid Belichtung auf Bumble Bee Colony Erfolg mittels Cage Feldexperimente <ol><li>Satz bis zehn Gitter Käfige in einem Feld mit Hafer gepflanzt. Graben Sie einen Graben um jeden Käfig und graben Sie alle vier Kanten des Käfigs Netz in den Boden um sicherzustellen, dass die Bienen nicht entziehen können. Lager der Käfige, blühende Topfpflanzen, die bekannt sind für Bienen (z.B. Buchweizen, Borretsch, Alyssum, Kosmos und Sonnenblumen) attraktiv sein ( Abbildung 2).</li>
	<li>Ergänzen die Käfige mit einem einzigen Tablett (36 x 42 cm)-Blüte Klee. Cluster-florale Ressourcen innerhalb einer Ecke des Käfigs, besetzen einen Raum ca. 2,5 m x 1 m vegetieren die Restfläche Käfig durch die Hafer.</li>
	<li>Nach dem Zufallsprinzip die Hummel zuzuweisen, Kolonien, jedes mit Arbeiter und eine einzelne Dame, eine Behandlung (Fungizid Gegenwart/abwesend, N = 5 Kolonien pro Behandlung, insgesamt 10 Kolonien), dann legen Sie sie in einem Feld Käfig (N = 1/Käfig) für 29 Tage (23. Juni -21 Juli 2014).</li>
	<li>Orientieren die Kolonie Felder so, dass die Kolonie &#39; s Öffnungen zeigen nach Süden, die Bienen Navigations optimale Bedingungen bieten. Subventionieren die Kolonien mit Zucker Wasser Blase, platziert in den Bienenstock Boxen Ergänzung Nektarverfügbarkeit.</li>
	<li>Anwenden Chlorothalonil basierende Fungizid auf Feld-relevanten Ebene (20 g/L), blühende Pflanzen in den fünf Fungizid-Behandlung-Käfigen, statt mit einem Hand-Pestizid-Sprüher, zweimal während des Studiums (Tag 0 und 13). Die Blumen gleichmäßig zu beschichten, so dass keine weitere Flüssigkeit hält sich an floralen Oberflächen ( Abbildung 3).</li>
	<li>Zum Abschluss der Käfig Feldstudie B. Impatiens Kolonien aus den Käfigen von hand zu entfernen, die Bienenstöcke durch die Platzierung im Gefrierschrank-20 ° C für 20 min. abkühlen</li>
	<li>Bienen mit steriler Pinzette entfernen und notieren Sie die Anzahl der Larven, Puppen, adulte Weibchen (Ich. e. Sammlerinnen), und Männchen. Das trocken-Gewicht der Mutter Königin, Larven, Puppen, adulte Weibchen (d.h. Sammlerinnen) und Erwachsenen Männern aufnehmen mit einer Analysenwaage.</li>
</ol> 2. Untersuchen Sie die Auswirkungen von Fungizid Belichtung auf mikrobieller Gemeinschaften in den Pollen-Bestimmungen von Bumble Bee Nester mit Labor-basierte In Vivo Studien <ol><li>pulverisieren kommerziell erworben Pollen zu einem feinen Pulver mit einem Standard- Labor-Kugelmühle. Sterilisieren Sie pulverisierte Pollen durch Einweichen in 70 % igem Ethanol, ermöglicht es, über Nacht unter UV-Licht zu verdampfen. Sterilität der Pollen durch Ausplattieren ~0.5 mg auf Allzweck Agar Medien überprüfen.
	<ol><li>Sterilisiert Pollen, mit sterilisierten Pipetten, Hinzufügen der trockenen Bereich relevanten Dosierung von Fungizid: propiconazolhaltige bei 14,3 %; Azoxystrobin bei 22,9 % für Behandlungen (0,74 µL und 0,65 µL bzw. / Tag / hive). Mischen Sie nun mit sterilisierten Holzstäbchen.</li>
	</ol></li> <li>Platz 6 experimentelle Nesselsucht (n = 3 Stück für die Kontrolle und Behandlung) in eine saubere, hygienische Labor Benchtop auf Raumtemperatur gehalten. Jeden Tag wiegen 4,27 g Pollen 34 , 35 gemischt mit Fungiziden (für Behandlungen) oder sterilem Wasser (zur Kontrolle) in eine Kapuze mit standard aseptische Technik.
	<ol><li>Die Falltüren zur Verfügung gestellt von der Seite des Kartons umschließt die Nesselsucht, führen die Pollen in die Bienenstöcke. Ergänzung der Bienenstöcke mit sterilisierten Zuckerlösung pro Woche. Futterregime für vier Wochen weiter.</li>
	</ol></li> <li>Zum Abschluss der Labor-basierte Studie, kühlen die Bienenstöcke indem man in Gefrierschrank-20 ° C für 20 min. kratzen die Pollen-Bestimmungen enthaltenen Brut Kammern mit sterilisierten Pinzette und Spachteln und in sterile Lagerung Rohre statt. Shop bei-80 ° C. Graf und Datensatz das Gewicht der Arbeitnehmer und der Königin-Mutter am Anfang und Ende des Experiments (Schritt 1.7).</li>
