Autore (i) ringraziare l'Università del Wisconsin Biotechnology Center DNA sequenziamento impianto per la fornitura di amplificazione e sequenziamento servizi, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto e Max Haase per assistenza tecnica con analisi molecolare. Quest'opera è stata sostenuta dai fondi di USDA-Agricultural Research Service appropriato (attuale ricerca Information System #3655-21220-001). Un ulteriore supporto è stato fornito dalla National Science Foundation (sotto Grant No. DEB-1442148), il DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (ufficio DOE di scienza DE BER-FC02-07ER64494) e l'USDA National Institute of Food e agricoltura (progetto portello 1003258). C.T.H. è uno studioso di Pew in scienze biomediche e Alfred Toepfer facoltà Fellow, supportato da Pew Charitable Trusts e la Fondazione Alexander von Humboldt, rispettivamente.

1. esaminare l'effetto del fungicida esposizione su Bumble Bee Colony successo utilizzando campo gabbia esperimenti <ol><li>Set 10 maglia gabbie in un campo piantato con avena. Scavare una trincea intorno ogni gabbia e tutti e quattro i bordi della gabbia della maglia di scavare nel terreno per garantire che le API non possono sfuggire. Magazzino le gabbie con piante fiorite in vaso, che sono noti per essere attraente per le API (ad es. grano saraceno, borragine, alyssum, cosmos e girasoli) ( Figura 2).</li>
	<li>Supplemento le gabbie con un unico cassetto (36 x 42 cm) di trifoglio in fiore. Risorse floreali all'interno di un angolo della gabbia, occupando uno spazio di circa 2,5 m x 1 m. vegetare la restante area di gabbia di avena cluster.</li>
	<li>Assegnare casualmente il calabrone colonie, ciascuna contenente i lavoratori e una singola con letto queen, un trattamento (fungicida presente/assente, N = 5 colonie per ogni trattamento, 10 colonie totale), quindi inserirli all'interno di una gabbia di campo (N = 1/gabbia) per 29 giorni (23 giugno -21 luglio 2014).</li>
	<li>Orient le caselle di Colonia tale che la Colonia &#39; aperture s punto a sud per fornire le API con condizioni di navigazione ottimale. Sovvenzionare le colonie con vesciche di acqua zucchero, collocati all'interno delle scatole di alveare per integrare disponibilità di nettare.</li>
	<li>Applica basati su clorotalonil fungicida a livello campo-pertinenti (20 g/L) per piante fiorite nelle gabbie trattamento cinque fungicida, utilizzando una mano tenuta spruzzatore dell'antiparassitario, due volte durante lo studio (giorno 0 e 13). Cappotto in modo uniforme i fiori tale che nessun ulteriore liquido aderisce a superfici floreale ( Figura 3).</li>
	<li>A conclusione dello studio gabbia campo, rimuovere a mano le colonie di b. impatiens dalle gabbie, raffreddare gli alveari mettendo nel congelatore a -20 ° C per 20 min.</li>
	<li>Rimuovere le API utilizzando pinze sterili e registrare il numero di larve, pupe, le femmine adulte (i. e. raccoglitrici) e i maschi adulti. Utilizzando una bilancia analitica registrare il peso a secco della regina madre, larve, pupe, femmine adulte (cioè raccoglitrici) e maschi adulti.</li>
</ol> 2. Esaminare gli effetti di fungicida esposizione sulle comunità microbiche in polline-disposizioni di Bumble Bee nidi utilizzando laboratorio basato In Vivo studi <ol><li>Pulverize commercialmente acquistato polline polvere finissima utilizzando uno standard laboratorio-laminatoio di sfera. Sterilizzare in polvere polline ammollo in etanolo al 70%, lasciandolo evaporare durante la notte sotto la luce UV. Verificare la sterilità del polline di placcatura ~0.5 mg su General-Purpose agarizzati.
	<ol><li>a secco, polline sterilizzato, utilizzando pipette sterilizzati, aggiungere il dosaggio relativo campo del fungicida: propiconazolo al 14,3%; azoxystrobin 22,9% per trattamenti (0.74 µ l e 0,65 µ l rispettivamente / giorno / alveare). Mescolare bene usando bastoni di legno sterilizzati.</li>
	</ol></li> <li>Posto 6 alveari sperimentali (n = 3 ciascuno per il controllo e trattamento) in un laboratorio pulito, igienico benchtop mantenuta a temperatura ambiente. Ogni giorno pesare 4,27 g di polline 34 , 35, mescolato con acqua sterile (per controllo) all'interno di una cappa usando una tecnica asettica standard o fungicidi (per i trattamenti).
	<ol><li>Utilizzando le porte trappola fornite dal lato della scatola di cartone che racchiude le arnie, introdurre il polline all'interno le arnie. Supplemento gli alveari con soluzione di zucchero sterilizzato ogni settimana. Continuare il regime d'alimentazione per quattro settimane.</li>
	</ol></li> <li>a conclusione dello studio lab-basata, raffreddare gli alveari mettendo in congelatore a-20 ° C per 20 min. raschiare fuori il polline-disposizioni contenute all'interno di covata chambers utilizzando pinze sterili e spatole e posto in tubi di stoccaggio sterile. Conservare a-80 ° C. Count e registrare il peso dei lavoratori e regina madre all'inizio e alla fine dell'esperimento (punto 1.7).</li>
	<li>Isolare il DNA da campione di polline-fornitura mediante isolamento del DNA disponibile in commercio Kit (Vedi materiali tavolo per dettagli).
	<ol><li>Aggiungere 0,25 g di polline-disposizione per estrazione tubi, brevemente vortice mescolare.</li>
		<li>Fare un 200 mg/mL soluzione di lisozima in acqua distillata deionizzata, abbastanza per 50 µ l di campione. Agitare vigorosamente per soluzione completamente forma.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l della soluzione di lisozima per i tubi di estrazione con il campione in esso e mescolare bene capovolgendo più volte. Incubare la provetta per 10 min a 37 ° C in un bagno d'acqua. Se ha forma un precipitato, riscaldare la soluzione a 60 ° C fino a quando disciolto prima dell'uso.</li>
		<li>Aggiungere 70 µ l di soluzione acquosa Lisi per tubi di estrazione, fissare orizzontalmente su un pad di vortice a base piatta con nastro adesivo, e tubi di vortice per 10 min. centrifuga a 10.000 x g per 30 s a temperatura ambiente.</li>
		<li>Trasferire il surnatante in una provetta di raccolta pulita 2 mL. Aggiungere 250 µ l di soluzione di precipitazione della proteina e vortexare per 5 s. Incubare a 4 ° C per 5 min in un bagno di ghiaccio. 
		Nota: Si aspettano tra 400 µ l a 500 µ l del surnatante. Surnatante potrebbe ancora contenere alcune particelle.</li>
