Yazar(lar) amplifikasyon ve sıralama özellikleri ve Hizmetleri, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto ve Max Haase ile teknik yardım sağlamak için sağlamak için Wisconsin Üniversitesi biyoteknoloji Merkezi DNA sıralama tesis teşekkür Moleküler analizi. Bu eser USDA tarımsal araştırma Servisi tahsis fonlar (geçerli araştırma bilgi sistemi #3655-21220-001) tarafından desteklenmiştir. Daha fazla destek (altında Grant No Ulusal Bilim Vakfı tarafından sağlanan Deb-1442148), DOE büyük göller biyoenerji Araştırma Merkezi (Office DOE bilim BER DE-FC02-07ER64494) ve USDA Ulusal Enstitüsü gıda ve Tarım (Hatch projesi 1003258). C.T.H. biyomedikal Bilimleri ve bir Alfred Toepher öğretim görevlisi, sırasıyla Pew Charitable güvenir ve Alexander von Humboldt Vakfı tarafından desteklenen bir Pew yazardır.

1. mantar ilacı pozlama etkisi Bumble Bee Colony başarı kullanarak alan kafes deneyler incelemek <ol><li>Set on kadar kafes kafes bir alanda dikildi yulaf ile. Her kafes çevresinde bir siper kazmak ve kafes kafes tüm dört kenarları arılar kurtuluş yok emin olmak için zemine kazmak. Arılara (örneğin buğday, hodan, alyssum, evren ve ayçiçeği) çekici olduğu bilinmektedir saksı, çiçekli bitkiler ile kafesleri stok ( Şekil 2).</li>
	<li>Bloom yonca tek tepsi (36 cm x 42 cm) ile kafesleri ek. Küme köşelerinden yulaf tarafından yaklaşık 2.5 m x 1 m. Vegetate kalan kafes alan bir yer kaplayan kafesin içinde çiçek kaynakları.</li>
	<li>Rasgele koloniler, içeren her işçi ve tek bir Kraliçe, bir tedavi bumble bee atama (mantar ilacı hediye/yok, N = tedavi başına 5 koloniler, 10 kolonileri toplam), sonra onları bir alan kafes içinde yer (N = 1/kafes) 29 gün (23 Haziran -21 Temmuz 2014).</li>
	<li>Şark koloni kutuları öyle ki koloni &#39; s açıklıklar gelin arılar ile en uygun seyir koşulları sağlamak için güneyde. Şeker su mesane, nektar kullanılabilirlik ek olarak kovan kutularının içinde yerleştirilir ile kolonileri sübvanse.</li>
	<li>Uygula chlorothalonil tabanlı fungisit çiçekli bitkiler beş mantar ilacı tedavi kafeslerde alan ilgili bir seviyeye (20 g/L) adlı bir el kullanarak böcek ilacı püskürtme, iki kez çalışma (gün 0 ve 13) sırasında düzenlenen. Öyle ki hiçbir daha fazla sıvı çiçek yüzeylere ( şekil 3)'in çiçekleri düzgün kat.</li>
	<li>Ve sonuç alan kafes çalışmanın B. Impatiens kolonileri kafesleri üzerinden el ile kaldırmak, -20 ° C-dondurucu 20 dakika süreyle yerleştirerek kurdeşen serin</li>
	<li>Kaldırmak steril forseps kullanarak arılar ve larva, Pupa, Yetişkin kadın kaydedin (ı. e. toplayıcılar) ve yetişkin erkekler. Bir analitik denge kullanarak kaydetmek Kuru Ağırlık annesi Kraliçe, larva, Pupa, Yetişkin kadın (Yani toplayıcılar) ve yetişkin erkekler.</li>
</ol> 2. In Vivo çalışmalarda Bumble Bee yuvalarını kullanarak laboratuvar dayalı polen hükümleri mikrobiyal topluluklar üzerinde mantar ilacı pozlama etkileri incelemek <ol><li>ticari olarak satın Pulverize polen bir standart kullanarak ince bir toz için Laboratuvar top-mill. Toz polen % 70 etanol, gecede UV ışık altında buharlaşır izin ıslatarak sterilize. Kısırlık polen ~0.5 mg genel amaçlı agar medya üzerinde kaplama tarafından doğrulayın.
	<ol><li>Kuru için sterilize polen, steril Pipetler, kullanarak eklemek mantar ilacı alan ilgili doz: %14,3; propiconazole azoxystrobin %22,9 tedaviler için (0,74 µL ve 0.65 µL sırasıyla / gün / hive). İyi sterilize edilmiş ahşap çubukları kullanarak karıştırın.</li>
	</ol></li> <li>Yer 6 deneysel kurdeşen (n = 3 her kontrol ve tedavi için) bir temiz, hijyenik laboratuar benchtop oda sıcaklığında muhafaza içinde. Her gün mantar ilaçları (için Tedaviler) veya standart aseptik tekniği kullanarak bir başlık içinde (Denetim için) steril su ile karıştırılarak polen 34 , 35 4.27 g tartmak.
