Biz RCS ECM proteomik analizi yürütmek için, Dr. Belinda Willard, Proteomik ve Metabolomik Laboratuvarı, Lerner Araştırma Enstitüsü, Cleveland Clinic en müteşekkiriz. Biz JKA&#39;li için, numara K018043 hibe, theMedical Araştırma Kurumu İngiltere&#39;de mali destek için minnettarım.

Amonyum hidroksit çözeltisi ile Hücreleri 1. Temizleme <ol><li> Uygun Yoğunluk Kaplama ile yapışmış Hücreler hazırlayın. NOT: Hücreler analiz için yeterli ECM üreten herhangi yapışık hücre türü olabilir. Burada, COS-7 hücreleri, SV-40 viral DNA dizilerini içeren bir Afrika yeşil maymunu böbrek fibroblast benzeri hücre hattı kullanımını tarif; RCS, bir sıçan kondrosarkom hücre hattı; ya da normal insan dermal fibroblast (HDF) çocuk sünnet derisi dan zorlamaktadır. HDF geçit 1 geçişin 8 sadece kullanılır. <ol><li> Sabit ECM&#39;nin floresan mikroskopi çalışmalarda için canlı hücre ECM, görüntüleme için lamelleri, hücreler plaka, ya da küçük çaplı, işlevsel tayinler için, hücre-türevli ECM&#39;nin hazırlanması için kullanılmasıdır. SDS-PAGE analizi, immunoblot veya proteomik çalışmaları için hücre kültür kaplarına, hücreler plaka. Not: Hücre kültür koşulları (plaka hücreleri ve kültür ortamı sayısı), hücre tipine bağlı olacaktır. plakasına hücre sayısı gerekecektirözel bir hücre hattına veya hücre suşu için empirik olarak tayin edilebilir. </li><li> Hücreler, genellikle&gt; 16 saat ECM yatırmak için uygun bir zaman tanıyın. NOT: süre hücre tipine bağlı olacak ve ampirik olarak tespit edilmesi gerekir. ektopik ifade yapılması halinde, ilgi konusu transfekte edilmiş proteinin ekspresyonu için ECM birikim için uygun olan bir zaman sağlar. </li></ol></li><li> Bir aspiratörün içinde, deiyonize H2O ile stok çözeltisinden 1/14 seyreltilerek Uygun bir kap içinde, 20 mM amonyum hidroksit Hazırlama <ol><li> inkübatör hücreleri kaldırın ve yavaşça kültür ortamı çıkarın. Hafifçe çanak duvarlarına karşı dökülerek Ca 2 + / Mg2 + içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. iki çanak Kaya ve plastik bir transfer pipet ile sıvı çıkarın. iki kez daha tekrarlayın. </li></ol></li><li> Bir aspiratörün olarak, her yemeğin eğin ve plastik bir transfer pipet ile adım 1.2 den PBS kaldırmak. 3 ekle100 mm tabak başına amonyum hidroksit ml ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe. 5 dakikalık kuluçka süresi boyunca, yavaşça tüm hücrelerin parçalama sağlamak için çanak her dakika çalkalayın. Adım 1.4-1.7 aspiratörün içinde gerçekleştirilecektir. Not: Alternatif hücre çıkarma reaktifler, 10 dakika için hücreler ile kuluçkalanmıştır 2M ya da 8 M üre içermektedir. </li><li> Sallanan, her tabak 100 mm tabak başına en az 20 mL deiyonize H2O bol miktarda ekleyin. Hidroksit çözündürülmüş malzeme olan amonyum hidroksit, lize edilmiş hücrelerden ve deiyonize edilmiş H2 oluşan bir transfer pipeti ile aspirasyon O-ile amonyuma şekilde atın. Sıvı atıklar için bir kap içine bu atık çözüm aktarın. </li><li> Tüm amonyum hidroksit çözülmüş malzemenin tam olarak çıkarılmasının sağlanması için bol deiyonize H2O dört kez daha çözünmeyen ECM tabakası yıkayın. </li><li> immünofloresan ECM incelenmesi için,% 2 ekleyerek ECM düzeltmekparaformaldehit (PFA, 100 mm tabak başına 3 mL), 10 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır. Dikkat: PFA cilt veya göz teması ve akciğer hasarı, boğulma, bilinç kaybı, ya da ölüm üretebilir şiddetli Aşırı maruz kalma durumunda çok tehlikelidir. Bu sadece bir aspiratörün ele alınmalıdır ve kişisel koruyucu donanımlar giyilmelidir. </li><li> Adım 1.2 gibi PBS ile iki kez her sabit bir örnek yıkayın ve uygun bir sıvı atık kabı içine PFA çözümün atmayın. Gerekirse, floresan mikroskobu için hazırlamadan önce, 4 ° C de PBS içinde ECM örnekleri saklayın. </li></ol> Canlı hücreler Konfokal Mikroskopi Görüntüleme tarafından ECM Protein 2. Takip Biriktirme <ol><li> Bir hemasitometre altında hücreleri saymak. COS-7 hücreleri için, transfeksiyon için bir 60 mm hücre kültür çanağı üzerine 250.000 hücre plaka. Not: canlı hücre görüntüleme için, hücreler genetik olarak kodlanmış floresan ile çerçeve içinde kaynaşık ilgi ECM proteini kodlayan bir vektör ile transfekte edilebilir olmalıdırnt etiketi. Bu canlı hücre görüntüleme sırasında ilgilenilen ECM protein tanımlanmasını sağlamaktır. </li><li> Görüntüleme için 35 mm Gridlenmiş, cam tabanlı tabak üzerine protein ekspresyonu (örneğin, 16 saat) uygun bir süre sonra, Tripsin-EDTA çözeltisi ile çanak hücreleri çıkarmak bir hemositometrede saymak ve plaka ~ 150,000 hücre. hücreler 2 saat yeniden bağlanması için izin verme ve ECM çökelmesini başlatmak için (süre hücre tipine bağlı olacak ve deneysel olarak tespit edilmelidir). NOT: Bu resim kalitesini etkiler kırmızı bir renk elde gibi, fenol kırmızısı içermeyen bir hücre ortamı kullanın. </li><li> Yukarıdaki 2 saatlik bir süre boyunca, 37 ° C inkübatör odası ve bir CO2 kaynağı olan konfokal mikroskop ayarlayın. odasında ve çanak sıcaklık görüntüleme önce 37 ° C stabilize etmek için izin ver; Bu 1 saat kadar sürebilir. </li><li> 30 dakika boyunca bir flüoresan hücre belirteci ile çanak Gridlenmiş 35 mm üzerine kaplama hücreleri inkübe edin. Ardından, hücreleri yıkayıniki görüntü vermeden önce fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamı içinde. NOT: sitoplazmik floresan markör, hücre hacimleri görselleştirmek için kullanılabilir, ya da bir zara içeren işaretçi hücre kenarları görselleştirmek için kullanılabilmektedir. </li><li> konfokal mikroskop 20X objektif ve faz kontrast kullanarak, bir numara (&gt; 3) yapışık, sağlıklı hücreleri içeren uygun bir ızgara kare tanımlar. 