		<li>Centrifugare le provette a temperatura ambiente per 1 min a 10.000 x g e trasferire fino a 600 µ l del surnatante in una provetta di raccolta pulita 2 mL. Aggiungere 200 µ l di soluzione per la rimozione acquosa inibitore, brevemente, vortex e incubare a 4 ° C per 5 min. Centrifugare le provette a temperatura ambiente per 1 min a 10.000 x g. trasferire fino a 750 µ l del surnatante in una provetta di raccolta pulita 2 mL.</li>
		<li>Aggiungere 1200 µ l di soluzione acquosa bind per il surnatante e vortexare per 5 s. caricare circa 675 µ l del surnatante in un filtro spin e centrifugare a 10.000 x g per 1 min a temperatura ambiente. Scartare il flusso attraverso.</li>
		<li>Ripetere 2.4.7. due volte. 
		Nota: Un totale di tre carichi per ogni campione elaborato sono necessari.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l etanolo e centrifuga a temperatura ambiente per 30 s a 10.000 x g. scartare il flusso attraverso e centrifugare nuovamente a temperatura ambiente per 1 min a 10.000 x filtro spin di g. posto in una provetta pulita 2 mL.</li>
		Buffer di <li>aggiungere 100 µ l di eluizione al centro della membrana del filtro. Centrifuga a temperatura ambiente per 30 s a 10.000 x g. gettare il filtro spin. Archivio raccolto DNA tra-20 ° C e -80 ° C</li></ol></li> <li>uso isolato del DNA per il sequenziamento.
	<ol><li>Quantificare e normalizzare il DNA isolato a 2 ng / µ l di analisi fluorometrica.
		Reazioni <ol><li>preparare in triplice copia per ogni campione estratto confrontare la quantità relativa di 28S (pianta), analizzare i suoi (funghi) e 16S (batterica) componenti di ogni campione di polline-disposizione 36. Garantire che ogni reazione contiene 10 ng di DNA totale e 2 x di mix master di tintura base asimmetrica cianina 2,5 µ l di primer forward e reverse coppie 28KJ/28B 37 per pianta e ITS1/ITS5.8R per DNA fungoso 38 .</li>
		</ol></li> <li>Amplificare DNA utilizzando i seguenti parametri: pre-denaturazione 2 min a 50 ° C, 2 min denaturazione iniziale a 95 ° C, 40 cicli di (15 s a 98 ° C, 15 s a 58 ° C, 60 s a 72 ° C), seguita da una curva di fusione.</li>
		<li>Preparare un protocollo PCR 2-step, nidificato utilizzando librerie di sequenziamento di nuova generazione rRNA 16S di targeting regione variabile V3/V4 e ITS / 5.8s regione distanziatore rRNA.
		<ol><li>Aggiungere 12,5 µ l di DNA a 5 pmoli di ciascun primer e 2 x mix master. Fare reazioni separate per ciascuna regione (16S o ITS; cfr. tabella 1). Modificare primers specifici regione come descritto in precedenza 39 , 40 aggiungere sequenze nucleotidiche di adattatore specifico sequencer sporgenza per le sequenze di gene-specific del.</li>
			<li>Eseguire amplificazione iniziale utilizzando i seguenti parametri: 3 min denaturazione iniziale a 95 ° C, 25 cicli di (30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 30 s a 72 ° C), 5 min estensione finale a 72 ° C.</li>
			<li>Seguente iniziale amplificazione, verificare la dimensione di biblioteca e la quantità di mobilità elettroforetica e pulire usando un 1 x volume fase solida reversibile immobilization perline per rimuovere primer residuo e reagenti di reazione. Piscina 16S e sua ampliconi quantitativamente per creare un pool di amplicon singolo per ciascun campione.</li>
			<li>Aggiungere schede specifiche di sequencer e assaggiare gli indici dual specifici utilizzando i seguenti primer (Vedi tabella 1). Aggiungere 2,5 µ l di DNA amplificato a 5 pmoli di ciascun primer e 2 x mix master. Eseguire amplificazione libreria utilizzando i seguenti parametri: 3 min denaturazione iniziale a 95 ° C, 8 cicli di (30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 30 s a 72 ° C), 5 min estensione finale a 72 ° C.</li>
		</ol></li> <li>Seguente PCR, pulito finite librerie utilizzando un volume di 1 x di perline reversibile immobilizzazione in fase solida. Valutare la qualità e la quantità delle librerie finite utilizzando la mobilità elettroforetica e fluorimetria, rispettivamente. Standardizzare le librerie a 2 µM e piscina prima del sequenziamento.</li>
		<li>Eseguire il sequenziamento di nuova generazione su una piattaforma analoga per le schede aggiunte nella PCR secondario, con una lunghezza adeguata per coprire l' intero amplicone 41.</li>
	</ol></li> <li>Sequenza annotazione e analisi della composizione microbica.
	<ol><li>Combine coppia-fine dati di sequenziamento (R1 e R2) nel singolo contigs per librerie tutte in sequenza. Dopo l'Unione di file sia R1 e R2, viene prodotto un file di singolo fasta per ognuna delle librerie. 
		Nota: Questo passaggio e i processi descritti di seguito (se non diversamente indicato) sono eseguiti in Mothur versione 1.38.0 38.</li>
		<li>Schermo ogni file fasta per rimuovere basi ambigui, inaspettati lunghe sequenze e lunghi omopolimeri. 
		Nota: I parametri per lo screening e la rimozione di sequenza sono maxambig = 0, maxlength = 600 e maxhomop = 8 per entrambi i geni. Rimuovere le sequenze identiche, ma mantenere una tabella di contingenza separatamente per tutte le librerie (a.k.a. tabella di conteggio in Mothur).</li>
		<li>Allineare sequenze uniche della biblioteca gene 16S contro la versione del database SILVA 123 e la biblioteca ITS gene contro l'unire ITS database 42. 
		Nota: Sequenze devono essere annotate dal livello unito al livello di genere.
		<ol><li>Successivamente, cluster allineati sequenze con la funzione pre.cluster utilizzando diff = 5 e rimuovere le chimere.</li>
		</ol></li> <li>Classificare sequenze utilizzando il metodo Wang 43 basato sui file di unire la sua (per gene ITS) Tassonomia (valore massimo di 80%) e SILVA (per gene 16S).</li>
		<li>Caricare in R 44 le tabelle di contingenza (uno per ogni gene) generate durante il processo di classificazione in Mothur. Ad ogni livello tassonomico, ottenere abbondanza relativa a libreria per un'ulteriore analisi della comunità microbica modifiche. 
		Nota: Ogni livello tassonomico, unire insieme gruppi tassonomici quando abbondanza relativa è inferiore al 2% per tutte le ripetizioni sperimentale.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Le indagini sugli effetti dei fungicidi sulla salute delle API sono rimaste un aspetto understudied di strategie di lotta. Il nostro studio si propone di colmare questo divario di conoscenza utilizzando una suite di tecniche complementari che isolano in modo esplicito i potenziali fattori ape declini. La pianificazione, la spiegazione razionale e il rendering di questi esperimenti sono dettagliati sotto.
È importante garantire che nessuna ape sono ammessi per sfuggire la mesh degli esperiment...

