We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF &amp; VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.

נהלים הקשורים בנושאי בעלי חיים בוצעו בהתאם בעלי החיים בבריטניה (הליכים מדעיים) Act 1986 בעלי החיים היו מתוחזקים בהתאם משרד הפנים פרסמו קוד עיסוק עבור השיכון, הטיפול של בעלי החיים Bred, מסופק או משומש למטרות מדעיות. הערה: ניסויים שבוצעו באמצעות עכברי-בר C57Bl / 6J מבוססים היטב ותיאר להלן. Metatarsals העוברי מן הזנים שונים עכבר יכול להיות מתורבת דומה במבחנה, אם כי שיעורי הצמיחה מינרליזציה שלהם עשויים להיות שונים לאלה מפורטים כאן. תנאי Dissection 1. הכנת מכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כל הכנת התקשורת, וניתוחי רקמות תרבות העבודה במנדף זרימה למינרית על מנת להבטיח את סטריליות של תקשורת יסודות עובריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תקשורת בתרבות לנתיחה כדי לאזן במשך לפחות שעה 1 באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר לנתיחהמספריים, דומון # 5 דומון # 4 פינצטה לצד זוג מספריים מיקרו איכותי מאוד Vannas (ישר 8 ס&quot;מ, 3 מ&quot;מ להבים) על ידי מעוקר. לאחר מעוקר, לטבול את הציוד לנתיחה באתנול 70% לפני השימוש. </li></ol> 2. הכנת Dissection ותרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל α-מינימום מדיה Essential (ללא נוקלאוזידים αMEM) ב בופר פוספט (PBS) (1:13) ו resuspend אלבומין בסרום שור (BSA) ב- 2 מ&quot;ג / מ &#39;l לפני מסנן עיקור באמצעות מזרק בקוטר 0.22 מיקרומטר, 33 מ&quot;מ לְסַנֵן. הערה: בינוני Dissection יכול להתבצע, מסנן מעוקרים מאוחסנים aliquots ב -20 ° C ללא הגבלת זמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> metatarsals העוברי תרבות 300 μl של מדיום התרבות (בכל טוב של צלחת תרבות 24 גם). הכן את המדיום התרבות ידי הוספת 0.2% w / v BSA; 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​L-ASCOפוספט וחומצה rbic; 1 מ&quot;מ β-glycerophosphate (βGP; אופציונלי - ראה סעיף תוצאות); 0.05 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​גנטמיצין ו 1.25 מיקרוגרם Amphotericin B כדי αMEM ולסנן לעקר דרך פילטר מזרק בקוטר 0.22 מיקרומטר, 33 מ&quot;מ. </li></ol></li></ol> 3. Murine עובריים המסרק Dissection ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לברור את העכבר בהריון, מחסה עוברים 15 יום בן, על ידי נקע בצוואר הרחם בהתאם להנחיות המשרד הביתי בבריטניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרקדן חיה ולחטא העור על ידי ריסוס עם אתנול 70%. מספריים לנתיחה באמצעות לעשות חתך גדול קו האמצע חודר הוא העור הצפק לחשוף את חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר שתי קרני הרחם של החיה באזור הגבי של חלל הגוף. הסר את קרן הרחם על ידי ראשית חלץ כל רחם מן mesometrium ידי חתכים זהירים עם מספריים לנתיחה ולבסוף חיתוך קרנות הרחם חינם בבסיסם. placדואר קרני הרחם לתוך מדיום לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרד בין העובר על ידי חיתוך בין אתרי השתלה לאורך קרן הרחם ולהסיר את העוברים מן הצ&#39;קים האישיים שלהם באמצעות מלקחיים. עובר דילול על ידי עריפת ראש בהתאם להנחיות משרד ביתי בבריטניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חיטוי