63X veya 100X hedefleri ve floresan mikroskobu altında uygun dalga boylarını kullanarak seçilen ızgara kare içinde hücrelerin seçiminde hedef proteinin ifadesini onaylayın. </li><li> z-yığın yazılımı kullanarak floresan ve faz-kontrast time-lapse görüntüleme ayarlayın. sadece hücre gövdesi üzerinde olması sadece ECM tabaka ve &quot;End&quot; yığının altında olması &quot;Begin&quot; yığınını ayarlayın. hücre tipine bağlı olarak, 0.3 um Z adımlı boyutu ve toplam 5 um bir ila 10 derinliğe z seviyesini ayarlayın. Bu zaman noktası başına 15-30 z bölümleri arasında verecektir. </li><li> Capturperiyodik bir dizi bir süre boyunca ve faz kontrast görüntüleri (kırmızı floresan proteini (RFP), uyarma = 555 nm ve emisyon = 584 nm için) e floresan. Örneğin, 2 dk zaman aralığı ve 2 saat süresini belirlemek için time-lapse yazılımı kullanın. belirlenen süre içinde z-bölüm görüntüleri yakalama başlamak için &quot;start&quot; düğmesine basın. </li><li> ECM daki floresan etiketli protein lokalizasyonu teyit etmek için, adım 1.1-1.5 tarif edildiği gibi bir süre sonunda, çanak hücreleri çıkarmak. </li><li> İlgili ızgara kare taşınmaya faz-kontrast görüntüleme ve 20X objektif kullanın. </li><li> 63X objektif geçin ve floresan mikroskobu altında ECM tabakası tespit. ön-ekstraksiyon görüntü bu görüntü karşılaştırın </li></ol> Hücre Fonksiyonel Tahliller için Hücre türetilen ECM 3. Steril hazırlanması <ol><li> lamelleri ve başka populasyona üzerindeki hücrelerin bir nüfusu ( &quot;matris yapımcı&quot; hücreleri) büyütünlasyon en az 24 saat süre ile 100 mm hücre kültür çanağı standart kültür ( &quot;test&quot; hücreleri) içerir. Not: Bu, herhangi iki farklı yapışık hücre tipi olabilir ve deney tasarımı floresan etiketli ECM proteini ifade etmek için, bir ya da her iki hücre popülasyonlarının transfeksiyonunu kapsayabilmektedir. </li><li> Bir laminar akış başlığı içinde, hücre kültürü için kullanıldığı haliyle, Ca2 + olmaksızın PBS steril çözeltiler hazırlanması steril 0.2 her geçen 2 O / Mg2 +, 20 mM amonyum hidroksit (adım 1.3), ve de-iyonize H uygun bir steril kap içine mikron filtre. </li><li> steril teknik bakımı, nazikçe steril PBS (adım 1.2) ile lamelleri üç kez &quot;matris yapımcı&quot; hücreleri yıkayın. </li><li> steril bir pipet ile aspirasyonu ile PBS kaldırmak ve uygun bir sıvı atık kabına onu atmayın. 20 mM steril amonyum hidroksit (3 mL / 100 mm tabak) ekleyin ve aralıklarla sallanan 5 dakika boyunca inkübe. </li><li> bol miktarda ekleyinSteril deiyonize H &quot;matris üretici&quot; çanak 2, O, en az 20 sallanan 100 mm tabak başına mi, ve uygun bir atık kabına hücre lizatının uzaklıkta dökün. </li><li> Adımı tekrar 3.5 dört kez daha amonyum hidroksit çözülmüş malzemenin tam olarak çıkarılmasının sağlanması için. NOT: lamelleri &quot;matris yapımcı&quot; hücreler tarafından yatırılan ECM ilgi herhangi bir test hücreleri ile fonksiyonel testleri için steril bir ECM sağlar. </li><li> 100 mm tabak başına tripsin-EDTA çözeltisi 1.5 mL hücre hazır yemek test hücreleri inkübe test hücreleri tabak ayrılır kadar (% 0.05 w / v tripsin ve% 0.02 w EDTA h / Hank dengeli tuz çözeltisi içinde) . Hücre orta ekle 5 dakika boyunca 400 xg&#39;de Test hücreleri santrifüj ve süpernatant sıvı kaldırmak. </li><li> Taze, steril bir ortamda test hücrelerinin yeniden süspanse edin ve bir hemositometrede say. coversli steril, izole ECM üzerine bu test hücrelerinin uygun sayıda Plateps. 2-3 saat için ya da deney tasarımı için gerekli bir süre için uygun hücre ortamı içinde kültür bunları. </li><li> , Aktin hücre iskeletinin organizasyonunu incelemek% 2 test hücreleri düzeltmek PFA ve floresein izotiyosiyanat ile leke (FITC) -phalloidin (uyarma = 490 nm ve emisyon = 525 nm) görselleştirmek için F-aktin ve 4 &#39;, 6 -diamidino-2-fenilindol (DAPI; uyarma = 358 nm ve emisyon = 461 nm) çekirdekleri 11 görselleştirmek için. NOT: Kendi GİP&#39;te kaplama testi hücreleri ile heterolog hücre kaynaklı GİP&#39;te kaplama testi hücreleri morfolojisi ve aktin organizasyonu karşılaştırın. </li></ol> SDS-PAGE, imüno-lekeleme analizi veya proteomik ECM&#39;nin 4. Yalıtım <ol><li> sekresyon ve ECM çökelmesini sağlamak için, hücre tipi için uygun bir şekilde, 24-96 saat boyunca 100 mm&#39;lik bir hücre kültür tabaklarında (proteomik için 5 ile 10 yemekleri ve bağışıklık boyama için 1-2 yemekler) üzerine çıkar yapışmış olan hücrelerin büyütün. </li><li> descr olarak hücreleri çıkarınadımda 1.1-1.5 anlatılagelmiştir. </li><li> Çanak alt bakiye H2O boşaltmak için bir açı her levha eğim ve plaka tamamen kuruyana kadar dikkatlice P200 pipet ile kalan H2O çıkarın. </li><li> Buna paralel olarak, ısı, SDS-PAGE numune tampon maddesi, bir ısıtma bloğu kullanarak 2 dakika boyunca 95 ° C&#39;de 100 mM ditiyotreitol (DTT) içeren ve daha sonra plaka ekleyin. Numuneler İmmunoblotta tarafından muayene edilmesi için 100 mm plaka başına numune tamponu 200 uL uygundur. <ol><li> kütle spektrometrisi ile ECM analiz etmek için, (aşağıdaki adımları 4,5 4,6, tarif edildiği gibi) çanak SDS-PAGE numune tampon toplayarak daha konsantre bir örnek elde, 95 ° C&#39;ye kadar yeniden ısıtma ve boyunca aynı kısım kullanılarak 2-3 ek plakalar. </li></ol></li><li> iyice yemeğin tüm alanları kazınmıstır sağlanması, çanak kapalı ECM kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın. </li><li> hücre kazıyıcı ile, yemeğin bir tarafına örnek toplamak ve 200 ile kaldırmaBir tüp içine uL pipet. </li><li> ECM madde kaybını en aza indirmek için bir tüp içine hücre kazıyıcı ucundan herhangi bir kalıntı, SDS-PAGE numune tampon maddesi özü aktarın. konsantre örnek için, 95 ° C&#39;ye kadar, aynı SDS-PAGE numune tampon maddesi kısım yeniden ısı ve 2-3 ilave plakalar arasında da yeniden kullanımı. </li><li> % 7 veya% 4-7 gradyan poliakrilamid jeller kullanarak SDS-PAGE 12 ile ECM proteinleri giderin. NOT: öncesi lekeli protein belirteçlerinin kullanmak daha uygun olur. </li><li> yüksek moleküler ağırlıklı ECM proteinlerinin çözünürlüğünü artırmak için, 37 kDa&#39;lık bir moleküler ağırlık markörü yakın jel ve moleküler ağırlık işaretçileri &lt;37 kDa alt çalışan jel kaçıp ki bu jel çalışma süresini uzatır. </li><li> ECM proteinleri proteomik analizi için, bir protein leke ile jel leke ve bir görüntü yakalamak. Jelden ilgi bant kesme tripsin ile sindirilmesi ve matris destekli lazer desorpsiyon ile analiz / iyonizasyon (MALDI) -Kitlesel spektrometrisi &lt;sup&gt; 13. </li><li> Seçenek olarak ise, ECM özü daha kapsamlı bir analizi için ve tüm numune analiz için bölümlere jel şerit dilim, tripsin ile sindirilmesi ve sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) 14 gerçekleştirin. </li><li> Seçenek olarak ise, 15 immün için, yüksek moleküler ağırlıklı ECM proteinlerinin transferi sağlamak için en az 1 saat 10 dakika boyunca (yarı-kuru metodu) 15 V de poliviniliden florit (PVDF) membran üzerine SDS-PAGE jeli proteinleri aktarmak . Bir Ponceau S boyası ile membrana aktarılır total protein gözünüzde canlandırın. </li><li> Adım 4.11 takiben, varlığı kurmak ve / veya bireysel ECM proteinleri 15 bir yarı-kantitatif analiz yapmak antikorlar kullanır. <ol><li> gece boyunca 4 ° C&#39;de% 2 TBS-Tween 20 (blokaj tampon çözeltisi) içinde (ağırlık / hacim) süt ile membran bloke. bloke edici tampon içinde ECM proteinleri için spesifik antikorlar seyreltin ve fib (oda sıcaklığında 1.5 st için membran ile antikorun inküberonectin trombospondin-1 1/150 seyreltilmiş için 1/600 ve antikorun seyreltildi; Ek Tablo 1). </li><li> Böyle aktin veya tubulin (anti-aktin 1 / 10.000 seyreltilmiş ve anti-tübülin 1 / 5.000 seyreltilmiş) gibi bol hücre içi proteinlerine karşı antikorların aynı blot yeniden sondalama ile ECM izolasyon kalitesini test. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease.">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).</li><li>Hynes, R. O., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+matrisome--an+inventory+of+extracellular+matrix+constituents+and+functions.">Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903 (2012).</li><li>Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+Collagen+from+Connective+Tissue+by+Neutral+Salt+Solutions.">Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).</li><li>Hellewell, A. L., Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insider+trading:+Extracellular+matrix+proteins+and+their+non-canonical+intracellular+roles.">Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles.</a> Bioessays. 38, 77-88 (2016).</li><li>Li, D., Yang, W., Li, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+native+collagen+from+limed+bovine+split+wastes+through+improved+pretreatment+methods.">Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).</li><li>Strawich, E., Nimni, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+a+collagen+molecule+containing+three+identical+components+extracted+from+bovine+articular+cartilage.">Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage.</a> Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).</li><li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+collagen+isolated+from+adipose+tissue.">Human collagen isolated from adipose tissue.</a> Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+extraction+methodology+for+cardiac+extracellular+matrix+prior+to+proteomics+analysis.">A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis.</a> Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).</li><li>Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation-dependent+alterations+is+glycoproteins+of+extracellular+matrix+of+human+fibroblasts.+Characterization+of+GP250+and+the+collagen-like+GP140.">Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140.</a> J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).</li><li>Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+rate+of+fibronectin+matrix+assembly+by+deletion+of+the+first+type+III+repeats.">Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats.</a> J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).</li><li>Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+retention+of+thrombospondin+1+is+controlled+by+its+conserved+C-terminal+region.">Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region.</a> J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Hillenkamp, F., Karas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+peptides+and+proteins+by+matrix-assisted+ultraviolet+laser+desorption/ionization.">Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization.</a> Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).