Gestito e specie di api selvatiche sono verificati diffuse diminuisce, con importanti implicazioni per entrambi i sistemi naturali e agricoli1. Nonostante sforzi concertati per comprendere le cause di questo problema, i fattori guida declini di ape del miele non sono ancora ben compreso2,3,4. Per alcune specie di api selvatiche, native, la situazione è diventata terribile5,6. Se le popolazioni di API non possono essere sostenute quando si intersecano con l'agricoltura industriale, la popolazione continuerà a cadere e le colture che richiedono impollinatori (35% della produzione mondiale7) resisterà ridotto raccolti.
Mentre molti potenziali fattori quali l'esposizione dell'antiparassitario, malattia e habitat perdita1,4,8,9,10 sono stati implicati nel declino di API del miele, relativamente piccolo è conosciuto circa l'effetto interattivo di questi fattori di stress sulla salute delle API native, all'interno o vicino a sistemi agricoli. Molti sforzi di ricerca corrente continuano a concentrarsi su insetticidi, (ad es., neonicotinoidi11,12), anche se in passato la ricerca indica che fungicidi possono anche svolgere un ruolo nella diminuzione di API alterando la formazione della memoria, ricezione olfattiva13, nido riconoscimento14, l'attività enzimatica e funzioni metaboliche15,16,17. A livello globale, fungicidi continuano ad essere applicati alle colture di fioritura durante la fioritura. Studi recenti hanno documentato che le API comunemente riportare residui fungicida in alveare18, infatti, hanno dimostrato una grande proporzione di alveari testati contenuti fungicida residui19,20. Ulteriore lavoro ha rivelato quel residuo fungicida è associato con alti tassi di miele ape mortalità larvale21,22,23 e la presenza di "polline entombed" all'interno di colonie, che anche se non tossico, è privo di attività microbica e nutrizionalmente compromessa24. Nonostante il fatto che fungicidi lungamente sono stati considerati "bee-safe", ora c'è prova che l'esposizione al fungicida da solo può causare perdite gravi Colonia in una specie di ape di bumble nativo, Bombus impatiens25.
Per stabilire la causalità tra l'esposizione fungicida e Colonia mortalità, il modus operandi di queste sostanze chimiche devono essere determinate. Come evidenziato nei suoli26, sedimenti27e ambienti acquatici28, mirando ai funghi, fungicidi più probabile alterano fungina abbondanza e diversità all'interno di polline-disposizioni, quindi richiamando un'importante comunità shift che fortemente può favorire i batteri. Senza concorrenti fungine o antagonisti, alcuni batteri patogeni possono proliferare relativamente incontrollato, facilitando il deterioramento di polline-disposizioni. Ricerca passata ha dimostrato che i microrganismi, in particolare lieviti e funghi filamentosi, servire come simbionti nutrizionale per le API29,30,31, proteggere contro parassiti e patogeni32 ,33e fornire la conservazione a lungo termine dei depositi di polline. Fungicidi, pertanto, indirettamente possono danneggiare le API immature interrompendo la comunità microbica che è necessario per fornire tali servizi e/o aumentando la suscettibilità a parassiti e patogeni opportunistici12. Con l'aumento di richieste sulla produzione alimentare, raccolti in tutto il mondo vengono spruzzati ogni anno con fungicidi durante la fioritura, sottolineando la necessità di comprendere la portata di tali effetti indotti da fungicida.
A-data, le lacune di conoscenza primaria relative API native microbica ecologia può essere rappresentato dalle seguenti domande: fino a che punto cambia fungicida della comunità microbica nel ape polline-disposizioni? Quali sono gli effetti a valle di consumare polline con una comunità microbica profondamente alterata? In linea con queste domande ecologicamente germane, gli esperimenti sono stati sviluppati con gli obiettivi primari di rivelare 1) quel residuo fungicida da solo può causare grave Colonia declino in una specie di API native; 2) il grado a cui le comunità microbiche in polline-disposizioni sono alterate di fungicidi e 3) come la salute delle API è influenzata da una comunità microbica gravemente alterata. Gli obiettivi sperimentali sono stati definiti per affrontare le questioni di cui sopra utilizzando una combinazione di esperimenti di laboratorio e campo-base. Utilizzando state-of-the-art metagenomica e tecniche molecolari a fianco dei tradizionali metodi di osservazione del campo, la ricerca si propone di mettere insieme i potenziali effetti dei fungicidi sulla salute delle API.
Il primo obiettivo di questo studio è di dimostrare che l'esposizione fungicida da solo può causare perdite di Colonia significativa tra specie di API native. Uno studio che coinvolge gabbie grande campo è stato utilizzato per studiare gli effetti dell'esposizione di fungicida sulla crescita Colonia di Bombus impatiens, un'ape nativa onnipresente, abbondante negli Stati Uniti (Figura 1, Figura 2, Figura 3). È stato supposto che fungicida-trattati alveari presenterebbe fitness inferiore e Demografia atipico rispetto ai non esposti alveari. I dati ottenuti da questo esperimento supportano questa ipotesi, dimostrando che i residui di fungicidi all'interno di polline possono essere l'unica causa delle perdite di Colonia profonda in un nativo bumble bee specie25. Il secondo obiettivo di questo studio è quello di indagare la risposta del microbioma polline all'esposizione di fungicida. È stato ipotizzato che la composizione della comunità di microbi all'interno di polline-disposizioni esposti ai fungicidi sarà diversa da quello di polline non trattati. Mentre diversità e abbondanza fungina dovrebbero diminuire significativamente, i batteri e/o una singola specie fungina dominante probabilmente crescerà incontrollata in assenza di altri funghi concorrenti. Attraverso una serie di prove in vivo , questi cambiamenti nella composizione della comunità microbica saranno analizzati utilizzando metagenomica.