	<ol><li>Tuzak kapı kovanlar, kapsayan karton kutu yan tarafından sağlanan kullanarak tanıtmak polen kovanlar içinde. Kurdeşen sterilize şeker çözeltisi ile her hafta ek. Dört haftadır rejim besleme devam.</li>
	</ol></li> <li>-20 ° C-dondurucu 20 dk. Scrape sterilize forseps ve spatula kullanarak damızlık Odaları içinde yer polen hükümler dışarı yerleştirip steril depolama tüpler yerinde kovanlar laboratuar tabanlı çalışma sonucunda, serin. Mağaza-80 ° C. sayısı ve kayıt ağırlığı işçiler ve başlangıç ve bitiş deneme (Adım 1,7), Ana Kraliçe.</li>
	<li>İzole DNA'ları piyasada bulunan DNA yalıtım kullanarak polen tedariki örnek kitleri (malzemeler tablo ayrıntılar için bakınız).
	<ol><li>Polen-hükmün ayıklama için 0, 25 g tüpler, kısa bir süre karıştırmak için girdap ekleyin.</li>
		<li>200 mg/mL deiyonize distile su, 50 µL/örnek için yeterli lizozim çözüm olun. Shake şiddetle tamamen formu çözüm.</li>
		<li>Bu örnekte ayıklama tüplerini 50 µL lizozim çözüm eklemek ve de birkaç kez ters çevirme ile karıştırın. Bir su banyosu içinde 37 ° C'de 10 dakika için tüp kuluçkaya. Çökelti oluşturmuştur Eğer çözüm kullanmadan önce eriyene kadar 60 ° c ısı.</li>
		<li>Ayıklama tüpler, sulu lizis çözüm eklemek 70 µL güvenli yatay bandı ile bir Kafesli döşeme girdap yastık üzerinde ve girdap için 10 dk santrifüj tüpleri 10.000 x g 30 için de oda sıcaklığında s.</li>
		<li>Süpernatant temiz 2 mL toplama tüp aktarın. 5 dakika içinde bir buz banyosu için 4 ° C'de 5 s. Incubate protein yağış çözüm ve girdap 250 µL add. 
		Not: süpernatant ile 500 µL için 400 µL arasında bekliyoruz. Süpernatant hala içeriyor olabilir bazı parçacıklar.</li>
		<li>10.000 x g, 1 dk. için oda sıcaklığında tüpler santrifüj kapasitesi ve 600 µL olan süpernatant temiz 2 mL toplama tüp aktarın. Sulu inhibitörü kaldırma çözüm, kısaca, girdap 200 µL ekleyin ve 5 dk. 10.000 x g., 1 dk. için oda sıcaklığında tüpler Transfer süpernatant ile 750 µL kadar temiz 2 mL koleksiyonu tüpüne santrifüj 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Ekle 1200 µL sulu bağlama çözüm süpernatant ve 5 için girdap s. yaklaşık 675 µL süpernatant üstüne bir spin filtre ve oda sıcaklığında 1 dk. için 10.000 x g, santrifüj, yük. Aracılığıyla akış atın.</li>
		<li>Tekrar 2.4.7. ikinci kez. 
		Not: Toplam üç yükler işlenen her örnek için gereklidir.</li>
		<li>Ekle 500 µL etanol ve oda sıcaklığında santrifüj 30 s 10.000 x g. aracılığıyla akış atmak ve santrifüj kapasitesi tekrar g. yer spin filtre bir temiz 2 mL toplama tüp x 10.000 ' 1 dakika oda sıcaklığında.</li>
		<li>Ekle 100 µL elüsyon, arabellek filtre membran ortasına. 30 oda sıcaklığında santrifüj 10.000 x g. s atma spin filtre. Mağaza toplanan DNA-20 ° ve-80 ° C arasında</li></ol></li> <li>kullanmak için sıralama DNA izole.
	<ol><li>Miktarını ve Fluorometrik analizi ile izole DNA 2 ng/µL'normalleştirmek.
		Nüsha 28S göreli miktarlarını karşılaştırmak ayıklanan her örnek için <ol><li>hazırla reaksiyonlar (bitki), onun (mantar), analiz ve 16S (bakteri) bileşenleri her polen tedariki örnek 36. Her reaksiyon 10 içerdiğinden emin olun ng toplam DNA, asimetrik siyanür boya göre ana Mix 2 x ve 2.5 µL her bitki için ileriye ve geriye doğru astar çiftleri 28KJ/28B 37 ve ITS1/ITS5.8R mantar DNA'ın 38 .</li>
		</ol></li> <li>DNA'sı aşağıdaki parametreleri kullanarak yükseltmek: 40 50 ° c, 2 dk ilk denatürasyon 95 ° C'de 2 dk öncesi denatürasyon döngüleri (15 98 ° c, 15 s s 58 ° c, 60 s 72 ° c), ardından bir erime eğrisi.</li>
		<li>Hazırlamak yeni nesil sıralama kitaplıkları 16S rRNA hedefleme kullanan bir 2-adım, iç içe geçmiş PCR Protokolü V3/V4 değişken bölge ve Its / 5.8s rRNA spacer bölge.
