אנו מודים ביותר ד&quot;ר בלינדה וילארד, פרוטאומיקה והמעבדה Metabolomics, מכון המחקר לרנר, קליבלנד קליניק, לביצוע ניתוח proteomics של ECM RCS. אנו מכירים את התמיכה הכספית של בריטניה המועצה למחקר theMedical, להעניק מספר K018043, כדי יק&quot;א.

הסרת 1. של תאים עם אמוניום הידרוקסיד פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תאים חסידים על ידי ציפוי על הצפיפות המתאימה. הערה: התאים יכולים להיות כל סוג תא חסיד שמייצר ECM מספיק לניתוח. כאן, אנו מתארים את השימוש של COS-7 תאים, קו דמוי תא פיברובלסטים כליה של קופים ירוקים אפריקאיים המכיל SV-40 רצפי DNA הנגיפי; RCS, קו תא כונדרוסרקומה חולדה; או פיברובלסטים עורי אדם נורמלי (HDF) זנים מן העורלה לנוער. HDF משמש מפסוק 1 למעבר 8 בלבד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים על coverslips עבור ההדמיה של תאי חיים ו ECM, ללימודי מיקרוסקופ פלואורסצנטי של ECM הקבוע, או עבור הכנת ECM תאים שמקורם עבור מבחנים תפקודיים בקנה מידה קטנה. פלייט התאים על צלחות תרבית תאים לניתוח SDS-PAGE, immunoblot, או מחקרים פרוטאומיקה. הערה: תנאי תרבית תאים (מספר התאים לצלחת ובינוניים תרבות) תהיה תלויה בסוג התא. מספר התאים לצלחת יצטרךתוקם באופן אמפירי עבור זן קו או תא תא מסוים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר זמן מתאים התאים להפקיד ECM, בדרך כלל&gt; 16 שעות. הערה: פרק הזמן יהיה תלוי בסוג התא יהיה צורך לקבוע באופן אמפירי. אם ניצוח ביטוי אקטופי, לאפשר זמן מתאים עבור הביטוי של החלבון טרנספקציה של ריבית להפקדה של ECM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במאמר קולט אדים, הכן 20 מ&quot;מ אמוניום הידרוקסיד בתוך כלי מתאים על ידי דילול פתרון המניות 1/14 עם דה מיונן H 2 O. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת התאים מן החממה בעדינות להסיר בינוני התרבות. להוסיף בופר פוספט (PBS) ללא Ca 2 + / Mg 2+ ידי שפיכת בעדינות כנגד קירות של המנה. רוק המנה פעם ולהסיר את הנוזל עם טפטפת העברת פלסטיק. חזור פעמיים נוספות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במאמר קולט אדים, להטות כל מנה ולהסיר את PBS משלב 1.2 עם טפטפת העברת פלסטיק. הוסף 3מ&quot;ל של אמוניום הידרוקסיד לכל צלחת 100 מ&quot;מ ו דגירה אותם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. במהלך תקופת הדגירה של 5 דקות, בעדינות להתסיס את התבשיל מידי דקות כדי להבטיח את תמוגה של כל התאים. שלבי 1.4-1.7 גם יבוצעו ב קולט אדים. הערה: ריאגנטים להסרת תאים חלופיים כוללים 2 M או 8 M אוריאה, אשר מודגרת עם תאים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמויות עצומות של H דה מיונן 2 O על כל מנה, לפחות 20 מ&quot;ל לכל צלחת 100 מ&quot;מ, עם נדנדה. השלך את אמוניום הידרוקסיד-solubilized חומר המורכב אמוניום הידרוקסיד, תאים lysed, ודה-מיונן H 2 O-ידי שאיפה עם טפטפת ההעברה. עבר פתרון פסולת זו לתוך מכל להעברת פסולת נוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את שכבת ECM מסיס H שופע דה מיונן 2 O ארבע פעמים נוספות על מנת להבטיח הסרה מלאה של כל החומר הידרוקסיד-solubilized אמוניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך בחינה של ECM על ידי immunofluorescence, לתקן את ECM על ידי הוספת 2%paraformaldehyde (PFA; 3 מ&quot;ל לכל צלחת 100 מ&quot;מ) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. זהירות: PFA מאוד מסוכנים במקרה של מגע עם העור או העיניים חשיפת יתר חמורה יכולה לייצר נזק ריאתי, חנק, חוסר הכרה, או מוות. זה צריך להיות מטופל רק קולט חולץ, וציוד מגן אישי צריך להיות משוחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל מדגם קבוע פעמים עם PBS, כמו בשלב 1.2, ולהיפטר פתרון PFA לתוך מיכל פסולת נוזלי מתאים. במידת הצורך, לאחסן דגימות ECM PBS ב 4 ° C לפני והכנתם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 2. הפקדת מעקב של חלבון ECM ידי Confocal מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים תחת hemocytometer. עבור תאים COS-7, צלחת 250,000 תאים על צלחת תרבית תאים 60 מ&quot;מ עבור transfection. הערה: עבור הדמיה תא חי, התאים חייב להיות transfected עם וקטור המקודד את החלבון ECM של עניין, התמזגו בתוך מסגרת עם לזרוח גנטית בקידודתג NT. זאת על מנת לאפשר זיהוי של חלבון ECM של הריבית במהלך דימות תאים חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן מתאים ביטוי חלבון (למשל, 16 שעות) להסיר את התאים מצלחת עם פתרון טריפסין-EDTA, לספור אותם hemocytometer, ואת הצלחת ~ 150,000 תאים על גבי gridded 35 מ&quot;מ, צלחת תחתית זכוכית הדמיה. לאפשר 2 h עבור התאים לצרף ולהתחיל בתצהיר ECM (פרק הזמן יהיה תלוי בסוג התא יש לקבוע באופן אמפירי). הערה: השתמשו במדיית תא שאינו מכיל פנול אדום, כמו זה יכול לתת גוון אדום עלול לפגוע באיכות התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתקופה 2 ח &#39;לעיל, להקים מיקרוסקופ confocal עם 37 מעלות צלזיוס בתא האינקובטור אספקה 2 CO. אפשר הטמפרטורה בתא ו בצלחת לייצב ל -37 מעלות צלזיוס לפני הדמיה; זה יכול להימשך עד 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים מצופים על צלחת 35 המ&quot;מ gridded עם סמן תא פלורסנט למשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאיםפעמיים במדיום תרבות אדום ללא פנול לפני הדמיה. הערה: בסמן פלורסנטי ציטופלסמית יכול לשמש כדי לחזות כרכי תא, או סמן מאגד-קרום יכול לשמש כדי לחזות קצות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטרת 20X ו לעומת שלב על מיקרוסקופ confocal, לזהות ריבוע רשת מתאים המכיל מספר (&gt; 3) של חסיד, תאים בריאים. אשר את הביטוי של חלבון המטרה של בחירה בתאים בתוך ריבוע הרשת שנבחר באמצעות מטרות 63X או 100X ואת אורכי הגל המתאימים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר קרינה ואת השלב בניגוד הזמן לשגות הדמיה באמצעות תוכנת Z- מחסנית. הגדר את המחסנית &quot;בגין&quot; להיות רק מתחת לשכבת ECM ואת המחסנית &quot;סיום&quot; כדי להיות בדיוק מעל גוף התא. הגדרת גודל z-צעד ל -0.3 מיקרומטר ואת נפח z כדי בין 5 ל -10 מיקרומטר עומק בסך