<table><tbody><tr><td>Natupol Beehive</td><td>Koppert</td><td>USRESM1</td><td>16 hives</td></tr><tr><td>Propiconazole 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazole 14.3%</td></tr><tr><td>Abound</td><td>Syngenta</td><td>4033540</td><td>Azoxystrobin 22.9%</td></tr><tr><td>Chlorothalonil</td><td>Syngenta</td><td>3452</td><td>Fungicide used for trials</td></tr><tr><td>Pollen granules</td><td>Bee rescued</td><td>B004D5650C</td><td>3X 16oz bottles, pollen for trials</td></tr><tr><td>Bacterial strains for inoculation</td><td>Currie Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast strains for inoculation</td><td>Hittinger lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer pairs</td><td>UW Biotech Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Isolation Kit</td><td>Mo Bio</td><td>12830-50</td><td>Commercial DNA isolation kit</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td>DNA quantification tool</td></tr><tr><td>Select Master Mix for CFX</td><td>Thermo Fisher</td><td>4472952</td><td>Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.</td></tr><tr><td>Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio Rad</td><td>1855196</td><td>Instrument used for PCR amplification</td></tr><tr><td>PCR Clean-Up Kit,</td><td>Axygen</td><td>10159-696</td><td>Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes</td></tr><tr><td>DNA 1000 Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Used for sizing and analysis of DNA fragments</td></tr><tr><td>MiSeq Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td>Used for next-generation sequencing</td></tr><tr><td>Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health