של העור על ידי ריסוס עם 70 אתנול%, השתמש Vannas מספריים מיקרו להסיר את הגפיים האחוריות מן העוברים על ידי חריטה סביב הירך הפרוקסימלי. הדבר מבטיח כמה שיותר הגפיים האחוריים ככל האפשר מוסר. מניח את הגפיים האחוריים לתוך צלחת פטרי השקועה במדיום לנתיחה לפני לנתיחת כף רגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, מתחיל להסיר את העור שמסביב למרגלות העובריות, על ידי צובט ומושך אותו באמצעות # 5 פינצטה בעוד מחזיק את הגפיים האחוריים יציב באמצעות # 4 פינצטה. זו מבוצעת בצורה היעילה ביותר על ידי לתפוס את העור סביב הרמה של הטיביה מושך לכיוון הפלנגות. השימוש מספרי בשלב זה לחתוך אתמאוד דק העור אינו נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחזיק את tarsals של כף הרגל העוברית עם פינצטה # 4 ולהסיר את metatarsals הראשון והחמישי ידי צובט המגודר ליד tarsals באמצעות # 5 פינצטה וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם רגל שנערך באותה תנוחה, השתמש # 5 פינצטה לשבש את רקמות החיבור בין שלושת הפלנגות ו metatarsals הנותרים. הכנס את קצה פינצטה 5 # במפרק בין הפלנגות ו metatarsals להסיר את הפלנגות מן metatarsals. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, השתמש # 5 פינצטה לשבש את רקמות החיבור בין tarsals ו metatarsals. שוב הניח את קצה פינצטה 5 # במרחב המשותף בין tarsals ו metatarsals בעדינות לשחרר את metatarsals מן tarsals. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להרים את metatarsals בחינם עכשיו עם # 4 פינצטה מקום במדיום לנתיחה טרי. הערה: לנתיחה זהירות אמורה לספק 6 metatarsals מעובר אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשכל metatarsals נדרש כבר גזור, carefully מקום metatarsals בנפרד לתוך 24 גם צלחות מחומם מראש המכיל 300 μl של התקשורת והתרבות. Metatarsals התרבות ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור 5% לתקופה של עד 14 ימים. הערה: אין לשנות את התקשורת של תרבויות E15 לפחות עד יום 5 של תרבות שכן הדבר עלול לפגוע ביכולת מינרליזציה שלהם 26. הסיבות לכך אינן ברורות אך הצמיחה לינארית מינרליזציה מטריקס עלולה להיות תלויות גירוי על ידי גורמי גדילה שוחררו מן metatarsals. </li></ol> ניתוח מניפולציה 4. של תרבויות כף הרגל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום לנתיחה (יום 0) לבצע מדידות אורך ראשוניות באמצעות מיקרוסקופ עם תוכנת ניתוח מצלמה דיגיטלית מצ&quot;ב תמונה. מדוד את האורך של אזור מינרליזציה המרכזי כאשר הוא מופיע אחרי כמה ימים של תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעת לעת, כנדרש, לבצע מדידות נוספות (בדרך כלל כל 2 nd יום) עד היום האחרון של תרבות ובנקודה מעצמות etatarsal מעובדות תלוי תוצאות הנדרשות (דנו בהקדמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסף הבינוני של תרבויות איבר כף רגל עם גורמי אקסוגניים שונים כגון גורמי גדילה, הורמוני סוכנים תרופתיים מיום 0 תרבות 22,24. בכל המחקרים מסוג זה, לשלוט metatarsals המטופל נדרש. הערה: אם כי מומלץ כי ההעצמות המלאות הן גֶמֶד המקבילה מהרגל הנגדית, לא חלה שום הבדלים בצמיחה ליניארי או פוטנציאל מינרליזציה של nd התרבותי E15 2, 3 rd ו -4 metatarsals ה (ראו להלן, איור 2) . </li></ol>