</li><li>Davis, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+LC-LC-MS-MS+platform+using+binary+ion-exchange+and+gradient+reversed-phase+chromatography+for+improved+proteomic+analyses.">Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;Western+blotting&amp;#34;:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">&amp;#34;Western blotting&amp;#34;: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelastic+properties+of+lung+cell-derived+extracellular+matrix.">Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix.</a> Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).</li><li>Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+extracellular+matrix+patterning+of+thrombospondins+by+actin+dynamics+and+thrombospondin+oligomer+state.">Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state.</a> Biosci Rep. 35, (2015).</li><li>Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+thrombospondin+secretion+by+cells+in+culture.">Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture.</a> J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).</li><li>Myllyharju, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+developing+growth+plate.">Extracellular matrix and developing growth plate.</a> Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).</li><li>Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+and+changes+in+arthritis:+noncollagenous+proteins+and+proteoglycans+in+the+extracellular+matrix+of+cartilage.">Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage.</a> Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).</li><li>Naba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrisome:+in+silico+definition+and+in+vivo+characterization+by+proteomics+of+normal+and+tumor+extracellular+matrices.">The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices.</a> Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647 (2012).</li><li>Sanchez, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+heart+matrix:+A+critical+step+toward+whole+heart+grafts.">Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts.</a> Biomaterials. 61, 279-289 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar yöntem ECM başarılı izolasyon ve analiz sağlamak için takip edilmesi gereken bazı kritik adımlar vardır. Örneğin, amonyum hidroksit hücreleri çıkarmak için ve analiz için ECM izole etmek için kullanılır. amonyum hidroksit, karanlıkta, sulu çözeltiler içinde kararlı olan ve oda sıcaklığında muhafaza edilebilir olsa da, şişe sıkıca her kullanım arasında yeniden sızdırmaz hale getirilmelidir. Gaz ve böylece konsantrasyonunu azaltarak, çözümden buharlaşması olabilir, çünkü biz güçlü bir taze şişeyi her 6-8 haftada başlayan öneririz. Buna ek olarak, çalışma çözeltisi, her bir deney için taze yapılmış olmalıdır. Hücrelerin tam de-iyonize su içinde bol yıkar ile kaldırıldığını da esastır. Bu adımlar yeterince yerine getirilmemesi halinde, hücresel materyal çanak kalır ve alt analizler kirletebilir. Hücreler 10 gün ya da daha uzun süre için yetiştirildiği takdirde, ilave su yıkama gerekli olabilir. Bu n önemlidirgörüntüleme sırasında ECM belirlerken dikkat gerekir, böylece izole ECM tabakası, tipik olarak hücrelere 11 ile karşılaştırıldığında çok ince ote. SDS-PAGE numune tampon maddesi izole edilmiş ECM etkin ekstre için, numune tamponu bir indirgeme ajanı içerir esastır. ECM en etkili kaldırılması için, kaynar örnek tamponu kullanılmalıdır. ECM örnekleri protein lekeleme veya proteomik için SDS-PAGE elektroforezi ile çözülecektir olan deneyler için, örnek tamponu, aynı kısım halinde ECM&#39;nin birkaç tabak değerinde kazıyarak konsantre örneği elde etmek için kritiktir. Değişiklikler ve Sorun Giderme ECM proteinlerinin üretimi ve salgılanması hücre tipleri arasında önemli ölçüde değişebilir, bu nedenle ECM sekresyon ve birikimi için zaman periyodu, her hücre türü için de novo belirlenmelidir. ECM kompozisyon ilişkisi t dinamik değişecek farkında olmak da önemlidirkültür 18 o hücre yoğunluğu ve süresi. Deney tasarlarken Bu faktör dikkate alınmalıdır. Toplam ECM proteininde bir miktar gerekebilir kütle spektrometresi ile analiz için ECM ekstre özellikle Açıkçası, bu yöntem için bir hücre tipinin seçimi önemlidir. Tekniğin Sınırlamalar ECM proteinlerinin çok düşük seviyelerde salgılayan hücreler bu yöntemle kullanım için daha zor olacaktır. Yapışkan olmayan hücreler, 3D hücre kültürleri veya hücre istilası tahlilleri bu yöntemle ECM izolasyonu için şu anda uygun değildir. yöntemi standart &quot;2 boyutlu&quot; hücre kültürleri ile kullanım için uygundur. amonyum hidroksit ekstraksiyon tamamen ECM hücrelerin üst tarafı ile ilişkili ve salgılanmış hücreleri ortadan kaldırır, fakat sınırlayıcı olmayan çapraz bağlı olduğundan, ECM proteinleri aynı zamanda aşağıdaki ve bazlar çevresinde tabak üzerine monte ECM ince bir tabaka bırakmak çıkarılır hücrelerin 11,17 arasında </&gt; Sup. Malzeme, aynı zamanda serbest salgılanmadan önce ya da hücre yüzeyinden alımından sonra da hücre içi ECM proteinlerini içerdiği için, amonyum hidroksit ekstre serbest ne kadar ECM ölçmek için karmaşıktır. Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi İzole ECM ile deneyler geniş bir yelpazede yürütebilme hücre biyolojisi ve doku fizyolojisi bağlamında önemlidir ve aynı zamanda doku rejenerasyonu ve doku mühendisliği alanlarında etkileri vardır. yöntem, hücrelerin, doğal çapraz bağlama mekanizmaları ile kökenli hücre tipine uygun oranlarda mevcut tek tek ECM proteinleri ile, kendi ana boyutta karmaşık ECM yapıları monte bu saflaştırıldı kollajenler ya da saflaştırılmış ECM proteinleri oluşan jeller üzerinde avantajlara sahiptir. beklenen Örneğin, RCS ECM&#39;nin proteomik çalışmada, bol matrilins COMP / TSP5 gösterdikıkırdak ECM 19,20 (Şekil 4). Genel olarak, hücre kaynaklı ECM analizi kovalent çapraz bağlanma ile sonuçlanan bir geniş, çok-protein ağı ve bir çok ECM proteinleri çözülemediği olma özelliği ile engellenmektedir ve ayrıca ECM potansiyel kirlenme hücre içi proteinleri ile ayıklar. Proteomik analizi için doku ECM fraksiyonunu izole etmek için tasarlanmış bir çok-aşamalı bir prosedür 21 tespit toplam protein grubu ECM proteinlerinin% 8 elde edildi. Ancak, ECM proteinleri gelen peptidler belirlenen toplam peptitlerin% 73 idi. hücresinden türetilmiş ECM izolasyonu ve analiz için bu yöntem, hızlı ve güvenilir bir şekilde ECM proteinlerini muhafaza ederken, hücresel maddeyi temizler. Bu yöntem, hücre tipleri ve alt bir uygulama aralığı için kullanılan ve hücre kültüründe ECM biyoloji ve hücre-ECM etkileşimlerin analizine kolaylaştırır. yöntem farklı ölçeklerde nasıl uygulanabileceğini Bizim protokoller detay exp geniş bir yelpazede ele almakECM organizasyon, dinamikleri, ya da kompozisyon ile ilgili erimental sorular ve hücreler izole ECM fonksiyonel etkileri. Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi Geleceğe bakıldığında, yöntem, 3D hücre kültürleri ile kullanım için adapte edilebilir; Bu fizyolojik alaka genişletmek olacaktır. Hücresizleştirilmiş yerel doku kayıp ya da hasar görmüş doku rejenerasyonu için ve kalp yetmezliği 22 sonra da transplantasyon alternatif olarak bir iskele olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Verici kullanılabilirliği ve immunorejection sorunlarının üstesinden gelmek için bir potansiyele sahiptir. Bu raporda açıklanan yöntemin gelecekte uygulamaları daha bu yaklaşımın kapsamını artıracak 3D hücre kültürleri veya doku Decellularization ile kullanımını araştırmak olabilir.

Son birkaç on yıl içinde, hücre dışı matriks (ECM) çoklu hücre fizyolojik ve patolojik süreçlerde rol alan bir, çeşitli dinamik ve karmaşık bir ortam olarak kabul haline gelmiştir. Doku düzeyinde, ECM hücre sinyallerini, motilite, farklılaşma, anjiyogenez, kök hücre biyolojisi, tümörogenez, fibrozis, vb 1,2 etkiler. ECM organizasyon ve ECM-bağımlı süreçlerin çalışma böylece hücre biyolojisi ve doku fizyolojisi için geniş etkileri vardır. ECM kompozisyon, organizasyon ve fonksiyonel özellikleri bir mekanistik anlayışa ulaşmak, ECM doğru izolasyon yöntemleri gereklidir. Doku 3 izolasyon güvenilemez ECM proteinleri erken tespiti ise, kültürlenmiş hücrelerden ECM&#39;nin hazırlanması artık daha yaygın hale gelmiştir. hücre kökenli ECM izolasyonu ve analiz iki ana nedenden dolayı karmaşıktır. İlk olarak, hücrelerin varlığı veir bol hücre içi proteinleri zor bir ayrık hücre dışı bir yapı olarak ECM izole etmek yapabilirsiniz. Gerçekten de, bazı ECM proteinleri hücre içinde hem de ECM 4 rollere sahiptir; ECM içinde proteinlerin çalışma, hücre içinde kendi rolleri ile karıştırılmamalıdır Bu nedenle, hücre kaynaklı ECM&#39;den hücre içi proteinlerin etkili şekilde uzaklaştırılması önem taşımaktadır. İkinci olarak, hücre-türevi ECM genellikle kovalent olarak çapraz bağlantılı ECM montajı üzerine ve standart deterjanlarda nedenle çözünmeyen birçok büyük, oligomerik proteinler, oluşmaktadır. Bu özellikler çıkarma ve ECM daha fazla analiz karmaşık hale getirebilir. Bu sorunları çözmek için, bir yöntem olup, hücresel bileşenlerden ECM proteinlerinin verimli ayrılmasını sağlayan gereklidir. Çeşitli yöntemler, hücre kültürü veya doku ekstreleri ya ECM izolasyonu için literatürde tarif edilmiştir. Bu yöntemlerin birçoğu bol ECM pr çıkarılması hedefleniyorotein dokulardan kollajen ve nötr tuzlar 3, asidik koşullar 5,6 veya pepsin 7 kullanımını içerir. Doku özütlerinin toplam ECM izolasyonu genellikle önceden ECM izolasyonuna doku decellularization içerir. Örneğin, bir sıralı özütleme yöntemi, insan kardiyak doku 8 ECM izole tarif edilmiştir. İlk olarak, gevşek bağlı ECM proteinleri sodyum dodesil sülfat (SDS) önce, 0.5 M NaCI ile ekstre edildi hücreleri çıkarmak için kullanılmıştır. Son olarak, kalan ECM proteinleri 4 M guanidin 8 ile ekstre edildi. ECM ayrıca 8 M üre 9 kullanarak hücresizleştirilmiş örneklerinden çözündürülebilir. Diğer teknikler santrifüjleme ile çözünür hücre lizatından çözünmeyen ECM proteinlerinin ayrılması önce her iki hücreleri ve ECM çıkarmak için, örneğin deoksikolik asit 10 olarak deterjan kullanımı. izolasyon ve bu raporda açıklanan hücre kökenli ECM analizi için yöntem Repro sağlarhücre malzemenin çıkartılması in situ imünofloresansta analiz ya da daha fazla biyokimyasal analiz için elde edilebilir hücresinden türetilmiş ECM bırakmak için tekrarlanabilir bir yöntem. Bu yöntem, herhangi bir yapışık hücre tipi için uyarlanabilir ve immunoblotting ya da kütle spektrometrisi, veya fonksiyonel çalışmalarda izole ECM&#39;nin kullanımı için alt-prosedürler için ölçeklenebilir. Yöntem ayrıca, gerçek zamanlı olarak ilgi konusu bir etiketli protein ECM birikmesini izlemek için canlı hücre konfokal mikroskobu ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Bu ızgaralı cam tabanlı bir çanak kullanımı ile elde edilir. Genel olarak, yaklaşım, hücre-türevli ECM ve tespit etmek ve çökelmesini ve bireysel ECM proteinlerinin dinamiklerini izlemek için kapsam doğru bir izolasyon sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="971">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Antibody to COL1A1</td>