I coltivatori spesso utilizzano fungicida spray durante la fioritura per proteggere le colture contro la malattia, che espone le API ai residui di fungicidi. Anche se considerato "bee-safe", c'è prova di montaggio che residui di fungicida in polline sono associate con i declini di ape (per specie di ape di bumble e miele). Mentre i meccanismi rimangono relativamente sconosciuti, i ricercatori hanno speculato che la simbiosi di ape-microbo sono coinvolti. Microbi giocano un ruolo fondamentale nella conservazione e/o elaborazione di polline, che serve come nutrimento per le API larvale. Alterando la comunità microbica, è probabile che i fungicidi interrompono questi servizi microbo-mediata e quindi compromettono la salute delle API. Questo manoscritto descrive i protocolli utilizzati per indagare i meccanismi indiretti da cui fungicidi possono essere la causa declino di Colonia. Esperimenti di gabbia esponendo le API ai fiori fungicida-trattati hanno già fornito la prima prova che fungicidi causano perdite colonia profonda in un calabrone nativo (Bombus impatiens). Utilizzando il campo rilevanti dosi di fungicidi, una serie di esperimenti sono stati sviluppati per fornire una descrizione più fine delle dinamiche di comunità microbica di polline fungicida-esposti. Cambiamenti nella composizione strutturale di assemblaggi fungine e batteriche all'interno il microbioma di polline sono indagati dal sequenziamento di nuova generazione e analisi metagenomica. Esperimenti sviluppati nel presente documento sono stati progettati per fornire una comprensione meccanicistica di come fungicidi influenzano il microbioma del polline-disposizioni. In definitiva, questi risultati dovrebbero far luce sulla via indiretta attraverso il quale fungicidi possono causare cali di Colonia.