הכל, תלוי בסוג התא. זה ייתן בין 15-30 z-סעיפים לכל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Capturקרינת דואר (עבור חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), עירור = 555 ננומטר ופליטה = 584 ננומטר) ותמונות שלב בניגוד מעת לעת על פני פרק זמן מוגדר. לדוגמה, להשתמש בתוכנת זמן לשגות כדי להגדיר את מרווח הזמן ב -2 דקות, ואת משך הזמן עד 2 שעות. בחר את כפתור &quot;התחל&quot; כדי להתחיל ללכוד תמונות של z-סעיף על פני תקופת זמן מוגדרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף תקופת הזמן, להסיר את התאים מן המנה, כמתואר בשלבי 1.1-1.5, כדי לאשר את הלוקליזציה של חלבון fluorescently- המתויג של עניין ECM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הדמיה שלב בניגוד לבין מטרת 20X להעביר את כיכר הרשת הרלוונטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Switch to המטרה 63X ולזהות את שכבת ECM תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שקלו את התמונה לתמונה מראש החילוץ </li></ol> 3. הכנת סטרילי של ECM נגזר-Cell עבור מבחני תא פונקציונליים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול אוכלוסייה אחת של תאים (להלן: &quot;היצרן מטריקס&quot; תאים) על coverslips ו popu אחראוכלוסייה (התאים &quot;הבדיקה&quot;) בתרבות תקן בצלחת תרבית תאים 100 מ&quot;מ עבור h 24 לפחות. הערה: אלה יכולים להיות כל שני סוגי תאים שונים חסידים, ואת מערך הניסוי יכול לכלול transfection של אחד או שתי אוכלוסיות תאים לבטא חלבון ECM fluorescently-tagged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף זרימה למינרית, כפי שמוצג על תרבית תאים, להכין פתרונות סטרילי של PBS ללא Ca 2 + / Mg 2+, אמוניום הידרוקסיד 20 מ&quot;מ (ראה שלב 1.3), ודה-מיונן H 2 O על ידי העברת כל דרך 0.2 סטרילי מסנן מיקרומטר לתוך מיכל סטרילי מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירת טכניקה סטרילית, לשטוף בעדינות את התאים &quot;מפיק מטריקס&quot; על coverslips שלוש פעמים עם PBS סטרילי (ראה שלב 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS על ידי שאיפה עם פיפטה סטרילית ועושה אותו במיכל פסולת נוזלית מתאים. הוסף 20 אמוניום הידרוקסיד סטרילי מ&quot;מ (3 מ&quot;ל / 100 מ&quot;מ צלחת) דגירה אותם במשך 5 דקות עם נדנדה במרווחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמויות עצומותשל סטרילי דה מיונן H 2 O כדי בצלחת &quot;המפיק מטריקס&quot;, לפחות 20 מ&quot;ל לכל 100 מ&quot;מ צלחת, עם נדנדה, ויוצקים משם lysate התא לתוך מיכל פסולת מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.5 ארבע פעמים נוספות על מנת להבטיח הסרה מלאה של החומר הידרוקסיד-solubilized אמוניום. הערה: ECM שהופקד על ידי התאים &quot;מפיק מטריקס&quot; על coverslips ולאחר מכן מספקת ECM סטרילי עבור מבחנים פונקציונליים עם כל תאי מבחן של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים מבחן מצלחת תא המניה עם 1.5 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין-EDTA לכל צלחת 100 מ&quot;מ (0.05% w / טריפסין נ ו 0.02% w / v EDTA תמיסת מלח מאוזן של האנק) עד שהתאים מבחן מנותקים מצלחת . הוסף בינוני תא, צנטריפוגות תאי המבחן ב 400 XG במשך 5 דקות, ולהסיר את נוזל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים מבחן מדיום חדש, סטרילי ולספור אותם hemocytometer. פלייט מספר מתאים של תאי בדיקה אלה על ECM סטרילי, מבודד על coverslips. תרבות אותם המדיום הסלולרי המתאים במשך 2-3 שעות, או לתקופת הזמן הנדרשת עבור תכנון הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון את הארגון של שלד התא אקטין, לתקן את התאים מבחן 2% PFA ו להכתים אותם עם isothiocyanate והעמסת (FITC) -phalloidin (עירור = 490 ננומטר ופליטה = 525 ננומטר) כדי לחזות F- אקטין ועם 4 &#39;, 6 -diamidino-2-phenylindole (DAPI; עירור = 358 ננומטר ופליטה = 461 ננומטר) כדי להמחיש את הגרעינים 11. הערה: השווה את המורפולוגיה וארגון יקטין בתאי הבדיקה מצופים על ECM Heterologous תאים שמקורם בתאי מבחן מצופים על ECM שלהם. </li></ol> בידוד 4. של ECM עבור SDS-PAGE, ניתוח immunoblot, או פרוטאומיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים חסידים של ריבית על מנות תרבית תאי 100 מ&quot;מימ (5 עד 10 מנות עבור חקר חלבונים או 1-2 מנות עבור immunoblotting) עבור 24-96 שעות, בהתאם לסוג התא, כדי לאפשר הפרשה בתצהיר של ECM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת התאים כמו described בצעדים 1.1-1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה כל צלחת בזווית לנקז שיורית H 2 O לתחתית של המנה, ובזהירות להסיר כל H 2 O הנותרים עם pipet P200 עד שההצלחה יבשה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, חיץ מדגם SDS-PAGE חום המכיל 100 מ&quot;מ dithiothreitol (DTT) עד 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות באמצעות גוש חום, ולאחר מכן להוסיף אותו לצלחת. 200 μL של חיץ מדגם לכל צלחת 100 מ&quot;מ מתאים דגימות להיבדק על ידי immunoblot. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח ECM על ידי ספקטרומטריית מסה, להשיג מדגם מרוכז יותר על ידי איסוף חיץ מדגם SDS-PAGE מצלחת (כמתואר בשלבים 4.5 ו -4.6, להלן), מחדש מחממת אותו עד 95 מעלות צלזיוס, ושימוש באותו aliquot פני 2-3 צלחות נוספות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מגרד תא לגרד את ECM ביסודיות את המנה, להבטיח כי בכל התחומים של המנה שהועתקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מגרד תא, לאסוף המדגם לצד אחד של המנה ולהסיר אותו עם 200קצה פיפטה μL לתוך צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר כל תמצית חיץ מדגם SDS-PAGE שיורית מהקצה מגרד תא לתוך הצינור כדי למזער את איבוד החומר ECM. עבור מדגם מרוכז, מחדש לחמם את aliquot חיץ מדגם זהה SDS-PAGE עד 95 ° C מחדש להשתמש בו על פני 2-3 צלחות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתור את החלבונים ECM על ידי SDS-PAGE 12, באף אחת 7% או 4-7% ג&#39;ל polyacrylamide שיפוע. הערה: זה נוח להשתמש סמנים חלבוניים