<ol>
	<li>Farquharson, C., Staines, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeleton:+no+bones+about+it.">The skeleton: no bones about it.</a> J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).</li><li>Berendsen, A. D., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development.">Bone development.</a> Bone. 80, 14-18 (2015).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423, 332-336 (2003).</li><li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+development+and+extracellular+matrix+protein+genes+by+RUNX2.">Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2.</a> Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).</li><li>de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+the+pathways+of+cartilage+and+bone+formation.">Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).</li><li>Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. , (2005).</li><li>Farquharson, C., Jefferies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+and+longitudinal+bone+growth:+The+development+of+tibial+dyschondroplasia.">Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia.</a> Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).</li><li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions.">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495, 375-378 (2013).</li><li>Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+vesicles:+structure,+composition,+formation+and+function+in+calcification.">Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification.</a> Front. Biosci. 16, 2812 (2011).</li><li>Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+involvement+of+PHOSPHO1+in+matrix+vesicle-mediated+skeletal.">Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal.</a> J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).</li><li>Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+matrix+vesicles+in+skeletal+and+soft+tissue+mineralisation.">Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation.</a> Bone. 87, 147-158 (2016).</li><li>Brighton, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Growth+Plate.">Structure and Function of Growth Plate.</a> Clin. Orthop. , 22-32 (1978).</li><li>Shim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pubertal+growth+and+epiphyseal+fusion.">Pubertal growth and epiphyseal fusion.</a> Annals of pediatric endocrinology &amp; metabolism. 20, 8-12 (2015).</li><li>Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+to+bone+transitions+in+health+and+disease.">Cartilage to bone transitions in health and disease.</a> J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).</li><li>Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Chondrocyte+Performance+in+Growth-Plate+Cartilage+During+Longitudinal+Bone-Growth.">Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth.</a> Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).</li><li>Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Relationship+Between+The+Volume+Of+Hypertrophic+Chondrocytes+And+The+Rate+Of+Longitudinal+Bone-Growth+In+Growth+Plates.">Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates.</a> J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture.">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).</li><li>Thesingh, C. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchyme+in+embryonic+long+bones+as+early+deposition+site+for+osteoclast+progenitor+cells.">The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells.</a> Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).</li><li>Scheven, B. A., Hamilton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+bone+growth+in+vitro:+effects+of+insulin-like+growth+factor+I+and+growth+hormone.">Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone.</a> Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).</li><li>Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+IGF+regulation+of+longitudinal+bone+growth+in+rat+metatarsal+rudiments+cultured+in+serum-free+medium.">Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium.</a> Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).</li><li>Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+cartilage+and+bone+development.">Methods to study cartilage and bone development.</a> Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).</li><li>Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-I+augments+chondrocyte+hypertrophy+and+reverses+glucocorticoid-mediated+growth+retardation+in+fetal+mice+metatarsal+cultures.">Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures.</a> Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).</li><li>Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+plate+sparing+effects+of+the+selective+glucocorticoid+receptor+modulator,+AL-438.">The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).</li><li>MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+restricted+potential+for+recovery+of+growth+plate+chondrogenesis+and+longitudinal+bone+growth+following+exposure+to+pro-inflammatory+cytokines.">The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines.</a> J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).</li><li>Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch-up+growth+after+dexamethasone+withdrawal+occurs+in+cultured+postnatal+rat+metatarsal+bones.">Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones.</a> J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).</li><li>Haaijman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+terminal+chondrocyte+differentiation+by+bone+morphogenetic+protein+7+(OP-1)+in+vitro+depends+on+the+periarticular+region+but+is+independent+of+parathyroid+hormone-related+peptide.">Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide.</a> Bone. 25, 397-404 (1999).</li><li>Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OP-1+(BMP-7)+affects+mRNA+expression+of+type+1,+II,+X+collagen,+and+matrix+Gla+protein+in+ossifying+long+bones+in+vitro.">OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro.</a> J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).</li><li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEPE+is+a+novel+regulator+of+growth+plate+cartilage+mineralization.">MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization.</a> Bone. 51, 418-430 (2012).</li><li>Kaufman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of mouse development. , (1992).</li><li>Boskey, A. L., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture+Systems+for+Studies+of+Bone+and+Tooth+Mineralization.">Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization.</a> Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).</li><li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined.">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined.</a> Bone Miner. 12, 141-155 (1991).</li><li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+calcification+of+growth+plate+cartilage+as+a+result+of+compressive+force+in+vitro.">Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro.</a> Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).</li><li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+osteoclastic+bone-resorption+by+mechanical+stimulation+in+vitro.">Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro.</a> Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).</li><li>Dobie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+linear+bone+growth+by+GH+in+the+absence+of+SOCS2+is+independent+of+IGF-1.">Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1.</a> J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).</li><li>Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor+1+receptor+(IGF1R)+signaling+regulates+osterix+expression+and+cartilage+matrix+mineralization+during+endochondral+ossification.">Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification.</a> Bone. 83, 48-57 (2016).</li><li>Huesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+co-operativity+of+tissue-nonspecific+alkaline+phosphatase+(TNAP)+and+PHOSPHO1+during+initiation+of+skeletal+mineralization.">The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).</li><li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endochondral+Growth+Defect+and+Deployment+of+Transient+Chondrocyte+Behaviors+Underlie+Osteoarthritis+Onset+in+a+Natural+Murine+Model.">Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 68, 880-891 (2016).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fetal+mouse+metatarsal+bone+explant+as+a+model+of+angiogenesis.">The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis.</a> Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).</li><li>Libby, P., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C,+collagen,+and+cracks+in+the+plaque.">Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque.</a> Circulation. 105, 1396-1398 (2002).</li><li>Alvarez, J., Serra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+and+redundant+roles+of+Smad3+in+TGF-beta-mediated+regulation+of+long+bone+development+in+organ+culture.">Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture.</a> Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).</li><li>Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOCS2+is+the+critical+regulator+of+GH+action+in+murine+growth+plate+chondrogenesis.">SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