Studio di gabbia di campo:
I dati ottenuti dagli esperimenti gabbia colonie dell'ape di bumble presentava una significativa risposta all'esposizione di fungicida. Le arnie fungicida-trattati prodotta significativamente meno lavoratori (12,2 ± 3.8, media ± SE) che gli alveari di controllo (43,2 ± 11,2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (Figura 4). Inoltre, la biomassa delle A...

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Tecniche empiriche, metagenomiche e computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali i fungicidi compromettono la salute delle api | Ambiente | Video

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Consorzi microbici all'interno alveari dell'ape di bumble arricchiscono e preservare il polline per larve di ape. Mediante sequenziamento di nuova generazione, insieme al laboratorio ed esperimenti sul campo, questo manoscritto descrive protocolli utilizzati per verificare l'ipotesi che residui di fungicidi alterano il microbioma di polline e demographics di Colonia, infine conducendo alla Colonia perdita.

Empirica, metagenomica e tecniche computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali salute delle API di fungicidi compromesso

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

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Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

Valutare l&#39;effetto delle sostanze chimiche ambientali su Honey Bee sviluppo dall&#39;individuo alla colonia Livello

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

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Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey bee colony numbers have been declining in the United States and many European countries since 1947. A number of factors play a role in this decline, including the unintentional exposure of honey bees to pesticides. The development of new methods and regulations are warranted to reduce pesticide exposures to these pollinators. One approach is the use of repellent chemistries that deter honey bees from a recently pesticide-treated crop. Here, we describe a protocol to discern the deterrence of honey bees exposed to select repellent chemistries. Honey bee foragers are collected and starved overnight in an incubator 15 h prior to testing. Individual honey bees are placed into Petri dishes that have either a sugar-agarose cube (control treatment) or sugar-agarose-compound cube (repellent treatment) placed into the middle of the dish. The Petri dish serves as the arena that is placed under a camera in a light box to record the honey bee locomotor activities using video tracking software. A total of 8 control and 8 repellent treatments were analyzed for a 10 min period with each treatment was duplicated with new honey bees. Here, we demonstrate that honey bees are deterred from the sugar-agarose cubes with a compound treatment whereas honey bees are attracted to the sugar-agarose cubes without an added compound.