מראש מוכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיל את הרזולוציה של חלבוני ECM גבוה מולקולרי משקל, להאריך את זמן ריצת ג&#39;ל כזה כי סמן המשקל מולקולרי 37 kDa פועל קרוב לתחתית הג&#39;ל וסמני משקל מולקולריים &lt;37 kDa יש להפעיל את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח proteomic של חלבוני ECM, להכתים את הג&#39;ל עם כתם חלבון ללכוד תמונה. חותכים רצועות של עניין מן הג&#39;ל, לעכל אותם עם טריפסין, ולנתח אותם על ידי לייזר desorption בסיוע מטריקס / יינון (MALDI) ספקטרומטריית -mass &lt;sup&gt; 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, עבור ניתוח מעמיק יותר של תמצית ECM ו- לנתח את המדגם, פורסים את השביל ג&#39;ל למקטעים, לעכל אותם עם טריפסין, ולבצע ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS) 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, עבור immunoblotting 15, להעביר חלבונים מן ג&#39;ל SDS-PAGE על פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום ב 15 V דקות לפחות 1 h 10 (חצי יבש) שיטה כדי להבטיח את העברת חלבונים ECM גבוהה מולקולרית משקל . דמיינו את החלבון הכולל הועבר הממברנה עם כתם Ponceau S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צעד 4.11, להשתמש נוגדנים להקים הנוכחות ו / או לעשות ניתוח וכמותיות של חלבוני ECM פרט 15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה עם 2% (w / v) חלב ב TBS-Tween 20 (חיץ חסימה) לילה ב 4 מעלות צלזיוס. מדולל נוגדנים ספציפיים חלבונים ECM בחסימת חיץ דגירה עם קרום עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר (נוגדן לבלףronectin בדילול 1/600 ו נוגדנים thrombospondin-1 בדילול 1/150; טבלה 1 משלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את איכות בידוד ECM ידי מחדש חיטוט אותו הכתם עם נוגדני חלבונים תאיים בשפע, כגון תקטין או טובולין (אנטי יקטין בדילול 1 / 10,000 ואנטי-טובולין בדילול 1 / 5,000). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease.">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).</li><li>Hynes, R. O., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+matrisome--an+inventory+of+extracellular+matrix+constituents+and+functions.">Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903 (2012).</li><li>Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+Collagen+from+Connective+Tissue+by+Neutral+Salt+Solutions.">Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).</li><li>Hellewell, A. L., Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insider+trading:+Extracellular+matrix+proteins+and+their+non-canonical+intracellular+roles.">Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles.</a> Bioessays. 38, 77-88 (2016).</li><li>Li, D., Yang, W., Li, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+native+collagen+from+limed+bovine+split+wastes+through+improved+pretreatment+methods.">Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).</li><li>Strawich, E., Nimni, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+a+collagen+molecule+containing+three+identical+components+extracted+from+bovine+articular+cartilage.">Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage.</a> Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).</li><li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+collagen+isolated+from+adipose+tissue.">Human collagen isolated from adipose tissue.</a> Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+extraction+methodology+for+cardiac+extracellular+matrix+prior+to+proteomics+analysis.">A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis.</a> Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).</li><li>Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation-dependent+alterations+is+glycoproteins+of+extracellular+matrix+of+human+fibroblasts.+Characterization+of+GP250+and+the+collagen-like+GP140.">Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140.</a> J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).</li><li>Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+rate+of+fibronectin+matrix+assembly+by+deletion+of+the+first+type+III+repeats.">Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats.</a> J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).</li><li>Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+retention+of+thrombospondin+1+is+controlled+by+its+conserved+C-terminal+region.">Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region.</a> J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Hillenkamp, F., Karas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+peptides+and+proteins+by+matrix-assisted+ultraviolet+laser+desorption/ionization.">Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization.</a> Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).</li><li>Davis, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+LC-LC-MS-MS+platform+using+binary+ion-exchange+and+gradient+reversed-phase+chromatography+for+improved+proteomic+analyses.">Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;Western+blotting&amp;#34;:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">&amp;#34;Western blotting&amp;#34;: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelastic+properties+of+lung+cell-derived+extracellular+matrix.">Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix.</a> Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).</li><li>Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+extracellular+matrix+patterning+of+thrombospondins+by+actin+dynamics+and+thrombospondin+oligomer+state.">Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state.