תרבות metatarsals בעכברים העוברי מספקת מודל פיסיולוגי ביותר של צמיחת endochondral מינרליזציה. מחקרים מוקדמים אימתו כי metatarsals עכבר E15 לעבור דפוס רגיל של צמיחה והבחנת שלד. הסחוס (chondrocytes) ועצמות (אוסטאובלסטים ו osteoclasts) תאים ומטריצות collagenous שלהם הם נבדלים מאלו שנצפו vivo. עם זאת, ישנן מספר מגבלות מוכרות של דגם זה. המהירות של בידול osteoclast נפגעת כמו גם צמיחת עצם (אבל לא סחוס בידול). צמיחת עצם היא כ 50% לאט יותר מאשר לזה שנצפה vivo ועלולה להיות כתוצאה מליקויי גורמים מערכתיים המשפיעים על הייצור של גורמים מקומיים (למשל, IGF-1, BMPs, וכו &#39;) 31. כמו כן, הוא מוכר היטב כי העצם רגיש לסביבה המכאנית שלה וזה גם המקרה עבור metatarsals התרבותי, אשר מגיב גhanges ב 32,33 העמסה מכנית. לכן, במצבים טעונים, כמתואר בפרוטוקול זה, מינרליזציה ספיגת מינרלים עלולים להיות בסכנה. עם זאת, מודל כף הרגל מציע את היכולת למדוד ישירות צמיחת עצם ליניארי הדבר שאינו אפשרי באמצעות 2D and 3D במערכות תרבות במבחנה. סיפקנו תיאור מקיף של פרוטוקול מעורב לנתיחה והתרבות של metatarsals murine E15 ואכן, בפעם הראשונה, לאשר את תוקפו של איגום 2 nd, 3 rd ו 4 th metatarsals לניסויים. Metatarsals מ E17 / E18 משמש בדרך כלל כדי לחקור את המנגנונים של צמיחת עצם בשל הפוטנציאל יוצא הדופן שלהם לגדול vivo לשעבר לתקופות זמן ארוכות (כלומר מעבר 14 ימים בתרבות). הם מודל ומבוסס לחקור את התפקידים של גורמי גדילה על צמיחת עצם אורך עוברית.בנוסף, לנתיחה וההתרבות של metatarsals לאחר הלידה היא מועסק בדרך כלל כדי להתוות את המנגנונים סביב צמיחת עצם לאחר לידה כפי שהיא מובנת כי צמיחת עצם לאחר לידה וצמיחת עצם עוברית מוסדרות באופן שונה 21. צמיחת העצם שנצפתה metatarsals לאחר הלידה התרבותי היא אולם פחות משמעותי מזו שנצפתה יסודות עובריים 25,34, הגבלת הפוטנציאל שלהם במחקרים לטווח ארוכים הדגשת ההשפעה מערכתית יותר על צמיחת עצם בשלב לאחר לידה זה. ואכן, 3 metatarsals לאחר הלידה יממה מעכברים הם בדרך כלל השלב האחרון, שניתן להשתמש בהם כדי להשיג 34 הצמיחה למדידה. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו הבידוד של עצמות כף רגל עובריות E15. העדר מינרלי hydroxyapaptite בעצמות כף רגל E15 אומר שהם מספקים מודל תחרות לחקור לא רק את המנגנונים סביב צמיחת עצם אורכת, אלא גם הייזוםשל מינרליזציה השלד. המטריצה mineralized של אזור הכונדרוציטים היפרטרופית מסוף מספק פיגום לפלישה אוסטאובלסטים להניח את עצם ספציפי מטריקס (דמוי עצם) המהווה מכן mineralized, וכפי מינרליזציה כגון הראשוני הזה הוא חיוני היווצרות העצם מוצלח ופונקציונלי 35. ואכן מספר הדיווחים האחרונים ניצול metatarsals E15 אשר היכולת הייחודית שלהם לחקירה של 28,36,37 תהליך מינרליזציה. בנוסף, חוקרים תארו את שימוש metatarsals E15 כמודל של אנגיוגנזה 38, המדגישים את הפוטנציאל של metatarsals העוברי כמודל מחוץ הגדרת צמיחת העצם / מינרליזציה. הפרוטוקול אנו מתארים דורש ציוד מעבדה רגיל בלבד כולל ברדס זרימה למינרית, מיקרוסקופ לנתח לביצוע הנתיחה, ו CO 2 באינקובטור לתרבות של יסודות ניכרים. יתר על כן, מבוי סתום מאוד בסיסיture בינוני המכיל αMEM, BSA, אנטיביוטיקה, antimycotics וחומצה L-אסקורבית (שיתוף גורם בסינתזה של hydroxyproline ו hydroxylysine, שתי חומצות האמינו החיוניות לייצור קולגן 39) ימנע את השימוש של תוספי מוגדר, כגון סרה חיה . באופן מסורתי, חוקרים הוסיפו βGP למדיה נהג metatarsals התרבות העוברי אבל כפי שמתגלה בתוצאות שלנו, שימוש מקור פוספט נוסף אינו נדרש עבור מינרליזציה מוצלח במערכת התרבות הזאת. זהו ממצא חשוב המרדף שלנו להבנת המנגנונים שבבסיס מינרליזציה ECM. Metatarsals בעבר נדבקו adenoviruses ובתוכה טופסי דומיננטי שלילי של Smad2 לחקור את התפקיד של הפיכת β גורם הגדילה בוויסות התפתחות העצם ארוך 40. כאן אנו חושפים גם את transfection המוצלח של עצמות כף רגל E15 wild-type עם חלקיקי נגיף ה- GFP, המציין tכובע טכניקות lentiviral שאפשר לאמץ בקלות לתמרן ביטוי גנים בתרבויות כף הרגל. באופן דומה, מערכת התרבות איבר כף הרגל היא מודל מצוין בו כדי להשוות את הצמיחה של העצמות מעכברים שינו גנטי כדי להבין טוב יותר את תפקידו של גן מסוים בתהליך צמיחת עצם. המחקרים הקודמים שלנו נצלו את מערכת התרבות איבר כף רגל כדי לקבוע את התפקיד של מדכא של ציטוקינים איתות-2 (SOCS2) ב צמיחת עצם endochondral. שימוש עצמות המסרק מעכברים שחסר לו SOCS2, הראינו הורמון גדילה כי הוא מסוגל לדמות עצמאית הצמיחה האורך שלהם של אינסולין כמו גורם גדילה (IGF-1), שלא כמו עצמות כף הרגל wild-type אשר אינם מגיבים לטיפול בהורמון גדילה 34, 41. זה מדגיש את המידה שבה תרבויות כף רגל ניתן להשפיע כדי לבחון את ההשפעות של גנים שונים ו / או גורמים חיצוניים על צמיחת עצם endochondral. לסיכום, יש לנו detaiהוביל שיטה להפקה והתרבות המוצלחת של עצמות כף רגל עובריות אשר ניתן מניפולציות ובדק באמצעות מגוון של ניתוחים. מודל vivo לשעבר זו שומר תאי תאים ואינטראקציות התא-מטריקס, וכן מכיל chondrocytes בשלבים שונים של chondrogenesis, ולכן מתן מודל פיסיולוגי יותר תאים בשכבה או תרבות 3D. תרבויות איבר כף הרגל ולכן מודל ייחודי לבדיקת המנגנונים המולקולריים האחראים התאבנות endochondral, והם חיוניים כדי לקדם את ההבנה שלנו של שני בפיזיולוגיה העצם והפתופיזיולוגיה