The loss of honey bee colonies presents a challenge to crop pollination services. Current pollinator protection practices warrant an alternative approach to minimize the contact of honey bees to harmful pesticides using repellent chemistries. Here, we provide detailed methods for a visual tracking protocol to screen deterrents for bees.

Protocollo di monitoraggio video a chimici detergenti dello schermo per le api di miele

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide regulation studies. The risk of exposure to fungicide residues is likely to be especially high if the spray occurs on, or near host plants while the bees are collecting pollen to provision their nests. For species of Osmia that consume pollen from a select group of plants (oligolecty), the inability to use pollen from non-host plants can increase their risk factor for fungicide-related toxicity. This manuscript describes protocols used to successfully rear oligolectic mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, from egg to prepupal stage within cell culture plates under standardized laboratory conditions. The in vitro-reared bees are subsequently used to investigate the effects of fungicide exposure and pollen source on bee fitness. Based on a 2 &#215; 2 fully crossed factorial design, the experiment examines the main and interactive effects of fungicide exposure and pollen source on larval fitness, quantified by prepupal biomass, larval developmental time, and survivorship. A major advantage of this technique is that using in vitro-reared bees reduces natural background variability and allows the simultaneous manipulation of multiple experimental parameters. The described protocol presents a versatile tool for hypotheses testing involving the suite of factors affecting bee health. For conservation efforts to be met with significant, lasting success, such insights into the complex interplay of physiological and environmental factors driving bee declines will prove to be critical.

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Fungicide sprays on flowering plants may expose solitary bees to high concentrations of pollen-borne fungicide residues. Using laboratory-based experiments involving in vitro-reared bee larvae, this study investigates the interactive effects of consuming fungicide-treated pollen derived from host and non-host plants.

In Vitro Allevamento di api solitarie: uno strumento per valutare i fattori di rischio larvale

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in the shikimate pathway, which is virtually universal in plants. The inhibition of the enzyme stops the production of three essential amino acids: phenylalanine, tyrosine, and tryptophan. EPSPS is also present in fungi and prokaryotes, such as archaea and bacteria; thus, the use of GBP may have an impact on the microbiome composition of soils, plants, herbivores, and secondary consumers. This article aims to present general guidelines to assess the effect of GBP on microbiomes from field experiments to bioinformatics analyses and provide a few testable hypotheses. Two field experiments are presented to test the GBP on non-target organisms. First, plant-associated microbes from 10 replicated control and GBP treatment plots simulating no-till cropping are sampled and analyzed. In the second experiment, samples from experimental plots fertilized by either poultry manure containing glyphosate residues or non-treated control manure were obtained. Bioinformatics analysis of EPSPS protein sequences is utilized to determine the potential sensitivity of microbes to glyphosate. The first step in estimating the effect of GBP on microbiomes is to determine their potential sensitivity to the target enzyme (EPSPS). Microbial sequences can be obtained either from public repositories or by means of PCR amplification. However, in the majority of field studies, microbiome composition has been determined based on universal DNA markers such as the 16S rRNA and the internal transcribed spacer (ITS). In these cases, sensitivity to glyphosate can only be estimated through a probabilistic analysis of EPSPS sequences using closely related species. The quantification of the potential sensitivity of organisms to glyphosate, based on the EPSPS enzyme, provides a robust approach for further experiments to study target and non-target resistant mechanisms.

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. In this article, we introduce general guidelines to quantify the effect of GBP on microbiomes, from field experiments to bioinformatics analyses.