		Her astar ve 2 ana mix x <ol><li>ekleyin 12.5 µL DNA'ın 5'e pmol. (16S veya Its; bkz. Tablo 1) her bölge için ayrı reaksiyonlar olun. Gene özel sıraları için sequencer özel bağdaştırıcı çıkıntı nükleotit dizileri eklemek için yukarıda açıklanan 39 , 40 olarak bölge belirli astar değiştirmek.</li>
			<li>İlk amplifikasyon aşağıdaki parametreleri kullanarak gerçekleştirmek: 25 3 dk. ilk denatürasyon 95 ° c döngüleri (30 s 95 ° c, 30 s 55 ° c, 30 s 72 ° c), 5 min son uzantısı ' 72 ° C.</li>
			<li>Aşağıdaki ilk amplifikasyon, Kütüphane boyutu ve miktar tarafından elektroforetik hareketlilik doğrulayın ve 1 birim katı faz ters çevrilebilir imm x kullanılarak temizleArtık astar ve reaksiyon Kimyasalları kaldırmak için obilization boncuk. Havuz 16S ve kantitatif her örnek için bir tek amplicon havuzu oluşturmak için amplicons.</li>
			<li>Sequencer belirli bağdaştırıcıları eklemek ve belirli ikili dizinler (bkz. Tablo 1) aşağıdaki primerler kullanılarak örnek. Güçlendirilmiş DNA'ın 2.5 µL her astar ve 2 ana mix x 5 pmol ekleyin. Aşağıdaki parametreleri kullanarak kütüphane amplifikasyon gerçekleştirmek: 8 3 dk. ilk denatürasyon 95 ° c döngüleri (30 s 95 ° c, 30 s 55 ° c, 30 s 72 ° c), 5 min son uzantısı ' 72 ° C.</li>
		</ol></li> <li>Aşağıdaki PCR, temiz bitmiş kitaplıkları bir 1 x birim katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon boncuk için. Kalite ve miktar elektroforetik hareketlilik ve fluorometry, sırasıyla kullanarak bitmiş kütüphanelerin değerlendirmek. 2 µM ve sıralama önce havuzu için kitaplıklarına standartlaştırmak.</li>
		<li>Tüm amplicon 41 karşılamak için uygun bir uzunlukta ikincil PCR eklenen bağdaştırıcılarına benzer bir platform üzerinde yeni nesil sıralama gerçekleştirmek.</li>
	</ol></li> <li>Sıra ek açıklama ve mikrobiyal kompozisyon analizi.
	<ol><li>Birleştirme çift uçlu sıralama veri (R1 ve R2) tüm sıralı kitaplıkları için tek contigs. R1 ve R2 dosyalarını birleştirdikten sonra her kitaplık için bir tek fasta dosyası üretilir. 
		Not: Mothur sürüm 1.38.0 38 bu adım ve (aksi belirtilmedikçe) aşağıda açıklanan işlemler gerçekleştirilir.</li>
		<li>Belirsiz bazlar, beklenmedik uzun serileri ve uzun homopolymers kaldırmak için her fasta dosya ekran. 
		Not: Tarama ve sıra kaldırma maxambig parametreleridir = 0, maxlength = 600 ve maxhomop = 8 her iki genler için. Aynı sıraları kaldırmak, ancak bir contingence tablo tüm kitaplıkları (aka Mothur sayısı tablo) için ayrı ayrı devam.</li>
		<li>SILVA veritabanı sürümü 123 karşı gen 16S Kütüphane ve gen Its Kütüphanesi birleştirmek Its veritabanı 42 karşı benzersiz sıraların hizalayın. 
		Not: Dizileri cins seviyeye Krallık düzeyden açıklanmalıdır.
		<ol><li>Daha sonra küme uyumlu dizileri diff kullanarak işlev pre.cluster ile = 5 ve chimeras kaldırın.</li>
		</ol></li> <li>İstimal belgili tanımlık yöntem SILVA (için gen 16S) ve onun birleştirmek (için gen Its) taksonomi dosyalarını (kesme biçimi değerini % 80) göre Wang 43 dizileri sınıflandırmak.</li>
		<li>R 44 Mothur sınıflandırma işlemi sırasında oluşturulan contingence tabloları (gen başına bir adet) yükleyin. Taksonomik her düzeyde, mikrobiyal topluluk değişiklikleri daha iyi inceleyebilmemiz için kütüphane başına göreli bereket almak. 
		Not: göreli bereket tüm deneysel yinelemeleri için % 2'den az olduğunda taksonomik her düzeyde, taksonomik grupların birleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Etkisi soruşturmalar arı sağlığı üzerinde mantar ilaçları, böcek Yönetim Stratejileri çöküşünde bir yönünü kalmıştır. Bizim çalışma a maiyet-in açıkça arı düşüşler sürüş potansiyel faktörler izole tamamlayıcı teknikleri kullanarak bu bilgi boşluğu amaçlamaktadır. Planlama, mantığı ve işleme bu deneyler aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Hayır arılar bu demografi analiz taviz verecek bu yana kafes kafes deneyleri kaçmasına izin ...