	<li>Isolieren DNA von Pollen-Bestimmung Probe mit im Handel erhältlichen DNA-Isolierung-kits (siehe Materialtabelle für Details).
	<ol><li>Fügen Sie 0,25 g Pollen-Bestimmung zur Extraktion Rohre kurz Vortex mischen.</li>
		<li>Machen eine 200 mg/mL Lysozym Lösung in entionisiertem destilliertem Wasser, genug für 50 µL/Probe. Kräftig schütteln, um völlig Formularlösung.</li>
		<li>Die Extraktion Rohre mit Probe in es 50 µL der Lysozym-Lösung hinzu und mischen Sie gut durch invertieren mehrmals. Inkubieren Sie das Rohr für 10 min bei 37 ° C im Wasserbad. Wenn Niederschlag gebildet hat, Wärme Lösung auf 60 ° C bis vor Gebrauch aufgelöst.</li>
		<li>Hinzufügen 70 µL wässrigen Lyse Lösung zur Extraktion Rohre, horizontal auf einem Flachbett-Wirbel-Pad mit Klebeband sichern und Wirbel für 10 min. Zentrifuge Rohre bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Übertragen den Überstand auf eine saubere 2 mL Sammelröhrchen. Fügen Sie 250 µL Niederschlag Proteinlösung und Vortex für 5 S. Inkubation bei 4 ° C für 5 min in ein Eisbad. 
		Hinweis: Erwarten Sie zwischen 400 µL, 500 µL überstand. Überstand kann noch einige Partikel enthalten.</li>
		<li>Die Rohre bei Raumtemperatur für 1 min bei 10.000 x g Zentrifugieren und bis zu 600 µL Überstand auf eine saubere 2 mL Sammelrohr übertragen. Fügen Sie 200 µL der wässrigen Inhibitor Haarentfernung Lösung, kurz, Wirbel und inkubieren Sie bei 4 ° C für 5 min. Zentrifuge die Rohre bei Raumtemperatur für 1 min bei 10.000 x g. bis zu 750 µL Überstand in ein sauberes 2 mL Sammelröhrchen übertragen.</li>
		<li>Fügen Sie 1200 µL wässrigen Bind Lösung des Überstandes und Wirbel für 5 s. Laden ca. 675 µL des Überstands auf ein Spin Filter und Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Verwerfen die Durchströmung.</li>
		<li>Wiederholen 2.4.7. zweimal. 
		Hinweis: Insgesamt drei Lasten für jede Probe verarbeitet sind erforderlich.</li>
		<li>Hinzufügen 500 µL Ethanol und Zentrifuge bei Raumtemperatur für 30 s bei 10.000 x g. die Durchströmung zu verwerfen und erneut Zentrifugieren, bei Raumtemperatur für 1 min bei 10.000 x g. Ort Spin Filter in einer sauberen 2 mL Sammelröhrchen.</li>
		<li>Elution hinzufügen 100 µL Puffer in die Mitte der Filtermembran. Zentrifuge bei Raumtemperatur für 30 s bei 10.000 x g. verwerfen den Spin-Filter. Store gesammelten DNA-20 ° C bis-80 ° C</li></ol></li> <li>Verwendung isolierte DNA Sequenzierung.
	<ol><li>Quantify, und isolierte DNA auf 2 ng/µL fluorometrisch Analyse zu normalisieren.
		<ol><li>Prepare Reaktionen in dreifacher Ausfertigung für jede extrahierte Probe, die relativen Mengen der 28 s zu vergleichen (Pflanze), seine (Pilze), zu analysieren und 16 s (bakterielle) Komponenten der einzelnen Pollen-Bestimmung Probe 36. Stellen Sie sicher, dass jede Reaktion 10 enthält ng der Gesamt-DNA, 2 X asymmetrische Cyanin-Farbstoff basierend-master-Mix und 2,5 µL von forward und reverse Primer Paare 28KJ/28 b 37 für Anlage und ITS1/ITS5.8R für Pilz DNA 38 .</li>
		</ol></li> <li>Verstärken DNA mit den folgenden Parametern: 2 min vor Denaturierung bei 50 ° C, 2 min erste Denaturierung bei 95 ° C, 40 Zyklen (15 s bei 98 ° C, 15 s 58 ° c, 60 s bei 72 ° C), gefolgt von einer Schmelze Kurve.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 2-stufige, verschachtelten PCR-Protokoll Next Generation Sequencing-Bibliotheken für die 16 s rRNA V3/V4 Variable Region und ITS / 5.8s rRNA Abstandhalter Region.
		<ol><li>Hinzufügen 12,5 µL DNA bis 5 Pmol jedes Grundierung und 2 x master-Mix. Stellen Sie separate Reaktionen für jede Region (16 s oder ITS; siehe Tabelle 1). Region spezifische Primer zu ändern, wie zuvor beschrieben 39 , 40 gen-spezifische Sequenzen Sequenzer-spezifische Adapter Überhang Nukleotidsequenzen hinzu.</li>