Quantificazione del potenziale impatto dei prodotti a base di glifosato sui microbiomi

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ingestion of provisions contaminated with pesticides may increase the mortality rate of the larvae, decrease the collection rate and the population of adult solitary bees in the next year from a demographic perspective. But there are limited studies on the effects of pesticides on the larvae of solitary bees. Therefore, understanding how pesticides influence the larvae of solitary bees should be considered an integral part of pesticide ecological risk assessment. This study presents a method to expose the larvae of solitary bee, Osmia excavata, to lethal or sublethal doses of pesticide, tracking larval weight gain, developmental duration, eclosion ability, and food consumption efficiency conversion of ingested food. To demonstrate the effectiveness of this method, the larvae of O. excavata were fed with provisions containing acute lethal and sublethal doses of chlorpyrifos. Then, the above indexes of the treated larvae were investigated. This technique helps to predict and mitigate the risk of pesticides to pollinators.

The present protocol explains a method to feed pesticide-contaminated provisions to the larvae of the solitary bees, Osmia excavata. The procedure examines the ecotoxicity of the pesticide to the larvae of the solitary bees.

Valutare l'effetto dei pesticidi sulle larve delle api solitarie

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

Biochimica

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Neuroscienze

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Monitoraggio effetti Colonia-livello di esposizione dell'antiparassitario subletali sulle API di miele

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Biologia

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee health, including exposure to viral pathogens. Such viruses can cause a wide variety of devastating effects and can often be challenging to study due to multiple factors that make it difficult to separate the effects of experimental treatments from preexisting background infection. Here we present a method to mass produce large quantities of virus particles along with a high throughput bioassay to test viral infection and effects. Necessitated by the current lack of a continuous, virus-free honey bee cell line, viral particles are amplified in vivo using honey bee pupae, which are extracted from the hive in large volumes using minimally stressful methodology. These virus particles can then be used in honey bee cage bioassays to test inocula viability, as well as various other virus infection dynamics, including interactions with nutrition, pesticides, and other pathogens. A major advantage of using such particles is that it greatly reduces the chances of introducing unknown variables in subsequent experimentation when compared to current alternatives, such as infection via infected bee hemolymph or homogenate, though care should still be taken when sourcing the bees, to minimize background virus contamination. The cage assays are not a substitute for large-scale, field-realistic experiments testing virus infection effects at a colony level, but instead function as a method to establish baseline viral responses that, in combination with the semi-pure virus particles, can serve as important tools to examine various dimensions of honey bee-virus physiological interactions.

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Here we describe two protocols: first to propagate, extract, purify, and quantify large quantities of honey bee non-enveloped virus particles, including a method for removing honey bee pupae and second to test the effects of viral infection using a highly repeatable, high-throughput cage bioassay.

Preparazione dell'inoculo arricchito da virus per l'infezione orale delle api mellifere (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Valutazione del rischio agrochimico per le regine delle api da miele accoppiate

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

Cost-Effective Method for Safely Handling and Sampling Field-Collected Bees

A Rapid Method to Confine and Safely Handle Bees in the Field

Improving understanding of the basic biology and ecology of many insect pollinators, particularly specialist or rare taxa, is a priority for many researchers. As such, there is often a need to temporarily confine field-collected organisms in a non-injurious manner in order to gain information or support additional studies. This protocol represents a thoroughly tested, quick, and inexpensive field method for safely handling bees of conservation concern that can easily be tailored toward specific project needs, including organism identification, pollen removal, marking, and/or collection of non-lethal tissue samples for genetic analysis. This methodology can serve as an additional option in the researcher's toolbox to use when certain scenarios arise. It is anticipated that this methodology can be adapted for use with other insect species as well as used by individuals of varying experience and skill levels. It can be of great value to researchers studying specialist bees or conducting host-specific studies. The data collection made possible by this protocol will be invaluable to help researchers address critical data gaps for many pollinator species, plant-pollinator network structures, and pollinator conservation and management initiatives.

We demonstrate a tested method for safely handling field-collected bees. This method allows swift manipulation, identification, genetic sampling, and confirmation of plant-insect interactions via pollen collected while sampling. Easily adaptable, this approach offers a cost-effective, non-lethal means to study rare insect groups.

Empirica, metagenomica e tecniche computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali salute delle API di fungicidi compromesso

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