Yönetilen ve yabani arı türü her ikisi de doğal ve tarım sistemleri1için önemli etkileri ile yaygın düşüşler yaşandığı. Bu sorunun nedenleri anlamak için uyumlu çabaları rağmen bal arı düşüşler sürüş hala değil iyi anlaşılan2,3,4etmenlerdir. Vahşi, yerli arıları belirli türler için durum korkunç5,6haline gelmiştir. Arı nüfusu ile endüstriyel tarım kesiştiği, nüfusları düşmeye devam edecek ve bitkileri polinatörler (dünya çapında üretim%735) gerektiren tahammül edecek sürekli olamaz eğer hasat azaltılmış.
Böcek ilacı pozlama gibi birçok potansiyel faktörler hastalık ve habitat kaybı1,4,8,9,10 bal arı düşüş karıştığı olmuştur, nispeten az etkileşimli etkisi bu stresler yerli arılar sağlık, içinde veya yakınında tarım sistemleri hakkında bilinir. Birçok mevcut araştırma çabalarının böcek öldürücüler, (örneğin, neonicotinoids11,12üzerinde), mantar ilaçları da bir rol arı düşüş bellek oluşumu bozulması tarafından oynayabilir ki son araştırma gösterir rağmen odaklanmaya devam, koku alma13, yuva tanıma14, enzim aktivitesi ve metabolik işlevleri15,16,17. Genel olarak, mantar ilaçları çiçeklenme sırasında çiçekli bitkiler için uygulanmaya devam. Son yıllarda yapılan çalışmalarda arılar genellikle mantar ilacı artıkları geri kovan18için gerçekten de getirmek., çalışmalar test kurdeşen bulunan mantar ilacı artıkları19,20büyük bir kısmı göstermiştir belgeledi. Daha fazla çalışma ortaya çıkar o mantar ilacı tortu yüksek oranda bal arı larva ölüm21,22,23 ve "entombed polen" koloniler içinde varlığı ile ilişkili olan, ancak toksik olmayan, mikrobiyal aktiviteyi yoksun ve beslenme güvenliği aşılan24. Mantar ilaçları uzun süre "arı için güvenli" olarak kabul edilmiştir ki rağmen hiçbir şey şimdi kanıt için mantar ilacı yalnız bu maruz kalma ciddi koloni kayıp bir yerel bumble bee türler, Bombus Impatiens25neden olabilir.
Ölüm, bu kimyasalların modus operandi nedensellik arasında mantar ilacı pozlama ve koloni kurmak için belirlenecek gerekir. Toprak26, çökeller27ve su ortamları28, mantarlar hedefleyerek kanıtladığı, mantar ilaçları olasılıkla mantar bereket alter ve çeşitlilik içinde polen-hükümler, böylece büyük bir topluluk çağırma kaydır güçlü bakteri lehine olabilir. Mantar rakip veya antagonistleri bazı Patojen bakteriler nispeten denetlenmeyen, polen-hükümler bozulma kolaylaştırmak prolifere. Araştırmalar göstermiştir mikroorganizmalar, özellikle Mayalar ve ipliksi Mantarlar, arılar29,30,31için beslenme simbiont olarak hizmet, parazitler ve patojenler32 karşı koruma ,33ve polen mağazaların uzun vadeli koruma sağlar. Mantar ilaçları, bu nedenle, dolaylı olarak olgunlaşmamış arılar bu hizmetleri sağlamak için gerekli mikrobiyal topluluk kesintiye tarafından ve/veya duyarlılık fırsatçı patojenler ve parazitler12artırarak zarar verebilir. Gıda üretim talepleri artan ile bitkileri dünya çapında her yıl mantar ilaçları ile mantar ilacı kaynaklı etkileri büyüklüğünü anlamak gerek vurgulayan bloom sırasında püskürtme.
Yerel arı mikrobiyal ekoloji temsil tarafından aşağıdaki soruları ile ilgili birincil bilgi boşlukları, Tarih: ne ölçüde mantar ilacı mikrobiyal toplum içinde arı polen-hükümler değişir mi? Polen derinden değişmiş bir mikrobiyal toplulukla tüketen aşağı akım etkileri nelerdir? Bu ekolojik konu ile ilgili sorular ile tutarak, deneyler 1 açığa birincil hedefleri ile geliştirilmiştir) Yalnız o mantar ilacı tortu ciddi koloni düşüş bir yerli arı türler; neden olabilir 2) derecesi için polen-hükümler mikrobiyal topluluklarda değiştirilmiş mantar ilaçları ve 3) nasıl arı sağlık ciddi biçimde değiştirilmiş bir mikrobiyal topluluk tarafından etkilenir. Deneysel amaçlar deney Laboratuvarı ve alan bazlı bir birleşimini kullanarak yukarıdaki sorulara yönelik olarak tanımlanmış. State-of--art metagenomic ve alan gözlem geleneksel yöntemleri yanında moleküler teknikleri kullanarak, bu araştırma mantar ilaçları olası etkilerini arı sağlığı üzerinde bir araya toplamaya amaçlamaktadır.
Bu çalışmanın ilk hedefi mantar ilacı pozlama yalnız yerli arı türler arasında önemli koloni kayıp neden olabilir göstermektir. Büyük alan kafesleri içeren bir çalışma Bombus Impatiens, (Resim 1, Resim 2, şekil 3) ABD'de her yerde, bol yerli arı koloni gelişimini mantar ilacı pozlama etkilerini araştırmak için kullanıldı. Bu mantar ilacı tedavi kovanları düşük fitness ve atipik demografi maruz olmayan yığınlar için karşılaştırıldığında sunacak olan. Mantar ilacı artıkları polen içinde derin koloni kayıp bir yerel bumble bee türler25tek nedeni olabilir gösteren bu hipotez desteklenen bu deneyden elde edilen veri. Polen microbiome yanıt için mantar ilacı pozlama araştırmak için bu çalışmanın ikinci amacı olduğunu. Mikroplar polen-hükümler için mantar ilaçları maruz içinde topluluk bileşimi tedavi edilmezse polen farklı olacak olan. Mantar bolluk ve çeşitlilik önemli ölçüde düşüş bekleniyor olsa da, bakteri ve/veya tek bir baskın mantar türü büyük olasılıkla diğer rakip mantarlar yokluğunda denetlenmeyen büyüyecek. In-vivo deneyler bir dizi sayesinde, bu vardiya mikrobiyal topluluk bileşiminde metagenomics kullanarak analiz edilecektir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Natupol Beehive</td>
			<td>Koppert</td>
			<td>USRESM1</td>
			<td>16 hives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propiconazole 14.3</td>
			<td>Quali-Ppro</td>
			<td>60207-90-1</td>
			<td>Propiconazole 14.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abound</td>
			<td>Syngenta</td>
			<td>4033540</td>
			<td>Azoxystrobin 22.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorothalonil</td>
			<td>Syngenta</td>
			<td>3452</td>
			<td>Fungicide used for trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pollen granules</td>
			<td>Bee rescued</td>
			<td>B004D5650C</td>
			<td>3X 16oz bottles, pollen for trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains for inoculation</td>
			<td>Currie Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains for inoculation</td>
			<td>Hittinger lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pairs</td>
			<td>UW Biotech Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Isolation Kit</td>
			<td>Mo Bio</td>
			<td>12830-50</td>
			<td>Commercial DNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>DNA quantification tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Master Mix for CFX</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4472952</td>
			<td>Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td>Instrument used for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Clean-Up Kit,</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10159-696</td>
			<td>Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 1000 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>Used for sizing and analysis of DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Used for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health