			<td style="width:123px;">Novus</td>
			<td style="width:107px;">NB600-408</td>
			<td style="width:423px;">Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I.&#160; IF:&#160; 1/200&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Antibody to fibronectin</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">F3648</td>
			<td style="width:423px;">Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Antibody to thrombospondin 1&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher&#160;</td>
			<td style="width:107px;">MA5-13398</td>
			<td style="width:423px;">Mouse monoclonal clone A6.1.&#160; WB: 1/150 for 1.5 hr</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Antibody to RFP</td>
			<td style="width:123px;">Abcam</td>
			<td style="width:107px;">ab62341</td>
			<td style="width:423px;">Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Antibody to &#946;-actin</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A1978</td>
			<td style="width:423px;">Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Antibody to &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">T9026</td>
			<td style="width:423px;">Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Cell Tracker Green</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher&#160;</td>
			<td style="width:107px;">C2925</td>
			<td style="width:423px;">Fluorescent cell marker. Use at 1 &#181;M for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">P-5282</td>
			<td style="width:423px;">Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">FITC-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">F8771</td>
			<td style="width:423px;">IF: 1/50 for 1 hr</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:123px;">SIgma</td>
			<td style="width:107px;">F7512</td>
			<td style="width:423px;">IF: 1/50 for 1 hr</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:107px;">926-80010</td>
			<td style="width:423px;">WB: 1/50000 for 1 hr</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:107px;">926-80011</td>
			<td style="width:423px;">WB: 1/100000 for 1 hr</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Vectorshield mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Vector</td>
			<td style="width:107px;">H-1200</td>
			<td style="width:423px;">Store at 4 C in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">D6429</td>
			<td style="width:423px;">Warm before use</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Fibroblast growth medium</td>
			<td style="width:123px;">PromoCell</td>
			<td style="width:107px;">C-23010</td>
			<td style="width:423px;">Warm before use, supplement with 50 &#181;g / mL ascorbic acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Phenol red-free DMEM</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher&#160;</td>
			<td style="width:107px;">21063-029</td>
			<td style="width:423px;">Warm before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">T3924</td>
			<td style="width:423px;">Warm before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Gridded glass-bottomed dish</td>
			<td style="width:123px;">MatTek</td>
			<td style="width:107px;">P35G-2-14-C-GRID</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:320px;">NH4OH, 28% - 30% &#160;solution</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">221228</td>
			<td style="width:423px;">Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Paraformaldehyde, 16 % solution</td>
			<td style="width:123px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:107px;">43368</td>
			<td style="width:423px;">Dilute to 2 % (v/v) in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Deoxycholic acid</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">D2510</td>
			<td style="width:423px;">Use at 2 % (v/v) final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">T8787</td>
			<td style="width:423px;">Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">GelCode Blue stain reagent</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher&#160;</td>
			<td style="width:107px;">24590</td>
			<td style="width:423px;">Protein stain for SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Precision Plus protein standards</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:107px;">161-0374</td>
			<td style="width:423px;">Protein standards for SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:107px;">1703940</td>
			<td style="width:423px;">Efficient transfer of high molecular weight proteins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">PVDF transfer membrane</td>
			<td style="width:123px;">Millipore</td>
			<td style="width:107px;">ISEQ00010</td>
			<td style="width:423px;">Immobilon-PSQ&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Ponceau S stain</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">P7170</td>
			<td style="width:423px;">Reversible protein stain for PVDF membrane</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:107px;">926-80200</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">High performance chemiluminescence film</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:107px;">28906837</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Sterile filtration unit, MILLEX-GV</td>
			<td style="width:123px;">Millipore</td>