</a> Biosci Rep. 35, (2015).</li><li>Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+thrombospondin+secretion+by+cells+in+culture.">Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture.</a> J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).</li><li>Myllyharju, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+developing+growth+plate.">Extracellular matrix and developing growth plate.</a> Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).</li><li>Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+and+changes+in+arthritis:+noncollagenous+proteins+and+proteoglycans+in+the+extracellular+matrix+of+cartilage.">Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage.</a> Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).</li><li>Naba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrisome:+in+silico+definition+and+in+vivo+characterization+by+proteomics+of+normal+and+tumor+extracellular+matrices.">The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices.</a> Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647 (2012).</li><li>Sanchez, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+heart+matrix:+A+critical+step+toward+whole+heart+grafts.">Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts.</a> Biomaterials. 61, 279-289 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול יש השיטה כמה שלבים קריטיים שיש אחריו על מנת להבטיח את הבידוד המוצלח וניתוח של ECM. לדוגמא, אמוניום הידרוקסיד משמש כדי להסיר את התאים לבודדים ECM לניתוח. למרות אמוניום הידרוקסיד יציב בתמיסות מימיות בחושך ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר, בקבוקי חייב להיות בחוזקה מחדש חתום בין כל שימוש. בגלל הגז עשוי להתאדות מהפתרון, ובכך להקטין את הריכוז, אנו ממליצים בחום החל בקבוק חדש כל 6-8 שבועות. בנוסף, הפתרון עובד צריך להיעשות טרי עבור כל ניסוי. כמו כן הוא חיוני כי התאים יוסרו לחלוטין עם שטיפות שופעות במי דה מיונן. אם צעדים אלה לא מבוצעים כראוי, חומר הסלולר עשוי להיותר על הצלחת ולזהם ניתוחים במורד זרם. אם התאים כבר גדל במשך 10 ימים או יותר, שטיפות מים נוספים ייתכן שיהיה צורך. חשוב nOTE ששכב ECM המבודד היא בדרך כלל רזה מאוד בהשוואה לתאים 11, כך טיפול נחוץ בעת זיהוי ECM במהלך הדמיה. לקבלת מיצוי יעיל של ECM המבודד למאגר מדגם SDS-PAGE, זה הכרחי כי חיץ המדגם מכיל סוכן צמצום. למען הסר היעיל ביותר של ECM, חיץ מדגם רותחים-חם יש להשתמש. בניסויים בהם דגימות ECM תיפתר על ידי אלקטרופורזה SDS-PAGE מכתים חלבון או פרוטאומיקה, היא קריטית כדי להשיג מדגם מרוכז על ידי גירוד כמה צלחות בשווי של ECM לאותו aliquot של חיץ מדגם. שינויים ופתרון בעיות ייצור הפרשת חלבוני ECM יכולים להשתנות באופן משמעותי בין סוגי תאים, כך תקופות זמן הפרשה בתצהיר של ECM צריכות להיקבע דה נובו עבור כל סוג תא. כמו כן, חשוב להיות מודע לכך רכב ECM ישתנה באופן משמעותי ביחס to תא צפיפות וזמן בתרבות 18. גורם זה יש לקחת בחשבון בעת ​​תכנון ניסויים. אין ספק כי הבחירה של סוג תא עבור שיטה זו היא חשובה, במיוחד כאשר שואבי ECM לניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה, אשר עשוי לדרוש כמות משמעותית של חלבון ECM הכולל. מגבלות של הטכניקה תאי מפרישי רמות נמוכות מאוד של חלבוני ECM יהיו מאתגרים יותר לשימוש בשיטה זו. תאים שאינם חסידים, תרביות תאי 3D, או מבחני פלישת תא אינם מתאימים כיום לבידוד ECM לפי שיטה זו. השיטה המתאימה ביותר לשימוש עם תקן &quot;2-ממדי&quot; בתרביות תאים. בגלל חילוץ אמוניום הידרוקסיד מסיר את התאים לחלוטין, ECM הקשורים הצדדים העליונים של תאים מופרשים, אבל הלא צולבים, חלבוני ECM יוסרו גם והותירו על צלחת שכבה דקה של ECM התאסף מלמטה מסביב לבסיסים של התאים 11,17 </sup&gt;. זה מורכב לכמת כמה ECM הוא שוחרר על ידי מיצוי אמוניום הידרוקסיד, כי החומר שוחרר גם כולל חלבוני ECM כי הם תאי גם לפני הפרשה או לאחר ספיגה מתא השטח. משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות היכולת לבצע מגוון רחב של ניסויים עם ECM המבודד חשובה בהקשר של ביולוגיה של תא ופיזיולוגית רקמות, והוא גם בעל השלכות על תחומי התחדשות רקמות והנדסת רקמות. יש שיטת יתרונות על פני ג&#39;ל נוצר collagens המטוהר או חלבוני ECM מטוהרים אחרים שתאים להרכיב מבני ECM מורכבים בגודל מולדתם, עם מנגנוני cross-linking יליד עם חלבוני ECM פרט נוכח היחסים מתאימים לסוג התא מוצא. לדוגמה, במחקר proteomic של RCS ECM הפגינו matrilins שופע COMP / TSP5, כצפויECM סחוסי 19,20 (איור 4). באופן כללי, הניתוח של ECM תא נגזרות נפגע מטבעה כמו רשת ענפה, רב-חלבון שגורמת crosslinking קוולנטיים ו insolubility של חלבוני ECM רבים, וגם על ידי האפשרות של זיהום ECM מחלץ עם חלבונים תאיים. הליך רב שלבים שנועד לבודד את החלק היחסי ECM מרקמות לניתוח proteomic ניב 8% של חלבוני ECM במערכה הכוללת של חלבונים מזוהים 21. עם זאת, פפטידים מחלבוני ECM היו 73% של פפטידים הכוללים מזוהים. שיטה זו לבידוד וניתוח של ECM תאים שמקורם במהירות ובאמינות מסיר חומר הסלולר תוך שמירת חלבוני ECM. שיטה זו יכולה לשמש עבור מגוון של סוגי תאים ויישומים במורד ומקל על הניתוח של ביולוגית ECM ואינטראקציות תא ECM תרבית תאים. הפרוטוקולים שלנו בפירוט כיצד ניתן ליישם השיטה בקני מידה שונה כדי לטפל במגוון רחב של expשאלות erimental בכל הנוגע לארגון ECM, דינמיקה, או רכב, ואת להשפעות התפקודיות של ECM מבודד על תאים. יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו במבט לעתיד, השיטה יכולה להיות מותאמת לשימוש עם תרביות תאי 3D; זה ירחיב רלוונטי פיסיולוגי אינו רב. יש decellularized יליד רקמות פוטנציאל גדול כמו פיגום להתחדשות של רקמות אובדן או נזק ו כחלופה ההשתלה, כגון אי ספיקת לב לאחר 22. יש לו את הפוטנציאל להתגבר על הבעיות של זמינות תורם immunorejection. יישומים עתידיים של השיטה המתוארת בדוח זה יכול לחקור את השימוש שלה עם תרביות תאים 3D או decellularization רקמות, אשר נוסף יגדיל את היקף גישה זו.

במהלך העשורים האחרונים, תאי מטריקס (ECM) הפך מוכר בסביבה מגוונת, דינאמית, ומורכב כי הוא מעורב מספר תהליכים בתא-פיזיולוגיים ופתולוגיים. ברמת הרקמה, ECM משפיעה תא איתות, תנועתיות, בידול, אנגיוגנזה, גזע ביולוגיה של תא, tumorigenesis, סיסטיק, וכו &#39;1,2. המחקר של ארגון ECM ותהליכים תלויי ECM ולכן יש השלכות רחבות על ביולוגיה של התא ופיזיולוגיה רקמות. כדי להגיע להסכם בנות מכניסטית של רכב ECM, ארגון תכונות פעילות, שיטות הבידוד המדויק של ECM נדרשות. בעוד זיהוי המוקדם של חלבוני ECM לסמוך עליו בידוד מרקמות 3, הכנת ECM מ תאים בתרבית עכשיו הפכה נפוצה יותר. הבידוד והניתוח של ECM תאים שמקורם הוא מסובך משתי סיבות עיקריות. ראשית, הנוכחות של תאים ואתחלבונים תאיים ir בשפע יכולים לעשות את זה קשה לבודד את ECM כמבנה תאי בדיד. ואכן, כמה חלבונים ECM יש תפקידים בתוך התא כמו גם ב ECM 4; ולכן, ההסרה היעילה של חלבונים תאיים מ ECM תאים שמקורם היא חיונית אם המחקר של חלבונים בתוך ECM הוא לא להתבלבל עם התפקידים שלהם בתוך התא. שנית, ECM תאים שמקורם מורכב חלבונים גדולים, oligomeric רבים, אשר לעתים קוולנטית צולב על הרכבת ECM ולכן הם מסיסי דטרגנטים סטנדרטיים. מאפיינים אלה יכולים לסבך חילוץ ואת הניתוח הנוסף של ECM. כדי לטפל בבעיות אלה, שיטה נדרשת המאפשרת הפרדה היעילה של חלבוני ECM מ מרכיבים תאיים. מספר שיטות תוארו בספרות עבור הבידוד של ECM מתרבה או תא או תמציות רקמה. רבי השיטות אלה מכוונים החילוץ של יחסי ציבור ECM בשפעotein, קולגן, מרקמות וכוללים את השימוש במלחים נייטרלי 3, בתנאים חומציים 5,6, או פפסין 7. בידוד של ECM הכולל מתמציות רקמות כרוך לעתים קרובות decellularization של הרקמה לפני הבידוד של ECM. לדוגמא, שיטת חילוץ רציפה תואר המבודדת ECM מרקמות לב אנושיות 8. ראשית, חלבונים ECM-המרופט חולצו עם 0.5 M NaCl לפני סולפט dodecyl נתרן (SDS) שימש כדי להסיר את התאים. לבסוף, חלבוני ECM שנותרו חולצו באמצעות 4 M guanidine 8. ECM ניתן solubilized גם מדגים decellularized באמצעות 8 אוריאה ז 9. טכניקות אחרות להשתמש בחומרי ניקוי, כגון חומצת deoxycholic 10, כדי לחלץ שני תאי ECM לפני פרידת חלבוני ECM מסיסים מן lysate התא המסיס על ידי צנטריפוגה. השיטה לבידוד וניתוח של ECM תאים שמקורם שתוארו בדו&quot;ח זה מספק reproשיטת ducible להסרת חומר התא, משאיר ECM תאים שמקורם כי ניתן לנתח על ידי ב immunofluorescence באתרו או חילוץ לאנליזה ביוכימית נוספת. שיטה זו ניתן להתאים לכל סוג תא חסיד וניתן לשנותם לפייסבוק נהלים במורד זרם, כגון immunoblotting או ספקטרומטריית מסה, או לניצול של ECM המבודד במחקרים פונקציונליים. השיטה יכולה לשמש גם בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal של תאים חיים לעקוב בתצהיר ECM של חלבון מתויג עניין בזמן אמת. זו מושגת באמצעות שימוש צלחת gridded, תחתית זכוכית. בסך הכל, הגישה מספקת בידוד מדויק של ECM תא הנגזרות וגם ההיקף לזהות ולנטר בתצהיר ודינמיקה של חלבוני ECM פרט.

<table><tbody><tr><td>Antibody to COL1A1</td><td>Novus</td><td>NB600-408</td><td>Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200</td></tr><tr><td>Antibody to fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F3648</td><td>Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 h. IF: 1/200</td></tr><tr><td>Antibody to thrombospondin 1</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>MA5-13398</td><td>Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 h</td></tr><tr><td>Antibody to RFP</td><td>Abcam</td><td>ab62341</td><td>Rabbit polyclonal. WB: 1/2,000 for 2 h</td></tr><tr><td>Antibody to &amp;beta;-actin</td><td>Sigma</td><td>A1978</td><td>Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10,000 for 1.5 h</td></tr><tr><td>Antibody to &amp;alpha;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5,000 for 1.5 h</td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>C2925</td><td>Fluorescent cell marker. Use at 1 &amp;micro;M for 30 min</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P-5282</td><td>Stock = 50 mg/mL in DMSO. 1/50 for 45 min</td></tr><tr><td>FITC-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>Sigma</td><td>F8771</td><td>IF: 1/50 for 1 h</td></tr><tr><td>FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG</td><td>SIgma</td><td>F7512</td><td>IF: 1/50 for 1 h</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-80010</td><td>WB: 1/50,000 for 1 h</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-80011</td><td>WB: 1/100,000 for 1 h</td></tr><tr><td>Vectorshield mounting medium with DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td>Store at 4 &amp;deg;C in the dark</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>Warm before use</td></tr><tr><td>Fibroblast growth medium</td><td>PromoCell</td><td>C-23010</td><td>Warm before use, supplement with 50 &amp;micro;g/mL ascorbic acid</td></tr><tr><td>Phenol red-free DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>21063-029</td><td>Warm before use</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Warm before use</td></tr><tr><td>Gridded glass-bottomed dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-C-GRID</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH, 28-30% solution</td><td>Sigma</td><td>221228</td><td>Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% solution</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td>Dilute to 2% (v/v) in PBS</td></tr><tr><td>Deoxycholic acid</td><td>Sigma</td><td>D2510</td><td>Use at 2% (v/v) final concentration</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Dilute to 0.5% (v/v) final concentration</td></tr><tr><td>GelCode Blue stain reagent</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>24590</td><td>Protein stain for SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Precision Plus protein standards</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td>Protein standards for SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell</td><td>Biorad</td><td>1703940</td><td>Efficient transfer of high molecular weight proteins</td></tr><tr><td>PVDF transfer membrane</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010</td><td>Immobilon-PSQ&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ponceau S stain</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td>Reversible protein stain for PVDF membrane</td></tr><tr><td>WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate</td><td>LI-COR</td><td>926-80200</td><td></td></tr><tr><td>High performance chemiluminescence film</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filtration unit, MILLEX-GV</td><td>Millipore</td><td>ML481051</td><td></td></tr><tr><td>SP8 AOBS confocal laser scanning microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>Environmental chamber needed for temperature and CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; control (Life Imaging Services)</td></tr><tr><td colspan="4">Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot</td></tr></tbody></table>

a rapid, scalable method for the isolation, functional study, and analysis of cell-derived extracellular matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

הפרוטוקול המתואר בצעדים 1.1-1.5 מעשים כדי להסיר תאים ולהשאיר מאחור את ECM תאים שמקורם. הפרוטוקול בוצע על COS-7 תאים שגודלו עבור 96 שעות על coverslips זכוכית, ואת ECM תאים שמקורם נותח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טיפול אמוניום הידרוקסיד הסיר את התאים ביעילות, כפי שנקבע על ידי האובדן של גרעין התא ואת cytoskeleton יקטין, על פי DAPI מכתים phalloidin, בהתאמה (איור 1). הפקת תאים עם 2 M אוריאה לא הייתה יעילה כמו אמוניום הידרוקסיד; עקבות של מכתים DAPI ו phalloidin אותרו לאחר הטיפול. הייתה 8 אוריאה ז השפעה דומה אמוניום הידרוקסיד (איור 1). לאחר מכן, ECM תאים שמקורם היה דמיין לפני ואחרי טיפול אמוניום הידרוקסיד (שלבי 2.1-2.11). COS-7 תאים היו transfected עם חלבון פלואורסצנטי אדום monomeric (mRFP) -tagged thrombospondin-1 trimer C- מסוף, (mRFPovTSP1C) 11 גדל על צלחת 35 מ&quot;מ עם בסיס זכוכית gridded. שעות שלאחר ציפוי, ריבוע רשת מתאים שהכילו מספר תאים בריאים להביע mRFPovTSP1C הייתה דמיינו תחת מיקרוסקופ confocal. תמונה בעלת ניגודיות שלב הפניה צולמה של אזור זה, ולאחר מכן הדמיה זמן לשגות הקרינה בוצעה כל 1 דקות עבור 2 שעות (איור 2 א). תאים הוסרו ולאחר מכן באמצעות אמוניום הידרוקסיד, ואותו ריבוע רשת על הצלחת הועבר תחת בניגוד שלב ולאחר מכן מחדש ונותח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התאים כבר לא היו נוכחים בכיכר הרשת, אבל mRFPovTSP1C נשאר בתוך ECM, זוהה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמו (איור 2 א) מאפיין puncta. כל mRFPovTSP1C שהופקד ECM לפני הסרת תאים זוהה על ידי השוואת טרום קרינת דפוס ופוסט הסרת תאים. ניאון puncta מזוהה בשתי התמונות (figuמחדש 2A, למשל מחודד) הם מוסקים להיות מזוהים עם ECM. טיפול אמוניום הידרוקסיד ששימש אז לבודד ECM הילידים מ תאים בתרבית, חסיד. פיברובלסטים עורי אדם (HDF) גדלו על coverslips זכוכית למשך 96 שעות. תאים הוסרו באמצעות אמוניום הידרוקסיד, ואת ECM היה נחקר עם נוגדן שאני אנטי-קולגן, אשר הפגינו מכתים סיבי מאפיין meshwork דפוס 16 (תרשים 2B). דפוסי פיברונקטין נבדקו סביב קבוע, תאי כונדרוסרקומה עכברוש הלא permeabilized (RCS) ובתוך ECM לאחר הסרת תאי RCS (איור 2 ג). בידוד אמוניום הידרוקסיד של ECM גם בוצע בתנאים סטריליים כך &quot;מבחן&quot; תאים יכולים להיות מחדש מצופים על ECM עבור פנוטיפי או מחקרים תפקודיים. לדוגמה, &quot;מבחן&quot; COS-7 תאים היו מצופה עבור 2 שעות על ECM סטרילי המיוצר על ידי תאי RCS, ו- Tתרנגולת הם תוקנו, permeabilized, ונותחו עבור הארגון F- אקטין ידי מכתים FITC-phalloidin, בהשוואה COS-7 תאים מייצרי ECM שלהם (צעדים 3.1-3.9) (איור 3). ב בקנה מידה גדול יותר, ננקטה שיטה זו לבודד ECM עבור הליכים ביוכימיים. לדוגמה, תאים RCS גדלו על תרבות מנות תא שני 100 מ&quot;מ במשך 7 ימים, ואת הנהלים בצעדים 4.1-4.7 היו במעקב. חלבוני ECM התא נגזר נאספו על ידי גירוד אותם במאגר מדגם SDS-PAGE חם הופרדו על ידי SDS-PAGE על ג&#39;ל polyacrylamide 7% מתחת הפחתת תנאים. הג&#39;ל היה מוכתם עבור חלבון, ואת ארבע הלהקות העיקריות בכל בודדו ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה (איור 4 א). מספר חלבונים ECM, לרבות פיברונקטין, thrombospondin 1 (TSP1), thrombospondin חלבון מטריקס oligomeric 5 / סחוס (TSP5 / COMP), ו matrilin-1 זוהו (איור 4 ב).<html> לחלופין, הכנות בקנה מידה קטנה יותר של ECM יכולות להיות מוערכות על ידי immunoblots. לדוגמה, ECM תאים שמקורם מתאי COS-7 ectopically להביע mRFPovTSP1C הופרד על ידי SDS-PAGE, הועבר קרום PVDF, ומישש עבור RFP עם נוגדן אנטי RFP (איור 4C). טכניקה זו היא רגישה מספיק כדי לזהות הבדלים בין בתצהיר trimer יליד TSP1 (mRFPovTSP1C) וכן Engineered pentamer האזור TSP1 C- מסוף (mRFP-TSP-5-1C) 17 (איור 4C). כדי לחקור את ECM אנדוגני של HDF, הנוכחות של חלבונים ספציפיים lysate תא או ECM המבודד נבדקת על ידי immunoblotting. את פיברונקטין חלבוני ECM מאפיין thrombospondin-1 אותרו ECM, ואילו החלבונים התאיים בשפע α-טובולין ו β-יקטין נעדר ECM המבודד (האיור 4D). EP-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig1.jpg" /> איור 1: השוואה בין שיטות של הסרת Cell. COS-7 התאים גדלו בצפיפות גבוהה למשך 96 שעות על coverslips, קבוע ב 2% PFA, ו permeabilized ב 0.5% טריטון X100, או טופלו כמצוין להסרת תאים. Coverslips אז הוכתמו FITC-phalloidin לדמיין F- אקטין ו DAPI לדמיין גרעינים. בר סולם = 25 מיקרומטר. נתון זה הוא שונה מן הפרסום מקורי ב- Journal of Science תא 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig2.jpg" /> איור 2: זיהוי של חלבוני ECM ב ECM המבודד. (א) שלב ניגודיות הקרינה תמונות שלCOS-7 תאים המבטאים mRFPovTSP1C גדל על צלחת 35 מ&quot;מ עם בסיס gridded, עם רצפת זכוכית עבור 2 שעות. תמונות מוצגות לפני ואחרי הסרת התאים על ידי אמוניום הידרוקסיד. הקצה של המכתב לרשת מותווה בתמונות שלב בניגוד עם קו מקווקו. חיצים לבנים מצביעים על דוגמאות של puncta ניאון שהיו קיימים לפני ואחרי הסרת תאים. (ב) איתור של קולגן אני ב ECM HDF ידי immunofluorescence העקיף. HDF גדלו במשך 96 שעות והוציאו עם אמוניום הידרוקסיד, ואת ECM הוכתם עבור I. קולגן סיבי האנושי ECM הוכתם גם עם נוגדנים משני FITC- מצומדות נגד ארנב לבד. (C) לוקליזציה של פיברונקטין סביב תאי RCS או בתוך ECM RCS המבודד, כפי שזוהה על ידי immunofluorescence העקיף. תאי RCS גדלו במשך 48 שעות, קבועים ב 2% PFA, ומוכתם עבור פיברונקטין ועם DAPI. במנות במקבילות, תאים הוסרו עם אמוניום הידרוקסיד 20 מ&quot;מ ואת ECM הוכתם עבור fibronectin ועם DAPI. תאים הוכתמו גם עם נוגדנים FITC- מצומדות אנטי עכבר IgG לבד. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig3.jpg" /> איור 3: שימוש סטרילי ECM ללימודים פונקציונליים. RCS &quot;המפיק מטריקס&quot; התאים גדלו במשך 48 שעות על coverslips זכוכית והתייחסו מכן עם 20 מ&quot;מ אמוניום הידרוקסיד בתנאים סטריליים כדי להסיר את התאים. COS-7 &quot;מבחן&quot; התאים היו מצופה על coverslips עם או בלי ECM RCS מבודד עבור 2 שעות, קבוע ב 2% PFA, permeabilized ב 0.5% טריטון X100, ומוכתמים FITC-phalloidin לדמיין F- אקטין ו DAPI לדמיין גרעינים . COS-7 תאים צופה על RCS ECM להפיץ באופן נרחב יותר ויצר חבילות microfilament גדולות (למשל מחודד) ו רוף הקצהles. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig4.jpg" /> איור 4: זיהוי של חלבונים מן ECM מבודד על ידי SDS-PAGE, ספקטרומטריית מסה, או Immunoblotting. (א) תאי RCS גדלו במשך 7 ימים והוציאו עם אמוניום הידרוקסיד 20 מ&quot;מ; הערך ECM היה מגורד למעלה למאגר מדגם SDS-PAGE חם המכיל 100 מ&quot;מ DTT. הכנת ECM הופרדה על ידי SDS-PAGE על ג&#39;ל polyacrylamide 7% מתחת הפחתת תנאים. ארבע להקות משמעותיות (חיצים 1-4) זוהו על ידי מכתים חלבון. (ב) חלבונים מלהקות ECM RCS 1-4 זוהו על ידי ספקטרומטריית מסה MALDI. (C) COS-7 תאים המבטאים גם mRFPovTSP1C (trimer) או mRFP-TSP-5-1C (pentamer) היו בתרבית למשך 48h והוציאו עם 20 אמוניום הידרוקסיד מ&quot;מ, ואת היה ECM מבודד למאגר מדגם SDS-PAGE חם המכיל 100 מ&quot;מ DTT. הכנת ECM הופרדה על ידי SDS-PAGE על ג&#39;ל polyacrylamide 7% בתנאי צמצום, הועברו קרום PVDF, ומששה עם נוגדן אנטי RFP. לוח זה שונה מן פרסום מקורי ב ביוסיינס דוחה 17. (ד) HDF גדלו במשך 96 שעות ולאחר מכן טופלו או עם 2% חומצה deoxycholic PBS (lysate התא) או עם אמוניום הידרוקסיד 20 מ&quot;מ כדי להסיר תאים. ה ECM היה משוך למאגר מדגם SDS-PAGE חם. שני שברים הופרדו על ידי SDS-PAGE על ג&#39;ל polyacrylamide 10% בתנאים צמצום, הועבר קרום PVDF, ומישש עם נוגדנים, כפי שצוין. בכל פנל, העמדות של סמני משקל מולקולריים מצוינות kDa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של fi זה</a>איור.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix at JoVE.com

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

a-rapid-scalable-method-for-isolation-functional-study-analysis-cell

Research

JoVE Journal

Biology

16.4K Views.  University of Bristol. The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies. 

Video: A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Bioengineering

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.
IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 &plusmn; 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 &#181;g/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 &#181;g/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

Vasodilation של כלי מבודד והבידוד של מטריקס של עכברים צמוד עור

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Immunology and Infection

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Invasion Assay Using 3D Matrices

The extracellular matrix (ECM) is a network of molecules that provide a structural framework for cells and tissues and helps facilitate intercellular communication. Three-dimensional cell culture techniques have been developed to more accurately model this extracellular environment for in vitro study. While many cell processes during migration through 3D matrices are similar to those required for movement across rigid 2D surfaces, including adherence, migration through ECM also requires cells to modulate and invade this polymeric-mesh of ECM. In this video, we will present the structure and function of ECM and the basic mechanisms of how cells migrate through it. Then, we will examine the protocol of an assay for tube formation by endothelial cells, whose steps can be generalized to other experiments based on 3D matrices. We will finish by exploring several other biological questions that can be addressed using ECM invasion assays.

Cell Invasion Assay Using 3D Matrices

פלישה אסייד באמצעות מטריצות 3D

The extracellular matrix (ECM) is a network of molecules that provide a structural framework for cells and tissues and helps facilitate intercellular ...

מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מערכת ג'ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

עור 2D and 3D שיפור