Yetiştiriciler kez çiçeklenme sırasında bitkileri mantar ilacı artıkları arılara sunar hastalığa karşı korumak için mantar ilacı spreyler kullanın. Ne kadar "arı için güvenli" olarak, mantar ilacı kalıntılarında polen arı düşüşler (için bal ve bumble bee tür) ile ilişkili montaj kanıtlar var. Mekanizmaları nispeten bilinmeyen kalırken, araştırmacılar arı-mikrop symbioses katılan spekülasyonlar var. Mikroplar koruma ve/veya işleme polen, larva arılar için beslenme olarak hizmet veren çok önemli bir rol oynamaktadır. Mikrobiyal topluluk değiştirerek, bu mantar ilaçları bu mikrop aracılık hizmetlerini kesintiye uğratamaz ve böylece arı sağlık uzlaşma için muhtemeldir. Bu el yazması hangi-ebilmek var olmak mucip mantar ilaçları koloni düşüş dolaylı mechanism(s) araştırmak için kullanılan iletişim kurallarını açıklar. Kafes deneyler için mantar ilacı tedavi çiçekler arılar açığa zaten mantar ilaçları bir yerel bumble bee (Bombus Impatiens) derin koloni kayıplara neden ilk kanıt sağladı. Mantar ilaçları alan ilgili dozlarda kullanılarak, bir dizi deney geliştirilmiştir daha ince bir mantar ilacı maruz polen mikrobiyal topluluk dinamiklerini sağlamak için. Mantar ve bakteri buluntu polen microbiome içinde yapısal bileşimi nöbetleşe yeni nesil sıralama ve metagenomic analiz tarafından incelenmiştir. Burada geliştirilen deneyler mantar ilaçları polen-hükümler microbiome etkilemesi mekanik bir anlayış sağlamak için tasarlanmıştır. Sonuçta, bu bulgular dolaylı yolu üzerinden koloni düşüşler mantar ilaçları neden olabilecek ışık.