השלד הוא איבר מורכב, דינמי ומורכב מאוד כי יש מגוון של פונקציות הפורשות מן התנועה, הומאוסטזיס יון. מורכב העצם והסחוס, השלד מורכב של אוכלוסיות תאים מובחנות מבחינה תפקודית אשר פועלות כדי לשמור על זה מבני, ביוכימיים מכאני שלמות 1. אחד התפקידים העיקריים של השלד הוא התפקיד בהתפתחות וצמיחה שלה. תהליכים אלה דורשים התזמור של אוכלוסיות תאיות רבות אשר מוסדרות באמצעות האנדוקרינית דוקי בקרה גנטית. למעט עצם השכמה למשל עצמות שטוחות, הגולגולת ועצם החזה, השלד היונק נוצר באמצעות התהליך המכונה התאבנות endochondral. תהליך זה, מוסדר, הן מולקולרי מרחבית, מתחיל עם ההתעבות של תאי mesenchymal נגזרו בעיקר מן mesoderm 2. בהשפעה של SOX9 גורם שעתוק, תאי הדואר פנים של condensations להתמיין chondrocytes, להביע ומפריש מטריקס ספציפיים סחוס (ECM) רכיבים כגון קולגן סוג II ו- aggrecan. תאים בשולים של העיבוי, לבטא סוג אני קולגן ויוצר את perichondrium, המגדיר את העצם 3 הפוטנציאלי. מאוחר יותר, osteoprogenitors של perichondrium להתמיין אוסטאובלסטים, בבימויו של הביטוי של גורמי שעתוק, Runx2 ו osterix 4. זה מוביל דומיננטי של אוסטאובלסטים ושכבה זה שמם של קרום העצם המהווה צווארון גרמי mineralized סביב אמצע הקטע של העצם. חדירה של כלי דם של קרום העצם והפלישה של פיגום הסחוסים מתרחשת מביאה עימה, haematopoetically שמקורם בתאי resorbing עצם, osteoclasts, אשר נספגים שוב ומצע שרידי הכונדרוציטים והרבה מטריקס סחוסי 5. החללים נוצרו מאוישים ע&quot;י osteoprogenitors והוליד את ההתאבנות העיקריתמרכז אשר בהדרגה תופס את הליבה של diaphysis ומתמזג עם periosteum. תאים אחרים להצמיח במח העצם. בסביבות הלידה, כלי דם osteoprogenitors לחדור מטריקס עשיר סחוס משני צדי (epiphysis) של diaphysis פיתוח כדי ליצור את מרכז התאבנות משנית. ממוקם בין epiphysis ו diaphysis בשני קצותיו של העצמות הארוכות היא להקה של סחוס - צלחת צמיחת epiphyseal - האחראית על תיאום גידול ליניארי של כל העצמות הארוכות 6. Chondrocytes בתוך צלחת הצמיחה בתחילה להתרבות ובהמשך להתקדם דרך אזורים ברורים מורפולוגית, מתואמים על ידי ביטוי רציף של גורמי שעתוק וצמיחה. שיאו של רצף זה של אירועים הוא היציאה ממעגל התא היפרטרופיה של כונדרוציטים במרכז מבשר סחוס זה. chondrocytes Hypertrophic בתוקף להביע קולגן סוג X ו- מטלו מטריקס-13 (MMP13) והגדלת הנפח הניכרת שלהם בכיוון של צמיחה אורכת מספקים את התרומה הגדולה ביותר לצמיחת עצם ביונקי 7,8. יתר על כן, chondrocytes היפרטרופית mineralize ECM הסובבת אותם באמצעות שחרור של שלפוחית ​​מטריקס, מבנים מתוחם קרום מתמחה לייצור סידן פוספט אמורפי באמצעות הכללתם של phosphatases (רקמת הלא ספציפית phosphatase אלקליין (TNAP) ו PHOSPHO1) וחלבונים תקשור סידן (annexins ) 9-11. סחוס מסויד זה הוא פלש ידי כלי דם מהמח הבסיסי וכתוצאה מכך גיוס osteoclast ואת ספיגת מטריקס. זה ואחריו הגירה אוסטאובלסטים ויישור אל פני השטח של שרידי סחוס המסוידים שבו הם שכבו שכבה דמוית העצם שהוא mineralized במהירות. העצם הארוג של spongiosa העיקרי הוא ששופץ לעצם שבשבת של spongiosa משני 12. תוצאות היתוך epiphyseal בהפסקת התאבנות endochondral 13. התאבנות Endochondral נמצאת תחת רגולציה הדוקה על ידי הורמונים האנדוקרינית paracrine רבים גורמי גדילה כדי למנוע התפתחות מופרעת ו / או צמיחת עצם אורך 14. הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים ותאיים שבבסיס התהליכים האלה לכן חובה במרדף שלנו של התקדמות קלינית כלפי רווחת אדם. מחקרים קודמים המצביעים על הדמיון והשוני בין צלחות הצמיחה בגילאים שונים, במקומות ומינים שיפרו במידה רבה את הבנתנו של מנגנונים פיזיולוגיים שמסביב הדינמיקה צלחת צמיחה 15,16. עם זאת, המחקר של כונדרוציטים מבודדים קשה, כמו הסרת chondrocytes מסביבתם יכולה להוביל dedifferentiation, מלווה אובדן הביטוי של סמני מפתח כגון Col2a1 17. תרבות explant העכבר המסרק איבר, pioneered ידי פרופ &#39;אליזבת בורגר ועמיתיו בהולנד, הוא מודל פיסיולוגי לשעבר מאוד vivo ללימוד צמיחת התאבנות ועצמות endochondral כמו קצב הצמיחה של העצמות בתרבות לחקות כי ראה in vivo 18. באופן ייחודי, תרבות איבר כף הרגל מאפשרת בחינה של כונדרוציטים בשלבים שונים של chondrogenesis ושומרת תאי תאים ואינטראקציות תא-מטריצה, ולכן מתן תנאים קרובים למצב vivo ב מ תאים בתרבית 19-21. יתר על כן, מודל זה מאפשר לבדיקה ישירה של צמיחת עצם ליניארי אשר אינה אפשרית בתרבויות הכונדרוציטים עיקריות. זה גם מאפשר הפרדת גורמים מערכתיים ומקומיים ולכן מתיר הניתוח הפרטני של ההשפעות המקומיות על צלחת הצמיחה. תרבות metatarsals מאפשרת לחקירת פרמטרים רבים. מדידות יומיות של אורך הכולל ושל אזורי mineralized שלניתן לבצע את היסודות עם מיקרוסקופ לעומת שלב סטנדרטי תוכנת ניתוח תמונה. היסטולוגית, כלאה באתר והכתים immunohistological עשויה להתבצע בקלות על סעיפי כף רגל, מה שמאפשר את הרזולוציה המרחבית של שני הגופים האלה תאיים ומולקולריים, יתרון גדול על פני שיטות תרבית תאים מסורתיות. הגישה immunohistochemical כולל איתור וכימות של 5-bromo-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) ספיגת ידי מתרבים chondrocytes 22. בנוסף, עיבוד נוסף של רקמות כף רגל ניתן לבצע כדי לאפשר ניתוח במורד זרם של ביטוי mRNA (RT-qPCR), חלבון וניתוח איתות תאי (מערבי סופג) או רכב שומנים (ספקטרומטריית מסה). רוב המחקרים שפורסמו עד כה להשתמש metatarsals עובריים בתרבית ולא metatarsals מחיות שלאחר הלידה. בעוד שני הדגמים ניתן אינפורמטיבי, חקר עצמות עובריות יש מספר יתרונות: הם גדלים מהר יותר והוא יכול להיות exploited ללמוד בייזום התקדמות של 23-25 תהליך מינרליזציה. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את לנתיחה הסבוכה של metatarsals העוברי מן הגפיים האחוריים של יום עוברי 15 (E15) עובר Murine. יתר על כן, את הצמיחה ואת מינרליזציה של metatarsals מובחנת מבחינה אנטומית מוצג.

<table><tbody><tr><td>Dissection scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>Dumont #5 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>Dumont #4 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500339</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>SuperFine Vannas scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Dilute to 70% v/v in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM without nucleosides</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters (0.22 &amp;mu;m) 33 mm diameter</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0378</td><td>Add directly to the media prior to experimentation</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid-2-phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td>Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td>Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Nunc cell-culture treated 24-well plates</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

culture of murine embryonic metatarsals: a physiological model of endochondral ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

מטרת השיטה הזו הייתה לבודד metatarsals העוברי ותרבות אותם לבדיקה של צמיחת עצם אורך מינרליזציה ECM. שימוש בפרוטוקול שלנו כפי שיתואר בהמשך, עצמות מסרקות עובריות נותחו בהצלחה, כמו מדמיינים ידי מיקרוסקופ אור. מדידות של עצמות כף הרגל, שנערך כמצוין באיור 1, הראו את יכולתם לגדול אורך האורך mineralize ECM שלהם (איורים 2 ו -3). מינרליזציה של המטריצה ​​הוא ציין לראשונה באמצע שנות diaphysis של גֶמֶד העצם הוא ציין בקלות על ידי מיקרוסקופ אור. אין מכתים נדרש למרות ספיג של calcein עשויה להציע להדמיה משופרת של מינרלים שהוקמו זה עתה. מחקרים ניצול metatarsals עובריים עד כה 22,27,28 יש ניתחו את nd 2 גזור, 3 rd ו 4 ה (CENmetatarsals tral שלוש), בהנחה בצמיחה במבחנה מינרליזציה להיות דומה. בשנת vivo ההתפתחותי של metatarsals בעכברים, לעומת זאת, מגלה שהספרות יש 3 rd ו 4 th ראיות של מינרליזציה לפני כל metatarsals אחרים הפלנגות 29. הערכה של צמיחה ופוטנציאל מינרליזציה של בנפרד מבודדים תרבותי E15 2 nd, 3 rd ו -4 metatarsals ה עולה כי אין הבדלים משמעותיים במראה או היקף מינרליזציה לאחר 7 ימים של תרבות (איור 2). אין בדל הגידול האחוז מתחילת המחקר נמצא בתקופת התרבות. כמו הבדלים פוטנציאל מינרליזציה צוין הפרוטוקול הסטנדרטי של איגום 2 nd 3 rd ו 4 th metatarsals מופיע תקף למחקרים עתידיים. באופן מסורתי, החוקרים הוסיפו βGP למדיהנהג metatarsals עוברי התרבות לקדם מינרליזציה ECM. עם זאת, במחקרים תרבית תאים, הוכח כי אם האנזים TNAP מתווסף התקשורת osteogenic המכיל βGP, בתצהיר מינרליים hydroxyapatite אקטופי עדיין מתרחשת גם בהיעדר של תאים 30. כדי לבחון את ההשפעות של מצעי אגוניסטים מינרליזציה שונים על יכולת מינרליזציה מסרקת, אנו מתורבתים metatarsals E15 בתקשורת תרבות המכילות מגוון של תוספי מזון, ותמונות ומדידות אורך נרשמו יומי. התוצאות הצביעו על כך עצמות המסרק E15 עדיין לגדול mineralize ECM שלהם בהעדר βGP. E15 כף הרגל עצמות בתרבית חומצה אסקורבית רק בחומרי הראו עליות דומות באורך מינרליזציה כמו metatarsals בתרבית בנוכחות βGP (איור 3). הראינו גם כי lentivirus ניתן להשתמש כדי transfect DNA אקסוגני לתוך metata תרבותיrsals. כאן אנו transfected בהצלחה עצמות המסרק ביום 0 של תרבות (כלומר יום של דיסקציה) עם 2 x 10 6 חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) חלקיקי הנגיף לכל כף הרגל. כדי לאפשר התמרה וירוס, polybrene נוספה בו זמנית לתרבויות ב 1: 500. תרבויות נותרו 7 ימים, ללא שינויים התקשורת כנדרש עבור מינרליזציה המסרק E15 להתרחש, בטרם מודגרות עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) הכתם למשך 5 דקות ולאחר מכן דמיינו ישירות באמצעות מיקרוסקופ confocal ( איור 4). ההוכחה שלנו של ניסויי רעיון להראות התמרה יעילה בבירור. עם זאת יהיה זה נבון לבחון חלקים ברחבי מכלול של עצמות כף הרגל להעריך מניפולציה גן transfection ויעיל שלהם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> איור 1: מתודולוגיה סטנדרטית המשמש למדידת tהוא אורך ו מינרליזציה אזור של עובריים metatarsals. (א) מדידות סה&quot;כ אורך metatarsals E15 ביום 0 של התרבות (יום דיסקציה) נלקח דרך מרכז כף הרגל. מדידות (ב) אורך אורך הכולל של כף רגל לאחר שבעה ימים בתרבות. הערת העקמומיות הקלה כף הרגל. (ג) מדידת אורך אזור מינרליזציה לאחר שבעה ימים בתרבות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> איור 2: צמיחה וקיבולת מינרליזציה של אנטומית ברורה E15 metatarsals הדמיה ומדידה של 2, 3 ו -4 metatarsals מן הגפיים האחוריים של עכברי E15 w.כפי שבוצע. (א) תמונות סידוריות של 2, 3 ו -4 metatarsals לאורך תקופת התרבות. (ב) עליה באחוזי אורך מהיום 0 בכל יום של תרבות. (ג) אורך מינרליים של 2, 3 ו -4 metatarsals פני תקופת התרבות מבוטא באחוזים של אורך כף הרגל המוחלט. הנתונים מיוצגים כממוצע ± תקן שגיאה של הממוצע (SEM), (n = 6). (ד) C57Bl / 6J אורכי כף הרגל בכל יום של תרבות. הנתונים מיוצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 6). בר שחור = 1 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> איור 3: צמיחת מינרליזציה קיבולת של wild-typeמתורבתות E15 metatarsals ב מדיה שונים לסרטן העצמות. (א) תמונות סידורי של metatarsals בתרבית חומצה אסקורבית בלבד, 1 מ&quot;מ βGP, 3 מ&quot;מ phosphocholine, סידן כלורי 1.5 מ&quot;מ או 3 סידן כלורי מ&quot;מ המכיל התקשורת. (ב) עליה באחוזי אורך מהיום 0 של metatarsals מתורבת עם תוספות שונות. (C) מינרליים אורך metatarsals בתרבית תקשורת שונה מבוטא באחוזים של אורך כף הרגל המוחלט. נתונים מיוצגים כממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM), (n = 6). בר שחור = 1 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> איור 4: Transfection של E15 metatarsals עם וירוס ה- GFP Pמאמרים. (א) עצמות כף הרגל E15 היו transfected עם חלקיקי נגיף ה- GFP עבור הוכחה של מושג. עצמות (B) הוכתמו DAPI להדמיה DNA. (ג) תמונות Dual הצביעו transfection מוצלח של וירוס ה- GFP ברחבי מכלול של עצמות כף הרגל. ברים לבנים = 0.5 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification at JoVE.com

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

תרבות של Murine העוברי metatarsals: מודל פיסיולוגי של Endochondral התאבנות

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

culture-murine-embryonic-metatarsals-physiological-model-endochondral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.4K Views.  The University of Edinburgh. We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development. 

Video: Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy human bones makes particularly valuable the use of mammalian models, such as mouse and rat, to look into different aspects of bone growth and homeostasis. Additionally, the development of sophisticated genetic tools in mice allows more complex studies of long bone growth and asks for an expansion of techniques used to study bone growth. Here, we present a detailed protocol for ex vivo murine bone culture, which allows the study of bone and cartilage in a tightly controlled manner while recapitulating most of the in vivo process. The method described allows the culture of a range of bones, including tibia, femur, and metatarsal bones, but we have focused mainly on tibial culture here. Moreover, it can be used in combination with other techniques, such as time-lapse live imaging or drug treatment.

Here, we present a method for ex vivo culture of long murine bones at both fetal and newborn stages, suitable for analyzing bone and cartilage development and homeostasis in controlled conditions while recapitulating the in vivo process.

Culturing ומדידת עוברי והיילוד מורנה עצמות ארוכות

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

כריתה של ספרות עכבר למבוגרים והתחדשות: מודל פשוט כדי לחקור ממגי בלסטאמה היווצרות הIntramembranous פיקציה

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

דגם פגם עצם הירך קריטית בגודל פשוט בעכברים

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Medicine

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

מודל פולשנית לניתוח שבר Endochondral ריפוי בעכברים בתנאים מתוקננים ביו-מכני

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

הדור של שברי הירך סגור בעכברים: מודל ללמוד ריפוי עצם

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

מחקר פציעה מדויק של לוחית גדילה באמצעות עכברים פלואורסצנטיים תלת-שושלת

Tricolor Transgenic Murine Model for Studying Growth Plate Injury

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones are overloaded.&#160;Better treatments for severely fractured growth plates are needed because the response to injury is a bony bridge that prematurely fuses the growth plate, leading to stunted and/or crooked limbs. Murine models of growth plate injury are advantageous for mechanistic studies, but&#160;are challenging because it is difficult to visualize and precisely injure the small growth plates in young mice.&#160;We describe here an improved growth plate injury model using transgenic mice with tri-lineage fluorescent reporters for collagen types I, II, and X.
These mice show native fluorescence associated with the three primary substrata of the growth plate. A growth plate injury similar to a Salter-Harris Type II injury is created reproducibly with a bur using the hypertrophic section of the growth plate as a reference during live imaging under fluorescence stereo microscopy guidance. Frozen histology analysis of the native fluorescence simplifies assessing the cellular response to injury. This methodology represents a substantial leap in growth plate injury research, providing a detailed and reproducible method for investigating pathology and evaluating new therapeutic strategies.

מחבר Spotlight: Advanceancing Growth Plate Injury Model using Trilineage Fluorescent Reporters in Mice

This protocol describes an improved mouse model for adolescent bone growth plate injuries. Using transgenic mice with tri-lineage fluorescent reporters for collagen types I, II, and X, the primary matrices associated with three different substrata of the growth plate, injury placement is guided by native fluorescence under the microscope.

מודל מורין מהונדס טריקולור לחקר פגיעה בלוחיות גדילה

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones ...

Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age and overall health status of the patient, failures can occur, leading to delayed union or nonunion. Due to the increasing number of fractures resulting from high-energy trauma and aging, the development of innovative therapeutic strategies to improve bone repair based on the combination of skeletal/mesenchymal stem/stromal cells and biomimetic biomaterials is urgently needed. To this end, the use of reliable animal models is fundamental to better understanding the key cellular and molecular mechanisms that determine the healing outcomes. Of all the models, the mouse is the preferred research model because it offers a wide variety of transgenic strains and reagents for experimental analysis. However, the establishment of fractures in mice may be technically challenging due to their small size. Therefore, this article aims to demonstrate the procedures for the surgical establishment of a diaphyseal femur fracture in mice, which is stabilized with an intramedullary wire and resembles the most common bone repair process, through cartilaginous callus formation.

This protocol describes a surgical procedure for the establishment of a diaphyseal fracture in the femur of mice, which is stabilized with an intramedullary wire, for fracture healing studies.

ביסוס מודל שבר עצם הירך הדיאפיזי בעכברים

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age ...

תרבות של Murine העוברי metatarsals: מודל פיסיולוגי של Endochondral התאבנות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי Electroporation

Culturing ומדידת עוברי והיילוד מורנה עצמות ארוכות

כריתה של ספרות עכבר למבוגרים והתחדשות: מודל פשוט כדי לחקור ממגי בלסטאמה היווצרות הIntramembranous פיקציה

דגם פגם עצם הירך קריטית בגודל פשוט בעכברים

מודל פולשנית לניתוח שבר Endochondral ריפוי בעכברים בתנאים מתוקננים ביו-מכני

הדור של שברי הירך סגור בעכברים: מודל ללמוד ריפוי עצם

מודל מורין מהונדס טריקולור לחקר פגיעה בלוחיות גדילה

מודל מורין מהונדס טריקולור לחקר פגיעה בלוחיות גדילה

מודל מורין מהונדס טריקולור לחקר פגיעה בלוחיות גדילה

ביסוס מודל שבר עצם הירך הדיאפיזי בעכברים