			<td style="width:107px;">ML481051</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:320px;">SP8 AOBS confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:423px;">Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Key: IF, Immunofluorescence; 
			WB, Western Blot</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, scalable method for the isolation, functional study, and analysis of cell-derived extracellular matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

açıklanan protokol hücreleri çıkarmak ve hücre kökenli ECM geride bırakmak için 1.1-1.5 eylemleri adımları. Protokol COS-7 hücreleri cam lameller üzerine 96 saat için büyütülmüştür üzerinde gerçekleştirilmiştir ve hücre-türevi ECM floresan mikroskobu ile analiz edildi. DAPI ve falloidin boyama sırasıyla (Şekil 1) &#39;e göre, hücre çekirdeğinde aktin hücre iskeletinin kaybı ile oluşturulan amonyum hidroksit ile işlem, etkili bir şekilde hücre çıkarıldı. 2 M üre ile hücrelerinin alınması amonyum hidroksit kadar etkili değildir; DAPI ve Phalloidin boyama izleri tedavi sonrasında tespit edildi. 8 M üre amonyum hidroksit benzer bir etkiye (Şekil 1) vardı. Daha sonra, hücre kökenli ECM amonyum hidroksit, tedavi öncesi ve sonrası görselleştirildi (2.1-2.11 adım). COS-7 hücreleri bir monomerik kırmızı floresan proteini (MRFP) ile transfekte edildi trombospondin-1 C-terminal trimer (mRFPovTSP1C) 1 etiketli1 ve ızgarah cam tabanı ile 35 mm çanak yetiştirilen. mRFPovTSP1C ifade eden çok sayıda sağlıklı hücreleri içeren iki saat sonra kaplama, uygun bir ızgara kare konfokal mikroskop altında görüntülendi. Bir referans resmi, faz kontrast bu alanda alındı ve daha sonra, floresan zaman atlamalı görüntüleme, 2 saat (Şekil 2A) her 1 dak gerçekleştirilmiştir. Hücreler daha sonra, amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve çanak aynı ızgara kare faz kontrastı altında taşındı ve floresan mikroskobu ile yeniden analiz edilmiştir. Hücreler artık kılavuz kare mevcuttu, fakat mRFPovTSP1C karakteristik puncta (Şekil 2A) ve floresan mikroskobu ile tespit ECM içinde kalmıştır. Hücre çıkarılması öncesinde ECM yatırılır herhangi mRFPovTSP1C floresans model öncesi ve hücre sonrası kaldırma karşılaştırarak tanımlanmıştır. Her iki görüntüde tespit flüoresan puncta (Figu2A yeniden, örneğin ok) ECM ile ilişkili olduğu çıkarılmaktadır. Amonyum hidroksit ile işlem daha sonra kültür, yapışkan hücrelerden alınan yerel ECM izole etmek için kullanılmıştır. İnsan dermal fibroblastları (HDF) 96 saat boyunca cam lameller üzerinde büyütüldü. Hücreler, amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve ECM karakteristik fibril ve ağ örgüsü boyama kalıbı 16 (Şekil 2B) göstermektedir, bir anti-kollajen I antikoru ile problanmıştır. Fibronektin model verme RCS hücreleri (Şekil 2C) çıkarılmasından sonra yaklaşık sabit olmayan permeabilize fare kondrosarkom hücreleri (RCS) ve ECM içinde incelenmiştir. &quot;Test&quot; hücreler fenotipik veya fonksiyonel çalışmalar için ECM üzerine yeniden kaplanabilir böylece ECM&#39;nin amonyum hidroksit izolasyonu steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Örneğin, &quot;test&quot; COS-7 hücreleri, steril RCS hücreleri tarafından üretilen ECM ve t üzerine, 2 saat için kaplanmıştırTavuk kendi ECM üretiminde COS-7 hücreleri (3.1-3.9 adımlar) (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında, sabit geçirgen ve FITC falloidin boyama ile F-aktin organizasyon için analiz edilmiştir. daha büyük bir ölçekte, yöntem, biyokimyasal işlemler için ECM izole etmek için kullanılmıştır. Örneğin, RCS hücreleri 7 gün için iki 100 mm&#39;lik bir hücre kültür tabaklarında büyütülmüş ve adımda 4,1-4,7 prosedürler takip edildi. Hücre türevi ECM proteinleri, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içine kazınarak toplandı ve indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrıldı. Jel proteini için lekeli ve dört büyük bant her izole edilmiş ve kütle spektrometrisi (Şekil 4A) ile analiz edilmiştir. 5 / kıkırdak oligomerik matriks proteini (TSP5 / COMP) ve matrilin-1, trombospondin, fibronektin dahil olmak üzere ECM proteinleri, bir dizi (1, TSP1) trombospondin, (Şekil 4B) tanımlandı. Alternatif olarak, ECM küçük ölçekli hazırlıkları immunoblotlarda tarafından değerlendirilebilir. Örneğin, ektopik mRFPovTSP1C bir anti-TTT antikoru (Şekil 4C) olan bir PVDF membrana aktarıldı ve RFP problanmış, SDS-PAGE ile ayrılarak ifade eden COS-7 hücreleri hücre-türevi ECM. Bu teknik, TSP1 (mRFPovTSP1C) bir yerli trimerik ve TSP1 C-terminal bölgesinde (MRFP-TSP-5-1C) 17 (Şekil 4C) arasında pentamer bir mühendislik arasındaki birikme farklılıkları tespit etmek için yeterince hassastır. HDF endojen ECM incelemek için, hücre lizatı veya izole edilmiş ECM&#39;de spesifik proteinlerin varlığı bağışıklık-beneklemesi ile incelenmiştir. Bol miktarda hücre içi proteinlerdir α-tübülin ve β-aktin izole ECM (Şekil 4D), eksik oysa karakteristik ECM proteinleri, fibronektin ve trombospondin-1, ECM tespit edilmiştir. Şekil 1: Hücre çıkarması Yöntemlerinin Karşılaştırılması. COS-7 hücreleri% 2 PFA sabit lamelleri 96 saat için, yüksek yoğunlukta yetiştirilir ve% 0.5 Triton X100 geçirgen ya da hücre çıkarılması için belirtildiği gibi muamele edildi. Lameller sonra çekirdekleri görselleştirmek için F-aktin ve DAPI görselleştirmek için FITC falloidinle boyandı. Ölçek çubuğu 25 mikron =. Bu rakam Hücre Bilimi 11 Journal of orijinal yayından değiştirilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig2.jpg" /> Şekil 2: İzole ECM ECM Proteinlerin tanımlanması. (A) Faz-kontrast ve floresan görüntülerimRFPovTSP1C ifade ve 2 saat boyunca bir cam tabanlı, ızgara baz ile, 35 mm bir kap üzerinde yetiştirilen COS-7 hücreleri. Fotoğraflar önce ve amonyum hidroksit ile hücrelerin çıkarılmasından sonra gösterilmiştir. Izgara harfi kenarı noktalı bir çizgi ile faz-kontrast görüntüleri gösterilir. Beyaz oklar önce ve hücre çıkarılmasından sonra mevcut olan flüoresan puncta örnekleri göstermektedir. Ben dolaylı immünofloresan HDF ECM kollajen (B) tespiti. HDF 96 saat boyunca büyütüldü ve amonyum hidroksit ile kaldırılır ve ECM ECM sadece FITC-konjuge anti-tavşan ikincil antikoru ile boyanmış insan fibriler kollajen I için lekeli edildi. Indirekt immunfloresan tarafından tespit edilen (C) RCS hücreleri etrafında veya izole RCS ECM içinde fibronektin lokalizasyonu. RCS hücreleri% 2 PFA sabit 48 saat boyunca büyütüldü ve fibronektin ve DAPI ile boyanmıştır. Paralel yemekler, hücreler, 20 mM amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve ECM fibr için lekelionectin ve DAPI ile. Hücreler, tek başına FITC ile konjüge edilmiş anti-fare IgG antikoru ile boyandı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55051/55051fig3.jpg" /> Şekil 3: Fonksiyonel Çalışmaları Steril ECM kullanımı. RCS &quot;matris üretici&quot; hücreleri cam lameller üzerinde 48 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra hücreleri çıkarmak için, steril koşullar altında, 20 mM amonyum hidroksit ile muamele edilmiştir. COS-7, &quot;test&quot; hücreler% 0.5 Triton X100 geçirgen,% 2 PFA, sabit ya da 2 saat süre ile izole RCS ECM olmayan lamelleri kaplama ve çekirdek görselleştirmek için F-aktin ve DAPI görselleştirmek için FITC falloidinle lekeli . RCS ECM üzerine kaplanır COS-7 hücreleri daha geniş yayılan ve büyük mikrofilaman demetleri (örneğin ok) ve kenar tüyler oluşanles. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55051/55051fig4.jpg" /> Şekil 4: SDS-PAGE, kütle spektrometresi, ve immünolojik işaretleme ile izole edilmiş ECM Proteinlerin Tanımlanması. (A), RCS hücreleri 7 gün için büyütülmüştür ve 20 mM amonyum hidroksit ile çıkarıldı; ECM, 100 mM DTT ihtiva eden, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içine kazınmıştır. ECM hazırlanması indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Dört önemli bantlar (oklar 1-4) protein lekeleme ile teşhis edildi. RCS ECM bantlar 1-4 (B) Proteinler MALDI kütle spektrometrisi ile tanımlandı. (C), ya mRFPovTSP1C (trimeri) ya da MRFP-TSP-5-1C (pentamer), 48 saat için kültürlenmiştir ifade eden COS-7 hücreleriH ve 20 mM amonyum hidroksit ile ayrılmış ve ECM 100 mM DTT ihtiva eden, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde izole edilmiştir. ECM, preparat bir PVDF membrana aktarıldı indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmış ve anti-RFP antikoru ile problanmıştır. Bu panel Bioscience Reports 17 özgün bir yayından değiştirilir. (D) HDF 96 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra hücreleri çıkarmak için, ya PBS içinde% 2 deoksikolik asit (hücre lisatı) ile ya da 20 mM amonyum hidroksit ile muamele edilmiştir. ECM, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde kazınmıştır. belirtildiği gibi, iki fraksiyon, bir PVDF membrana aktarıldı indirgeme koşulları altında bir% 10 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmış ve antikorlar ile problanmıştır. her panel, moleküler ağırlık belirteçleri konumları kDa cinsinden belirtilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig4large.jpg" target="_blank">Bu fi büyük halini görmek için buraya tıklayınız</a>şekil.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix at JoVE.com

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Hücre kaynaklı Ekstrasellüler Matrix A Hızlı, İzolasyon, Fonksiyonel Çalışmaları Ölçeklenebilir Yöntem ve Analiz

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

a-rapid-scalable-method-for-isolation-functional-study-analysis-cell

Research

JoVE Journal

Biology

16.4K Görüntüleme.  University of Bristol. The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies. 

Video: A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within the brain, ascorbate acts in a neuroprotective and neuromodulatory manner that involves ascorbate cycling between neurons and vicinal astrocytes - a relationship that appears to be crucial for brain ascorbate homeostasis. Additionally, emerging evidence strongly suggests that ascorbate has a greatly expanded role in regulating cellular and systemic iron metabolism than is classically recognized. The increasing recognition of the integral role of ascorbate in normal and deregulated cellular and organismal physiology demands a range of medium-throughput and high-sensitivity analytic techniques that can be executed without the need for highly expensive specialist equipment. Here we provide explicit instructions for a medium-throughput, specific and relatively inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Ascorbate plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. Here we describe a medium-throughput, specific and inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Kültür Hücrelerinin Intra-ve Ekstrasellüler Askorbat Belirlenmesi için hızlı ve spesifik bir Mikroplate Deneyi

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...