Saha kafes çalışması:
Kafes deneylerden elde edilen veriler bumble arı kolonileri mantar ilacı maruz kalma önemli bir tepki olduğunu göstermiştir. Mantar ilacı tedavi kovanlarını kontrol kovanları daha önemli ölçüde daha az işçi (12,2 ± 3,8, ortalama ± SE) üretilen (43,2 ± 11,2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (şekil 4). Ayrıca, arı biyokütle manta...

Watch this Scientific Journal Video about Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health at JoVE.com

Ampirik, Metagenomik ve Hesaplamalı Teknikler, Mantar İlaçlarının Arı Sağlığına Zarar Verdiği Mekanizmaları Aydınlatıyor | Çevre | Video

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Bumble arı kovanlarını içinde mikrobiyal konsorsiyumlar zenginleştirmek ve polen arı larvaları için korumak. Laboratuvar ve deneyler, alan bazlı ile birlikte sonraki nesil sıralama kullanarak bu el yazması mantar ilacı artıkları polen microbiome ve koloni demografi, sonuçta koloni için önde gelen alter varsayımını sınamak için kullanılan iletişim kurallarını açıklar kaybı.

Ampirik, Metagenomic ve bilgisayar teknikleri mekanizma hangi mantar ilaçları uzlaşma arı sağlık ile aydınlatmak

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

empirical-metagenomic-computational-techniques-illuminate-mechanisms

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Environment

Ecology

Population and Community Ecology

SCIENTISTS IN ACTION

9.6K Görüntüleme.  USDA-ARS. Bumble arı kovanlarını içinde mikrobiyal konsorsiyumlar zenginleştirmek ve polen arı larvaları için korumak. Laboratuvar ve deneyler, alan bazlı ile birlikte sonraki nesil sıralama kullanarak bu el yazması mantar ilacı artıkları polen microbiome ve koloni demografi, sonuçta koloni için önde gelen alter varsayımını sınamak için kullanılan iletişim kurallarını açıklar kaybı.

Video: Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of natural proteins have a molecular mass between 40 - 200 kDa1,2, a robust and high-throughput method with a nanometer resolution capability is needed. Negative staining (NS) electron microscopy (EM) is an easy, rapid, and qualitative approach which has frequently been used in research laboratories to examine protein structure and protein-protein interactions. Unfortunately, conventional NS protocols often generate structural artifacts on proteins, especially with lipoproteins that usually form presenting rouleaux artifacts. By using images of lipoproteins from cryo-electron microscopy (cryo-EM) as a standard, the key parameters in NS specimen preparation conditions were recently screened and reported as the optimized NS protocol (OpNS), a modified conventional NS protocol 3 . Artifacts like rouleaux can be greatly limited by OpNS, additionally providing high contrast along with reasonably high&#8208;resolution (near 1 nm) images of small and asymmetric proteins. These high-resolution and high contrast images are even favorable for an individual protein (a single object, no average) 3D reconstruction, such as a 160 kDa antibody, through the method of electron tomography4,5. Moreover, OpNS can be a high&#8208;throughput tool to examine hundreds of samples of small proteins. For example, the previously published mechanism of 53 kDa cholesteryl ester transfer protein (CETP) involved the screening and imaging of hundreds of samples 6. Considering cryo-EM rarely successfully images proteins less than 200 kDa has yet to publish any study involving screening over one hundred sample conditions, it is fair to call OpNS a high-throughput method for studying small proteins. Hopefully the OpNS protocol presented here can be a useful tool to push the boundaries of EM and accelerate EM studies into small protein structure, dynamics and mechanisms.