			<li>Erste Verstärkung mit den folgenden Parametern ausführen: 3 min erste Denaturierung bei 95 ° C, 25 Zyklen (30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C, 30 s bei 72 ° C), letzte Verlängerung 5 min bei 72 ° c</li>
			<li>Folgende erste Verstärkung, Bibliotheksgröße und Menge durch elektrophoretische Mobilität überprüfen und reinigen Sie mit einer 1 x Volume Festphase reversible ImmObilization Perlen, passives Grundierungen und Reaktion Reagenzien zu entfernen. Pool-16 s und seine Amplifikate quantitativ erstelle ich einen einzigen Amplikons Pool für jede Probe.</li>
			<li>Sequenzer bestimmte Adapter hinzufügen und probieren Sie spezifische doppelte Indizes verwenden die folgenden Primer (siehe Tabelle 1). 2.5 µL der amplifizierten DNA zu 5 Pmol jedes Grundierung und 2 x master-Mix hinzufügen. Bibliothek Verstärkung mit den folgenden Parametern ausführen: 3 min erste Denaturierung bei 95 ° C, 8 Zyklen (30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C, 30 s bei 72 ° C), letzte Erweiterung 5 min bei 72 ° c</li>
		</ol></li> <li>Folgende PCR, sauber fertige Bibliotheken mit einem 1 X Volume der Festphase reversible Immobilisierung Perlen. Bewerten Sie Qualität und Quantität der fertige Bibliotheken mit elektrophoretische Mobilität und Fluorometry, bzw.. Bibliotheken, 2 µM und Pool vor der Sequenzierung zu standardisieren.</li>
		<li>Next Generation Sequencing durchführen, auf einer Plattform, die analog zu den Adaptern in der sekundären PCR mit einer entsprechenden Länge zur Deckung der gesamten Amplikons 41 hinzugefügt.</li>
	</ol></li> <li>Sequenz, Annotation und Analyse der mikrobiellen Zusammensetzung.
	<ol><li>Kombinieren paar-End Sequenzierungsdaten (R1 und R2) in einzelne Contigs für alle sequenzierten Bibliotheken. Nach dem Zusammenführen von R1 und R2 Dateien, wird eine einzelne Fasta-Datei für jeden der Bibliotheken produziert. 
		Hinweis: Dieser Schritt und die Prozesse beschrieben (sofern nicht anders angegeben) erfolgt in Mothur Version 1.38.0 38.</li>
		<li>Bildschirm jede Fasta-Datei entfernen Sie mehrdeutige Basen, unerwartet lange Sequenzen und lange Homopolymere. 
		Hinweis: Die Parameter für das Screening und Sequenz Entfernung sind Maxambig = 0, Maxlength = 600 und Maxhomop = 8 für beide Gene. Entfernen Sie identische Sequenzen, aber halten Sie eine Kontingenz Tabelle separat für alle Bibliotheken (aka Zahlentabelle in Mothur).</li>
		<li>Richten Sie einzigartige Sequenzen der 16 s gen Bibliothek gegen SILVA Datenbankversion 123 und gen ITS Bibliothek gegen den vereinen ihre Datenbank 42. 
		Hinweis: Sequenzen müssen von der Königreich-Ebene auf die Ebene der Gattung annotiert werden.
		<ol><li>Anschließend Cluster ausgerichtet Sequenzen mit der Funktion pre.cluster mit Diff = 5, und entfernen Sie Chimären.</li>
		</ol></li> <li>Klassifizieren Sequenzen mit der Methode Wang 43 anhand der SILVA (für 16 s-gen) und vereinen ITS (für gen ITS) Taxonomie Dateien (cutoff-Wert von 80 %).</li>
		<li>In R 44 laden die Kontingenz Tabellen (eine pro gen) während der Klassifizierungsprozess in Mothur erzeugt. Auf jeder taxonomischen Ebene, relative Häufigkeit pro Bibliothek zur weiteren Analyse der mikrobiellen Gemeinschaft Änderungen zu erhalten. 
		Hinweis: Auf jeder taxonomischen Ebene zusammenführen taxonomische Gruppen als relative Häufigkeit weniger als 2 % für die experimentelle Wiederholungen ist.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Untersuchungen über die Auswirkungen der Fungizide auf die Bienengesundheit blieben ein erforschten Aspekt des Schädlings-Management-Strategien. Unsere Studie zielt darauf ab, diese Wissenslücke zu überbrücken, mithilfe einer Reihe von ergänzenden Techniken, die explizit die potenziellen Faktoren Biene Rückgänge zu isolieren. Planung, Begründung und Darstellung dieser Experimente sind nachfolgend aufgeführt.
Es ist darauf zu achten, dass keine Bienen erlaubt sind, um das Netz der Kä...

Verwaltet und Wildbienenarten sind weit verbreitete Rückgänge, mit großen Auswirkungen auf die beiden natürlichen und landwirtschaftlichen Systemen1erleben. Trotz konzertierte Anstrengungen, die Ursachen des Problems zu verstehen sind die Faktoren, die Honig Biene Rückgänge noch nicht gut verstanden,2,3,4. Für bestimmte Arten von wild, native Bienen ist die Situation dringend5,6geworden. Wenn Bienenvölker nicht aufrechterhalten werden können, wenn sie mit der industriellen Landwirtschaft schneiden, ihre Bevölkerungen werden weiter sinken und die Pflanzen erfordert Bestäuber (35 % der Weltproduktion7) ertragen werden verringert ernten.
Während viele mögliche Faktoren wie Schädlingsbekämpfungsmittelbelichtung Krankheit und Lebensraum Verlust1,4,8,9,10 in Honig Biene Rückgang verwickelt, über die interaktive Wirkung von diesen Stressoren auf heimischen Bienen Gesundheit, innerhalb oder in der Nähe von landwirtschaftlichen Systemen ist relativ wenig bekannt. Viele aktuelle Forschungsbemühungen weiterhin Insektizide (z.B., Neonicotinoide11,12), obwohl die letzten Forschung zeigt, dass Fungizide auch ein Rückgang der Biene Rolle können durch Beeinträchtigung der Gedächtnisbildung konzentrieren, olfaktorische Rezeption13, Nest Anerkennung14, Enzymaktivität und Stoffwechselfunktionen15,16,17. Fungizide weiterhin weltweit, während der Blüte zu blühenden Pflanzen angewendet werden. Neuere Studien belegen, dass Bienen bringen häufig Fungizid Rückstände zurück in den Bienenstock18, in der Tat, einen Großteil der getesteten Nesselsucht enthaltenen Fungizid Rückstände19,20Studien. Weiterarbeit hat ergeben, dass Fungizid Rückstände ist verbunden mit hohen Honig Biene Larven Mortalität21,22,23 und das Vorhandensein von "begraben Pollen" innerhalb der Kolonien, die zwar ungiftig, ist frei von mikrobielle Aktivität und ernährungsphysiologisch kompromittierten24. Trotz der Tatsache, dass Fungizide lange "Biene-Safe" gegolten haben, gibt es jetzt beweisen, dass die Exposition zu Fungizid allein in einer nativen Bumble Bee Spezies, Bombus Impatiens25schwere Kolonie Verluste verursachen kann.
Um Kausalität zwischen Fungizid-Exposition und Kolonie zu etablieren Sterblichkeit, die Arbeitsweise dieser Chemikalien müssen bestimmt werden. Wie in den Böden26, Sedimente27und aquatischen Umwelt28, belegt durch die Ausrichtung auf Pilze, Fungizide am ehesten verändern Pilz Fülle und Vielfalt im Rahmen der Pollen-Vorgaben damit Aufrufen einer großen Gemeinschaft zu verlagern, die Bakterien können stark begünstigen. Ohne Pilz Konkurrenten oder Antagonisten können bestimmte pathogenen Bakterien relativ ungeprüft, erleichtern das Verderben von Pollen-Bestimmungen vermehren. Frühere Forschung hat gezeigt, dass Mikroorganismen, insbesondere Hefen und filamentöse Pilze dienen als Nahrungsergänzung Symbionten für Bienen29,30,31, Schutz gegen Parasiten und Krankheitserreger32 ,33, und Langzeitarchivierung von Pollen Läden bieten. Fungizide, können deshalb, unreife Bienen indirekt Schaden, durch Unterbrechung der mikrobiellen Gemeinschaft, die benötigt wird, um diese Leistungen zu erbringen und/oder durch eine Erhöhung der Anfälligkeit für opportunistische Krankheitserreger und Parasiten12. Mit zunehmender Anforderungen an die Herstellung von Lebensmitteln, sind Kulturen weltweit jedes Jahr mit Fungiziden während der Blüte, unterstreicht die Notwendigkeit zu verstehen, das Ausmaß der Fungizid-induzierte Effekte besprüht.
Bis dato, die primäre Wissenslücken in Bezug auf einheimische Biene mikrobielle Ökologie kann durch die folgenden Fragen dargestellt werden: , inwieweit ändert Fungizid die mikrobielle Gemeinschaft im Rahmen der Biene Blütenstaub-Vorgaben? Was sind die nachgelagerten Auswirkungen des Verzehrs von Pollen mit einer grundlegend veränderten mikrobiellen Gemeinschaft? Im Einklang mit dieser ökologisch germane Fragen, wurden Experimente mit den primären Zielen der Enthüllung 1 entwickelt), Fungizid Rückstände allein kann schwere Kolonie Rückgang verursachen, in einem heimischen Bienenarten; (2) der Grad, mikrobielle Gemeinschaften in Pollen-Bestimmungen sind durch Fungizide und 3 verändert) wie Bienengesundheit von einer stark veränderten mikrobiellen Gemeinschaft betroffen ist. Die experimentelle Ziele wurden definiert, um die oben genannten Fragen mit einer Kombination aus Labor und Feld-basierten Experimente. Mit State-of-the-Art metagenomische und Molekulare Techniken neben traditionellen Methoden der Bereich Beobachtung, diese Forschung zielt darauf ab, die möglichen Auswirkungen von Fungiziden auf die Bienengesundheit zusammenzusetzen.
Das erste Ziel der vorliegenden Studie soll zeigen, dass Fungizid Exposition allein dazu führen, erhebliche Völkerverluste unter einheimischen Bienenarten dass kann. Eine Studie mit Grossfeld Käfige wurde verwendet, um die Auswirkungen einer Fungizid auf das Koloniewachstum von Bombus Impatiens, eine allgegenwärtige, reichlich einheimische Biene in den USA (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3) untersuchen. Es wurde vermutet, dass Fungizid behandelt Nesselsucht geringer Fitness und atypische Demografie im Vergleich zu nicht-exponierten Nesselsucht präsentieren würde. Dieses Experiment gewonnene Daten unterstützt diese Hypothese, zeigen, dass Fungizid Rückstände im Pollen die alleinige Ursache für tiefe Völkerverluste in einer nativen Bumble Bee Arten25sein können. Das zweite Ziel dieser Studie ist, die Reaktion der Pollen Microbiome Fungizid Exposition zu untersuchen. Es wird vermutet, dass die Gemeinschaft Zusammensetzung der Mikroben im Rahmen der Pollen-Vorgaben ausgesetzt, Fungizide anders als die der unbehandelten Pollen werden. Während Pilz Fülle und Vielfalt deutlich zurückgehen voraussichtlich werden, werden Bakterien und/oder einer einzigen dominanten Pilzarten wahrscheinlich unkontrolliert in der Abwesenheit von anderen konkurrierenden Pilze wachsen. Durch eine Reihe von in-Vivo -Studien werden diese Verschiebungen in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft mit Metagenomik analysiert werden.

<table><tbody><tr><td>Natupol Beehive</td><td>Koppert</td><td>USRESM1</td><td>16 hives</td></tr><tr><td>Propiconazole 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazole 14.3%</td></tr><tr><td>Abound</td><td>Syngenta</td><td>4033540</td><td>Azoxystrobin 22.9%</td></tr><tr><td>Chlorothalonil</td><td>Syngenta</td><td>3452</td><td>Fungicide used for trials</td></tr><tr><td>Pollen granules</td><td>Bee rescued</td><td>B004D5650C</td><td>3X 16oz bottles, pollen for trials</td></tr><tr><td>Bacterial strains for inoculation</td><td>Currie Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast strains for inoculation</td><td>Hittinger lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer pairs</td><td>UW Biotech Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Isolation Kit</td><td>Mo Bio</td><td>12830-50</td><td>Commercial DNA isolation kit</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td>DNA quantification tool</td></tr><tr><td>Select Master Mix for CFX</td><td>Thermo Fisher</td><td>4472952</td><td>Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.</td></tr><tr><td>Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio Rad</td><td>1855196</td><td>Instrument used for PCR amplification</td></tr><tr><td>PCR Clean-Up Kit,</td><td>Axygen</td><td>10159-696</td><td>Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes</td></tr><tr><td>DNA 1000 Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Used for sizing and analysis of DNA fragments</td></tr><tr><td>MiSeq Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td>Used for next-generation sequencing</td></tr><tr><td>Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health

Züchter verwenden oft Fungizid Sprays während der Blüte Pflanzen gegen Krankheit, schützen die Bienen Fungizid Rückstände anführt. Obwohl als "Biene-Safe", gibt es Anzeichen dafür, dass Fungizid Rückstände Pollen Biene Rückgänge (für Honig und Bumble Bee Arten) zugeordnet sind. Während die Mechanismen relativ unbekannt bleiben, haben Forscher spekulierten, daß Biene-Mikrobe Symbiosen beteiligt sind. Mikroorganismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung und/oder Verarbeitung von Pollen, die als Nahrung für die Larven Bienen dient. Durch die Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft, ist es wahrscheinlich, dass Fungizide diese Mikrobe-vermittelten Leistungen stören und damit Gesundheit der Bienen gefährden. Dieses Manuskript beschreibt die Protokolle verwendet, um die indirekte Mechanismen zu untersuchen, durch die Fungizide Kolonie Rückgang verursachen können. Käfig Experimenten auszusetzen Bienen, Blumen Fungizid behandelt haben bereits die ersten belegt, dass Fungizide Tiefe Völkerverluste in eine native Hummel (Bombus Impatiens) verursachen. Mit Feld-relevanten Dosen von Fungiziden, eine Reihe von Experimenten wurden entwickelt, um eine feinere Beschreibung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik der Fungizid-exponierten Pollen zu bieten. Verschiebungen in der strukturellen Zusammensetzung der Pilz- und bakterielle Assemblagen innerhalb der Pollen Microbiome sind von Next Generation Sequencing und metagenomischen Analyse untersucht. Experimente, die hierin entwickelt wurden so bieten ein mechanistisches Verständnis wie Fungizide Microbiome Pollen-Bestimmungen auswirken. Letztendlich sollten diese Erkenntnisse auf dem indirekten Weg Licht durch die Fungizide Kolonie Rückgänge verursachen können.

Feldstudie Käfig:
Den Käfig Experimenten gewonnene Daten zeigte, dass die Hummeln Bienenvölker eine deutliche Reaktion auf Fungizid Exposition. Das Fungizid behandelt Nesselsucht produziert deutlich weniger Arbeiter (12,2 ± 3,8, Mittelwert ± SE) als Kontrolle Nesselsucht (43,2 ± 11,2, F1,9= 6,8, p = 0,03) (Abbildung 4). Darüber hinaus war die Biene Biomasse ...

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Empirische, metagenomische und rechnerische Techniken beleuchten die Mechanismen, durch die Fungizide die Bienengesundheit beeinträchtigen | Umwelt | Video

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Mikrobielle Konsortien innerhalb von Bumble Bee Hives bereichern und Pollen für Bienenlarven bewahren. Sequenzierung der nächsten Generation, zusammen mit Labor und Feld-basierte Experimente mit beschreibt diesem Manuskript Protokolle verwendet, um die Hypothese zu testen, dass Fungizid Rückstände der Pollen Mikrobiom und Kolonie Demographie, letztlich zu Kolonie verändern Verlust.

Empirische, metagenomischen und Computertechniken beleuchten die Mechanismen, durch welche Fungizide Kompromiss Bienengesundheit

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

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Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

Die Bewertung der Wirkung von Umweltchemikalien auf Honig-Bienen-Entwicklung von der Person zu Colony Ebene

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Forschung

Umwelt

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey bee colony numbers have been declining in the United States and many European countries since 1947. A number of factors play a role in this decline, including the unintentional exposure of honey bees to pesticides. The development of new methods and regulations are warranted to reduce pesticide exposures to these pollinators. One approach is the use of repellent chemistries that deter honey bees from a recently pesticide-treated crop. Here, we describe a protocol to discern the deterrence of honey bees exposed to select repellent chemistries. Honey bee foragers are collected and starved overnight in an incubator 15 h prior to testing. Individual honey bees are placed into Petri dishes that have either a sugar-agarose cube (control treatment) or sugar-agarose-compound cube (repellent treatment) placed into the middle of the dish. The Petri dish serves as the arena that is placed under a camera in a light box to record the honey bee locomotor activities using video tracking software. A total of 8 control and 8 repellent treatments were analyzed for a 10 min period with each treatment was duplicated with new honey bees. Here, we demonstrate that honey bees are deterred from the sugar-agarose cubes with a compound treatment whereas honey bees are attracted to the sugar-agarose cubes without an added compound.

The loss of honey bee colonies presents a challenge to crop pollination services. Current pollinator protection practices warrant an alternative approach to minimize the contact of honey bees to harmful pesticides using repellent chemistries. Here, we provide detailed methods for a visual tracking protocol to screen deterrents for bees.

Video-Tracking-Protokoll auf Bildschirm abschreckende Chemie für Honigbienen

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide regulation studies. The risk of exposure to fungicide residues is likely to be especially high if the spray occurs on, or near host plants while the bees are collecting pollen to provision their nests. For species of Osmia that consume pollen from a select group of plants (oligolecty), the inability to use pollen from non-host plants can increase their risk factor for fungicide-related toxicity. This manuscript describes protocols used to successfully rear oligolectic mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, from egg to prepupal stage within cell culture plates under standardized laboratory conditions. The in vitro-reared bees are subsequently used to investigate the effects of fungicide exposure and pollen source on bee fitness. Based on a 2 &#215; 2 fully crossed factorial design, the experiment examines the main and interactive effects of fungicide exposure and pollen source on larval fitness, quantified by prepupal biomass, larval developmental time, and survivorship. A major advantage of this technique is that using in vitro-reared bees reduces natural background variability and allows the simultaneous manipulation of multiple experimental parameters. The described protocol presents a versatile tool for hypotheses testing involving the suite of factors affecting bee health. For conservation efforts to be met with significant, lasting success, such insights into the complex interplay of physiological and environmental factors driving bee declines will prove to be critical.

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Fungicide sprays on flowering plants may expose solitary bees to high concentrations of pollen-borne fungicide residues. Using laboratory-based experiments involving in vitro-reared bee larvae, this study investigates the interactive effects of consuming fungicide-treated pollen derived from host and non-host plants.

In-vitro- Aufzucht von Solitärbienen: ein Werkzeug für die Beurteilung der Larven Risikofaktoren

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in the shikimate pathway, which is virtually universal in plants. The inhibition of the enzyme stops the production of three essential amino acids: phenylalanine, tyrosine, and tryptophan. EPSPS is also present in fungi and prokaryotes, such as archaea and bacteria; thus, the use of GBP may have an impact on the microbiome composition of soils, plants, herbivores, and secondary consumers. This article aims to present general guidelines to assess the effect of GBP on microbiomes from field experiments to bioinformatics analyses and provide a few testable hypotheses. Two field experiments are presented to test the GBP on non-target organisms. First, plant-associated microbes from 10 replicated control and GBP treatment plots simulating no-till cropping are sampled and analyzed. In the second experiment, samples from experimental plots fertilized by either poultry manure containing glyphosate residues or non-treated control manure were obtained. Bioinformatics analysis of EPSPS protein sequences is utilized to determine the potential sensitivity of microbes to glyphosate. The first step in estimating the effect of GBP on microbiomes is to determine their potential sensitivity to the target enzyme (EPSPS). Microbial sequences can be obtained either from public repositories or by means of PCR amplification. However, in the majority of field studies, microbiome composition has been determined based on universal DNA markers such as the 16S rRNA and the internal transcribed spacer (ITS). In these cases, sensitivity to glyphosate can only be estimated through a probabilistic analysis of EPSPS sequences using closely related species. The quantification of the potential sensitivity of organisms to glyphosate, based on the EPSPS enzyme, provides a robust approach for further experiments to study target and non-target resistant mechanisms.

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. In this article, we introduce general guidelines to quantify the effect of GBP on microbiomes, from field experiments to bioinformatics analyses.

Quantifizierung des potenziellen Einflusses von Glyphosat-basierten Produkten auf Mikrobiome

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ingestion of provisions contaminated with pesticides may increase the mortality rate of the larvae, decrease the collection rate and the population of adult solitary bees in the next year from a demographic perspective. But there are limited studies on the effects of pesticides on the larvae of solitary bees. Therefore, understanding how pesticides influence the larvae of solitary bees should be considered an integral part of pesticide ecological risk assessment. This study presents a method to expose the larvae of solitary bee, Osmia excavata, to lethal or sublethal doses of pesticide, tracking larval weight gain, developmental duration, eclosion ability, and food consumption efficiency conversion of ingested food. To demonstrate the effectiveness of this method, the larvae of O. excavata were fed with provisions containing acute lethal and sublethal doses of chlorpyrifos. Then, the above indexes of the treated larvae were investigated. This technique helps to predict and mitigate the risk of pesticides to pollinators.

The present protocol explains a method to feed pesticide-contaminated provisions to the larvae of the solitary bees, Osmia excavata. The procedure examines the ecotoxicity of the pesticide to the larvae of the solitary bees.

Bewertung der Wirkung von Pestiziden auf die Larven der Solitärbienen

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

Biochemie

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Neuropharmakologische Manipulation von Verhaltene und Free-Fliegen-Honig-Bienen,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Neurowissenschaften

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Überwachung der Kolonie-Ebene Auswirkungen der subletalen Schädlingsbekämpfungsmittelbelichtung auf Honigbienen

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Biologie

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee health, including exposure to viral pathogens. Such viruses can cause a wide variety of devastating effects and can often be challenging to study due to multiple factors that make it difficult to separate the effects of experimental treatments from preexisting background infection. Here we present a method to mass produce large quantities of virus particles along with a high throughput bioassay to test viral infection and effects. Necessitated by the current lack of a continuous, virus-free honey bee cell line, viral particles are amplified in vivo using honey bee pupae, which are extracted from the hive in large volumes using minimally stressful methodology. These virus particles can then be used in honey bee cage bioassays to test inocula viability, as well as various other virus infection dynamics, including interactions with nutrition, pesticides, and other pathogens. A major advantage of using such particles is that it greatly reduces the chances of introducing unknown variables in subsequent experimentation when compared to current alternatives, such as infection via infected bee hemolymph or homogenate, though care should still be taken when sourcing the bees, to minimize background virus contamination. The cage assays are not a substitute for large-scale, field-realistic experiments testing virus infection effects at a colony level, but instead function as a method to establish baseline viral responses that, in combination with the semi-pure virus particles, can serve as important tools to examine various dimensions of honey bee-virus physiological interactions.

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Here we describe two protocols: first to propagate, extract, purify, and quantify large quantities of honey bee non-enveloped virus particles, including a method for removing honey bee pupae and second to test the effects of viral infection using a highly repeatable, high-throughput cage bioassay.

Herstellung von virusangereichertem Inokulum zur oralen Infektion von Honigbienen (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Bewertung des agrochemischen Risikos für gepaarte Honigbienenköniginnen

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

Cost-Effective Method for Safely Handling and Sampling Field-Collected Bees

A Rapid Method to Confine and Safely Handle Bees in the Field

Improving understanding of the basic biology and ecology of many insect pollinators, particularly specialist or rare taxa, is a priority for many researchers. As such, there is often a need to temporarily confine field-collected organisms in a non-injurious manner in order to gain information or support additional studies. This protocol represents a thoroughly tested, quick, and inexpensive field method for safely handling bees of conservation concern that can easily be tailored toward specific project needs, including organism identification, pollen removal, marking, and/or collection of non-lethal tissue samples for genetic analysis. This methodology can serve as an additional option in the researcher's toolbox to use when certain scenarios arise. It is anticipated that this methodology can be adapted for use with other insect species as well as used by individuals of varying experience and skill levels. It can be of great value to researchers studying specialist bees or conducting host-specific studies. The data collection made possible by this protocol will be invaluable to help researchers address critical data gaps for many pollinator species, plant-pollinator network structures, and pollinator conservation and management initiatives.

We demonstrate a tested method for safely handling field-collected bees. This method allows swift manipulation, identification, genetic sampling, and confirmation of plant-insect interactions via pollen collected while sampling. Easily adaptable, this approach offers a cost-effective, non-lethal means to study rare insect groups.

Empirische, metagenomischen und Computertechniken beleuchten die Mechanismen, durch welche Fungizide Kompromiss Bienengesundheit

Zusammenfassung

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