More than half of proteins are small proteins (molecular mass &#60;200 kDa) that are challenging for both electron microscope imaging and three-dimensional reconstructions. Optimized negative staining is a robust and high-throughput protocol to obtain high contrast and relatively high resolution (~1 nm) images of small asymmetric proteins or complexes under different physiological conditions.

Optimize Negatif Boyama: Elektron Mikroskobu ile Küçük ve Asimetrik Protein Yapısı incelenmesi için Yüksek verim Protokolü

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Çevre

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges widely over sub-Saharan Africa and in parts of the Middle East. Cheetah conservationists face two major challenges, conflict with landowners over the killing of domestic livestock, and concern over range contraction. Understanding of the latter remains particularly poor2. Namibia is believed to support the largest number of cheetahs of any range country, around 30%, but estimates range from 2,9053 to 13,5204. The disparity is likely a result of the different techniques used in monitoring.
Current techniques, including invasive tagging with VHF or satellite/GPS collars, can be costly and unreliable. The footprint identification technique5 is a new tool accessible to both field scientists and also citizens with smartphones, who could potentially augment data collection. The footprint identification technique analyzes digital images of footprints captured according to a standardized protocol. Images are optimized and measured in data visualization software. Measurements of distances, angles, and areas of the footprint images are analyzed using a robust cross-validated pairwise discriminant analysis based on a customized model. The final output is in the form of a Ward's cluster dendrogram. A user-friendly graphic user interface (GUI) allows the user immediate access and clear interpretation of classification results.
The footprint identification technique algorithms are species specific because each species has a unique anatomy. The technique runs in a data visualization software, using its own scripting language (jsl) that can be customized for the footprint anatomy of any species. An initial classification algorithm is built from a training database of footprints from that species, collected from individuals of known identity. An algorithm derived from a cheetah of known identity is then able to classify free-ranging cheetahs of unknown identity. The footprint identification technique predicts individual cheetah identity with an accuracy of &gt;90%.

The cheetah (Acinonyx jubatus) is an iconic, endangered species, but conservation efforts are challenged by habitat shrinkage and conflict with commercial farmers. The footprint identification technique, a robust, accurate and cost-effective image classification system, is a new approach to monitoring cheetahs.

Onların Footprints&#39;e tarafından belirlenmesi Bireyler: Çitalar Spotting

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

Koloni Düzeyde Bireysel olan Bal Arısı Kalkınma Çevre Kimyasalların Etkisinin Değerlendirilmesi

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

Nanopore DNA sıralama Metagenomic toprak analizleri için

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB ve bitki fenotipleme ve fizyolojik araştırma için spektral kök görüntüleme: deneysel kurulum ve iletişim kuralları görüntüleme

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye anatomy of insects. These include traditional histological techniques optimized for work on ant eyes and adapted to work in concert with other techniques such as transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). These techniques, although vastly useful, can be difficult for the novice microscopist, so great emphasis has been placed in this article on troubleshooting and optimization for different specimens. We provide information on imaging techniques for the entire specimen (photo-microscopy and SEM) and discuss their advantages and disadvantages. We highlight the technique used in determining lens diameters for the entire eye and discuss new techniques for improvement. Lastly, we discuss techniques involved in preparing samples for LM and TEM, sectioning, staining, and imaging these samples. We discuss the hurdles that one might come across when preparing samples and how best to navigate around them.

This article outlines a suite of techniques in light and electron microscopy to study the internal and external eye anatomy of insects. These include several traditional techniques optimized for work on ant eyes, detailed troubleshooting, and suggestions for optimization for different specimens and regions of interest.

Karınca görsel sistem anatomisi soruşturma teknikleri

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis cylindrica (COCY) group. For this purpose, the model species C. explodens is used. Ants belonging to the minor worker caste possess distinctive hypertrophied mandibular glands (MGs). In territorial combat, they use the viscous contents of their enlarged mandibular gland reservoirs (MGRs) to kill rival arthropods in characteristic suicidal &#39;explosions&#39; by voluntary rupture of the gastral integument (autothysis). We show the dissection of worker ants of this species for the isolation of the gastral portion of the wax-like MGR contents as well as listing the necessary steps required for solvent-extraction of the therein contained volatile compounds with subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis and putative identification of metabolites contained in the extract. The dissection procedure is performed under cooled conditions and without the use of any dissection buffer solution to minimize the changes in the chemical composition of the MGR contents. After solvent-based extraction of volatile metabolites contained therein, the necessary steps for analyzing the samples via liquid-injection-GC-MS are presented. Lastly, data processing and putative metabolite identification with the use of the open-source software MetaboliteDetector is shown. With this approach, the profiling and identification of volatile metabolites in MGRs of ants belonging to the COCY group via GC-MS and the MetaboliteDetector software become possible.

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' Formicidae for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Minor workers of the ant species Colobopsis explodens are dissected to isolate the wax-like content stored in their hypertrophied mandibular gland reservoirs for subsequent solvent-extraction and analysis by gas chromatography-mass spectrometry. The&#160;annotation and identification of volatile constituents using the open-source software MetaboliteDetector is also described.

Yalıtım Borneo dan çene kemiğinde bezi rezervuar İçindekiler ' GC-MS ve MetaboliteDetector göre Volatilome analiz için karıncalar (karınca) patlayan

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ocean temperatures and ocean acidification, corals are increasingly under threat. To tackle these challenges, advances in cell and molecular biology have proven to be crucial for diagnosing the health of corals. Modifying some of the techniques commonly used in human medicine could greatly improve researchers&#39; ability to treat and save corals. To address this, a protocol for in situ hybridization used primarily in human medicine and evolutionary developmental biology has been adapted for use in adult corals under stress.
The purpose of this method is to visualize the spatial expression of an RNA probe in adult coral tissue that has been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This method focuses on removal of the paraffin and rehydration of the sample, pretreatment of the sample to ensure permeability of the sample, pre-hybridization incubation, hybridization of the RNA probe, and visualization of the RNA probe. This is a powerful method when using non-model organisms to discover where specific genes are expressed, and the protocol can be easily adapted for other non-model organisms. However, the method is limited in that it is primarily qualitative, because expression intensity can vary depending on the amount of time used during the visualization step and the concentration of the probe. Furthermore, patience is required, as this protocol can take up to 5 days (and in many cases, longer) depending on the probe being used. Finally, non-specific background staining is common, but this limitation can be overcome.

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

The goal of this protocol is to perform in situ hybridization on adult coral samples that have been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This is a qualitative method used to visualize the spatial expression of an RNA anti-sense probe in paraffin-embedded tissues.

Situ Parafin gömülü yetişkin mercan örnekleri için hibridizasyon teknikleri

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on fish populations. Adverse effects monitoring, utilizing biomarkers from the organismal to the molecular level, can be used to assess the cumulative effects on fishes and other organisms. Fish health has been used worldwide as an indicator of aquatic ecosystem health. The necropsy-based fish health assessment provides data on visible abnormalities and lesions, parasites, condition and organosomatic indices. These can be compared by site, season and sex, as well as temporally, to document change over time. Severity ratings can be assigned to various observations to calculate a fish health index for more quantitative assessment. A drawback of the necropsy-based assessment is that it is based on visual observations and condition factors, which are not as sensitive as tissue and subcellular biomarkers for sublethal effects. Additionally, it is rarely possible to identify causes or risk factors associated with observed abnormalities. So, for instance a raised lesion or "tumor" on the fins, lips or body surface may be a neoplasm. However, it could also be a response to a parasite, chronic inflammation or hyperplasia of normal cells in response to an irritant. Conversely, neoplasms, certain parasites, other infectious agents and many tissue changes are not visible and so may be underestimated. However, during the necropsy-based assessment, blood (plasma), tissues for histopathology (microscopic pathology), genomics and other molecular analyses, and otoliths for aging can be collected. These downstream analyses, together with geospatial analyses, habitat assessments, water quality and contaminant analyses can all be important in comprehensive ecosystem evaluations.

The health of wild fishes can be used as an indicator of aquatic ecosystem health. Necropsy-based fish health assessments provide documentation of visible lesions or abnormalities, data used to calculate condition indices as well as the opportunity to collect tissues for microscopic evaluation, gene expression and other more in-depth analyses.

Vahşi balık Nekropsi tabanlı sağlık değerlendirmesi

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on ...

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired glands that are located in the head of the bee are highly sensitive to the quantity and quality of pollen and pollen substitutes that the nurse bee consumes. The glands get smaller when nurses are fed deficient diets and are large when they are fed complete diets. Because nurse hypopharyngeal gland size is a robust indicator of nurse nutrition, it is essential that those studying honey bee nutrition know how to measure these glands. Here, we provide detailed methods for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal glands. We present comparisons of unstained and stained tissue and data that were used to study the impact of pollen on gland size. This method has been used to test how diet impacts hypopharyngeal gland size but has further use for understanding the role of these glands in hive health.

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Hypopharyngeal gland acinus size is a robust measure of nurse honey bee nutrition. Here, we provide a detailed protocol for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal gland acini.

Ölçüm Hypopharyngeal bezi Acinus boyutunda bal arı (Apis mellifera) işçi

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

Ampirik, Metagenomic ve bilgisayar teknikleri mekanizma hangi mantar ilaçları uzlaşma arı sağlık ile aydınlatmak

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST