Name: a rapid, scalable method for the isolation, functional study, and analysis of cell-derived extracellular matrix
Uploaded: 2017-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix at JoVE.com

Biz RCS ECM proteomik analizi yürütmek için, Dr. Belinda Willard, Proteomik ve Metabolomik Laboratuvarı, Lerner Araştırma Enstitüsü, Cleveland Clinic en müteşekkiriz. Biz JKA&#39;li için, numara K018043 hibe, theMedical Araştırma Kurumu İngiltere&#39;de mali destek için minnettarım.

Amonyum hidroksit çözeltisi ile Hücreleri 1. Temizleme <ol><li> Uygun Yoğunluk Kaplama ile yapışmış Hücreler hazırlayın. NOT: Hücreler analiz için yeterli ECM üreten herhangi yapışık hücre türü olabilir. Burada, COS-7 hücreleri, SV-40 viral DNA dizilerini içeren bir Afrika yeşil maymunu böbrek fibroblast benzeri hücre hattı kullanımını tarif; RCS, bir sıçan kondrosarkom hücre hattı; ya da normal insan dermal fibroblast (HDF) çocuk sünnet derisi dan zorlamaktadır. HDF geçit 1 geçişin 8 sadece kullanılır. <ol><li> Sabit ECM&#39;nin floresan mikroskopi çalışmalarda için canlı hücre ECM, görüntüleme için lamelleri, hücreler plaka, ya da küçük çaplı, işlevsel tayinler için, hücre-türevli ECM&#39;nin hazırlanması için kullanılmasıdır. SDS-PAGE analizi, immunoblot veya proteomik çalışmaları için hücre kültür kaplarına, hücreler plaka. Not: Hücre kültür koşulları (plaka hücreleri ve kültür ortamı sayısı), hücre tipine bağlı olacaktır. plakasına hücre sayısı gerekecektirözel bir hücre hattına veya hücre suşu için empirik olarak tayin edilebilir. </li><li> Hücreler, genellikle&gt; 16 saat ECM yatırmak için uygun bir zaman tanıyın. NOT: süre hücre tipine bağlı olacak ve ampirik olarak tespit edilmesi gerekir. ektopik ifade yapılması halinde, ilgi konusu transfekte edilmiş proteinin ekspresyonu için ECM birikim için uygun olan bir zaman sağlar. </li></ol></li><li> Bir aspiratörün içinde, deiyonize H2O ile stok çözeltisinden 1/14 seyreltilerek Uygun bir kap içinde, 20 mM amonyum hidroksit Hazırlama <ol><li> inkübatör hücreleri kaldırın ve yavaşça kültür ortamı çıkarın. Hafifçe çanak duvarlarına karşı dökülerek Ca 2 + / Mg2 + içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. iki çanak Kaya ve plastik bir transfer pipet ile sıvı çıkarın. iki kez daha tekrarlayın. </li></ol></li><li> Bir aspiratörün olarak, her yemeğin eğin ve plastik bir transfer pipet ile adım 1.2 den PBS kaldırmak. 3 ekle100 mm tabak başına amonyum hidroksit ml ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe. 5 dakikalık kuluçka süresi boyunca, yavaşça tüm hücrelerin parçalama sağlamak için çanak her dakika çalkalayın. Adım 1.4-1.7 aspiratörün içinde gerçekleştirilecektir. Not: Alternatif hücre çıkarma reaktifler, 10 dakika için hücreler ile kuluçkalanmıştır 2M ya da 8 M üre içermektedir. </li><li> Sallanan, her tabak 100 mm tabak başına en az 20 mL deiyonize H2O bol miktarda ekleyin. Hidroksit çözündürülmüş malzeme olan amonyum hidroksit, lize edilmiş hücrelerden ve deiyonize edilmiş H2 oluşan bir transfer pipeti ile aspirasyon O-ile amonyuma şekilde atın. Sıvı atıklar için bir kap içine bu atık çözüm aktarın. </li><li> Tüm amonyum hidroksit çözülmüş malzemenin tam olarak çıkarılmasının sağlanması için bol deiyonize H2O dört kez daha çözünmeyen ECM tabakası yıkayın. </li><li> immünofloresan ECM incelenmesi için,% 2 ekleyerek ECM düzeltmekparaformaldehit (PFA, 100 mm tabak başına 3 mL), 10 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır. Dikkat: PFA cilt veya göz teması ve akciğer hasarı, boğulma, bilinç kaybı, ya da ölüm üretebilir şiddetli Aşırı maruz kalma durumunda çok tehlikelidir. Bu sadece bir aspiratörün ele alınmalıdır ve kişisel koruyucu donanımlar giyilmelidir. </li><li> Adım 1.2 gibi PBS ile iki kez her sabit bir örnek yıkayın ve uygun bir sıvı atık kabı içine PFA çözümün atmayın. Gerekirse, floresan mikroskobu için hazırlamadan önce, 4 ° C de PBS içinde ECM örnekleri saklayın. </li></ol> Canlı hücreler Konfokal Mikroskopi Görüntüleme tarafından ECM Protein 2. Takip Biriktirme <ol><li> Bir hemasitometre altında hücreleri saymak. COS-7 hücreleri için, transfeksiyon için bir 60 mm hücre kültür çanağı üzerine 250.000 hücre plaka. Not: canlı hücre görüntüleme için, hücreler genetik olarak kodlanmış floresan ile çerçeve içinde kaynaşık ilgi ECM proteini kodlayan bir vektör ile transfekte edilebilir olmalıdırnt etiketi. Bu canlı hücre görüntüleme sırasında ilgilenilen ECM protein tanımlanmasını sağlamaktır. </li><li> Görüntüleme için 35 mm Gridlenmiş, cam tabanlı tabak üzerine protein ekspresyonu (örneğin, 16 saat) uygun bir süre sonra, Tripsin-EDTA çözeltisi ile çanak hücreleri çıkarmak bir hemositometrede saymak ve plaka ~ 150,000 hücre. hücreler 2 saat yeniden bağlanması için izin verme ve ECM çökelmesini başlatmak için (süre hücre tipine bağlı olacak ve deneysel olarak tespit edilmelidir). NOT: Bu resim kalitesini etkiler kırmızı bir renk elde gibi, fenol kırmızısı içermeyen bir hücre ortamı kullanın. </li><li> Yukarıdaki 2 saatlik bir süre boyunca, 37 ° C inkübatör odası ve bir CO2 kaynağı olan konfokal mikroskop ayarlayın. odasında ve çanak sıcaklık görüntüleme önce 37 ° C stabilize etmek için izin ver; Bu 1 saat kadar sürebilir. </li><li> 30 dakika boyunca bir flüoresan hücre belirteci ile çanak Gridlenmiş 35 mm üzerine kaplama hücreleri inkübe edin. Ardından, hücreleri yıkayıniki görüntü vermeden önce fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamı içinde. NOT: sitoplazmik floresan markör, hücre hacimleri görselleştirmek için kullanılabilir, ya da bir zara içeren işaretçi hücre kenarları görselleştirmek için kullanılabilmektedir. </li><li> konfokal mikroskop 20X objektif ve faz kontrast kullanarak, bir numara (&gt; 3) yapışık, sağlıklı hücreleri içeren uygun bir ızgara kare tanımlar. 63X veya 100X hedefleri ve floresan mikroskobu altında uygun dalga boylarını kullanarak seçilen ızgara kare içinde hücrelerin seçiminde hedef proteinin ifadesini onaylayın. </li><li> z-yığın yazılımı kullanarak floresan ve faz-kontrast time-lapse görüntüleme ayarlayın. sadece hücre gövdesi üzerinde olması sadece ECM tabaka ve &quot;End&quot; yığının altında olması &quot;Begin&quot; yığınını ayarlayın. hücre tipine bağlı olarak, 0.3 um Z adımlı boyutu ve toplam 5 um bir ila 10 derinliğe z seviyesini ayarlayın. Bu zaman noktası başına 15-30 z bölümleri arasında verecektir. </li><li> Capturperiyodik bir dizi bir süre boyunca ve faz kontrast görüntüleri (kırmızı floresan proteini (RFP), uyarma = 555 nm ve emisyon = 584 nm için) e floresan. Örneğin, 2 dk zaman aralığı ve 2 saat süresini belirlemek için time-lapse yazılımı kullanın. belirlenen süre içinde z-bölüm görüntüleri yakalama başlamak için &quot;start&quot; düğmesine basın. </li><li> ECM daki floresan etiketli protein lokalizasyonu teyit etmek için, adım 1.1-1.5 tarif edildiği gibi bir süre sonunda, çanak hücreleri çıkarmak. </li><li> İlgili ızgara kare taşınmaya faz-kontrast görüntüleme ve 20X objektif kullanın. </li><li> 63X objektif geçin ve floresan mikroskobu altında ECM tabakası tespit. ön-ekstraksiyon görüntü bu görüntü karşılaştırın </li></ol> Hücre Fonksiyonel Tahliller için Hücre türetilen ECM 3. Steril hazırlanması <ol><li> lamelleri ve başka populasyona üzerindeki hücrelerin bir nüfusu ( &quot;matris yapımcı&quot; hücreleri) büyütünlasyon en az 24 saat süre ile 100 mm hücre kültür çanağı standart kültür ( &quot;test&quot; hücreleri) içerir. Not: Bu, herhangi iki farklı yapışık hücre tipi olabilir ve deney tasarımı floresan etiketli ECM proteini ifade etmek için, bir ya da her iki hücre popülasyonlarının transfeksiyonunu kapsayabilmektedir. </li><li> Bir laminar akış başlığı içinde, hücre kültürü için kullanıldığı haliyle, Ca2 + olmaksızın PBS steril çözeltiler hazırlanması steril 0.2 her geçen 2 O / Mg2 +, 20 mM amonyum hidroksit (adım 1.3), ve de-iyonize H uygun bir steril kap içine mikron filtre. </li><li> steril teknik bakımı, nazikçe steril PBS (adım 1.2) ile lamelleri üç kez &quot;matris yapımcı&quot; hücreleri yıkayın. </li><li> steril bir pipet ile aspirasyonu ile PBS kaldırmak ve uygun bir sıvı atık kabına onu atmayın. 20 mM steril amonyum hidroksit (3 mL / 100 mm tabak) ekleyin ve aralıklarla sallanan 5 dakika boyunca inkübe. </li><li> bol miktarda ekleyinSteril deiyonize H &quot;matris üretici&quot; çanak 2, O, en az 20 sallanan 100 mm tabak başına mi, ve uygun bir atık kabına hücre lizatının uzaklıkta dökün. </li><li> Adımı tekrar 3.5 dört kez daha amonyum hidroksit çözülmüş malzemenin tam olarak çıkarılmasının sağlanması için. NOT: lamelleri &quot;matris yapımcı&quot; hücreler tarafından yatırılan ECM ilgi herhangi bir test hücreleri ile fonksiyonel testleri için steril bir ECM sağlar. </li><li> 100 mm tabak başına tripsin-EDTA çözeltisi 1.5 mL hücre hazır yemek test hücreleri inkübe test hücreleri tabak ayrılır kadar (% 0.05 w / v tripsin ve% 0.02 w EDTA h / Hank dengeli tuz çözeltisi içinde) . Hücre orta ekle 5 dakika boyunca 400 xg&#39;de Test hücreleri santrifüj ve süpernatant sıvı kaldırmak. </li><li> Taze, steril bir ortamda test hücrelerinin yeniden süspanse edin ve bir hemositometrede say. coversli steril, izole ECM üzerine bu test hücrelerinin uygun sayıda Plateps. 2-3 saat için ya da deney tasarımı için gerekli bir süre için uygun hücre ortamı içinde kültür bunları. </li><li> , Aktin hücre iskeletinin organizasyonunu incelemek% 2 test hücreleri düzeltmek PFA ve floresein izotiyosiyanat ile leke (FITC) -phalloidin (uyarma = 490 nm ve emisyon = 525 nm) görselleştirmek için F-aktin ve 4 &#39;, 6 -diamidino-2-fenilindol (DAPI; uyarma = 358 nm ve emisyon = 461 nm) çekirdekleri 11 görselleştirmek için. NOT: Kendi GİP&#39;te kaplama testi hücreleri ile heterolog hücre kaynaklı GİP&#39;te kaplama testi hücreleri morfolojisi ve aktin organizasyonu karşılaştırın. </li></ol> SDS-PAGE, imüno-lekeleme analizi veya proteomik ECM&#39;nin 4. Yalıtım <ol><li> sekresyon ve ECM çökelmesini sağlamak için, hücre tipi için uygun bir şekilde, 24-96 saat boyunca 100 mm&#39;lik bir hücre kültür tabaklarında (proteomik için 5 ile 10 yemekleri ve bağışıklık boyama için 1-2 yemekler) üzerine çıkar yapışmış olan hücrelerin büyütün. </li><li> descr olarak hücreleri çıkarınadımda 1.1-1.5 anlatılagelmiştir. </li><li> Çanak alt bakiye H2O boşaltmak için bir açı her levha eğim ve plaka tamamen kuruyana kadar dikkatlice P200 pipet ile kalan H2O çıkarın. </li><li> Buna paralel olarak, ısı, SDS-PAGE numune tampon maddesi, bir ısıtma bloğu kullanarak 2 dakika boyunca 95 ° C&#39;de 100 mM ditiyotreitol (DTT) içeren ve daha sonra plaka ekleyin. Numuneler İmmunoblotta tarafından muayene edilmesi için 100 mm plaka başına numune tamponu 200 uL uygundur. <ol><li> kütle spektrometrisi ile ECM analiz etmek için, (aşağıdaki adımları 4,5 4,6, tarif edildiği gibi) çanak SDS-PAGE numune tampon toplayarak daha konsantre bir örnek elde, 95 ° C&#39;ye kadar yeniden ısıtma ve boyunca aynı kısım kullanılarak 2-3 ek plakalar. </li></ol></li><li> iyice yemeğin tüm alanları kazınmıstır sağlanması, çanak kapalı ECM kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın. </li><li> hücre kazıyıcı ile, yemeğin bir tarafına örnek toplamak ve 200 ile kaldırmaBir tüp içine uL pipet. </li><li> ECM madde kaybını en aza indirmek için bir tüp içine hücre kazıyıcı ucundan herhangi bir kalıntı, SDS-PAGE numune tampon maddesi özü aktarın. konsantre örnek için, 95 ° C&#39;ye kadar, aynı SDS-PAGE numune tampon maddesi kısım yeniden ısı ve 2-3 ilave plakalar arasında da yeniden kullanımı. </li><li> % 7 veya% 4-7 gradyan poliakrilamid jeller kullanarak SDS-PAGE 12 ile ECM proteinleri giderin. NOT: öncesi lekeli protein belirteçlerinin kullanmak daha uygun olur. </li><li> yüksek moleküler ağırlıklı ECM proteinlerinin çözünürlüğünü artırmak için, 37 kDa&#39;lık bir moleküler ağırlık markörü yakın jel ve moleküler ağırlık işaretçileri &lt;37 kDa alt çalışan jel kaçıp ki bu jel çalışma süresini uzatır. </li><li> ECM proteinleri proteomik analizi için, bir protein leke ile jel leke ve bir görüntü yakalamak. Jelden ilgi bant kesme tripsin ile sindirilmesi ve matris destekli lazer desorpsiyon ile analiz / iyonizasyon (MALDI) -Kitlesel spektrometrisi &lt;sup&gt; 13. </li><li> Seçenek olarak ise, ECM özü daha kapsamlı bir analizi için ve tüm numune analiz için bölümlere jel şerit dilim, tripsin ile sindirilmesi ve sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) 14 gerçekleştirin. </li><li> Seçenek olarak ise, 15 immün için, yüksek moleküler ağırlıklı ECM proteinlerinin transferi sağlamak için en az 1 saat 10 dakika boyunca (yarı-kuru metodu) 15 V de poliviniliden florit (PVDF) membran üzerine SDS-PAGE jeli proteinleri aktarmak . Bir Ponceau S boyası ile membrana aktarılır total protein gözünüzde canlandırın. </li><li> Adım 4.11 takiben, varlığı kurmak ve / veya bireysel ECM proteinleri 15 bir yarı-kantitatif analiz yapmak antikorlar kullanır. <ol><li> gece boyunca 4 ° C&#39;de% 2 TBS-Tween 20 (blokaj tampon çözeltisi) içinde (ağırlık / hacim) süt ile membran bloke. bloke edici tampon içinde ECM proteinleri için spesifik antikorlar seyreltin ve fib (oda sıcaklığında 1.5 st için membran ile antikorun inküberonectin trombospondin-1 1/150 seyreltilmiş için 1/600 ve antikorun seyreltildi; Ek Tablo 1). </li><li> Böyle aktin veya tubulin (anti-aktin 1 / 10.000 seyreltilmiş ve anti-tübülin 1 / 5.000 seyreltilmiş) gibi bol hücre içi proteinlerine karşı antikorların aynı blot yeniden sondalama ile ECM izolasyon kalitesini test. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease.">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).</li><li>Hynes, R. O., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+matrisome--an+inventory+of+extracellular+matrix+constituents+and+functions.">Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903 (2012).</li><li>Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+Collagen+from+Connective+Tissue+by+Neutral+Salt+Solutions.">Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).</li><li>Hellewell, A. L., Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insider+trading:+Extracellular+matrix+proteins+and+their+non-canonical+intracellular+roles.">Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles.</a> Bioessays. 38, 77-88 (2016).</li><li>Li, D., Yang, W., Li, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+native+collagen+from+limed+bovine+split+wastes+through+improved+pretreatment+methods.">Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).</li><li>Strawich, E., Nimni, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+a+collagen+molecule+containing+three+identical+components+extracted+from+bovine+articular+cartilage.">Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage.</a> Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).</li><li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+collagen+isolated+from+adipose+tissue.">Human collagen isolated from adipose tissue.</a> Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+extraction+methodology+for+cardiac+extracellular+matrix+prior+to+proteomics+analysis.">A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis.</a> Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).</li><li>Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation-dependent+alterations+is+glycoproteins+of+extracellular+matrix+of+human+fibroblasts.+Characterization+of+GP250+and+the+collagen-like+GP140.">Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140.</a> J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).</li><li>Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+rate+of+fibronectin+matrix+assembly+by+deletion+of+the+first+type+III+repeats.">Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats.</a> J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).</li><li>Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+retention+of+thrombospondin+1+is+controlled+by+its+conserved+C-terminal+region.">Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region.</a> J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Hillenkamp, F., Karas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+peptides+and+proteins+by+matrix-assisted+ultraviolet+laser+desorption/ionization.">Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization.</a> Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).</li><li>Davis, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+LC-LC-MS-MS+platform+using+binary+ion-exchange+and+gradient+reversed-phase+chromatography+for+improved+proteomic+analyses.">Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;Western+blotting&amp;#34;:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">&amp;#34;Western blotting&amp;#34;: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelastic+properties+of+lung+cell-derived+extracellular+matrix.">Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix.</a> Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).</li><li>Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+extracellular+matrix+patterning+of+thrombospondins+by+actin+dynamics+and+thrombospondin+oligomer+state.">Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state.</a> Biosci Rep. 35, (2015).</li><li>Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+thrombospondin+secretion+by+cells+in+culture.">Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture.</a> J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).</li><li>Myllyharju, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+developing+growth+plate.">Extracellular matrix and developing growth plate.</a> Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).</li><li>Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+and+changes+in+arthritis:+noncollagenous+proteins+and+proteoglycans+in+the+extracellular+matrix+of+cartilage.">Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage.</a> Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).</li><li>Naba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrisome:+in+silico+definition+and+in+vivo+characterization+by+proteomics+of+normal+and+tumor+extracellular+matrices.">The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices.</a> Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647 (2012).</li><li>Sanchez, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+heart+matrix:+A+critical+step+toward+whole+heart+grafts.">Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts.</a> Biomaterials. 61, 279-289 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar yöntem ECM başarılı izolasyon ve analiz sağlamak için takip edilmesi gereken bazı kritik adımlar vardır. Örneğin, amonyum hidroksit hücreleri çıkarmak için ve analiz için ECM izole etmek için kullanılır. amonyum hidroksit, karanlıkta, sulu çözeltiler içinde kararlı olan ve oda sıcaklığında muhafaza edilebilir olsa da, şişe sıkıca her kullanım arasında yeniden sızdırmaz hale getirilmelidir. Gaz ve böylece konsantrasyonunu azaltarak, çözümden buharlaşması olabilir, çünkü biz güçlü bir taze şişeyi her 6-8 haftada başlayan öneririz. Buna ek olarak, çalışma çözeltisi, her bir deney için taze yapılmış olmalıdır. Hücrelerin tam de-iyonize su içinde bol yıkar ile kaldırıldığını da esastır. Bu adımlar yeterince yerine getirilmemesi halinde, hücresel materyal çanak kalır ve alt analizler kirletebilir. Hücreler 10 gün ya da daha uzun süre için yetiştirildiği takdirde, ilave su yıkama gerekli olabilir. Bu n önemlidirgörüntüleme sırasında ECM belirlerken dikkat gerekir, böylece izole ECM tabakası, tipik olarak hücrelere 11 ile karşılaştırıldığında çok ince ote. SDS-PAGE numune tampon maddesi izole edilmiş ECM etkin ekstre için, numune tamponu bir indirgeme ajanı içerir esastır. ECM en etkili kaldırılması için, kaynar örnek tamponu kullanılmalıdır. ECM örnekleri protein lekeleme veya proteomik için SDS-PAGE elektroforezi ile çözülecektir olan deneyler için, örnek tamponu, aynı kısım halinde ECM&#39;nin birkaç tabak değerinde kazıyarak konsantre örneği elde etmek için kritiktir. Değişiklikler ve Sorun Giderme ECM proteinlerinin üretimi ve salgılanması hücre tipleri arasında önemli ölçüde değişebilir, bu nedenle ECM sekresyon ve birikimi için zaman periyodu, her hücre türü için de novo belirlenmelidir. ECM kompozisyon ilişkisi t dinamik değişecek farkında olmak da önemlidirkültür 18 o hücre yoğunluğu ve süresi. Deney tasarlarken Bu faktör dikkate alınmalıdır. Toplam ECM proteininde bir miktar gerekebilir kütle spektrometresi ile analiz için ECM ekstre özellikle Açıkçası, bu yöntem için bir hücre tipinin seçimi önemlidir. Tekniğin Sınırlamalar ECM proteinlerinin çok düşük seviyelerde salgılayan hücreler bu yöntemle kullanım için daha zor olacaktır. Yapışkan olmayan hücreler, 3D hücre kültürleri veya hücre istilası tahlilleri bu yöntemle ECM izolasyonu için şu anda uygun değildir. yöntemi standart &quot;2 boyutlu&quot; hücre kültürleri ile kullanım için uygundur. amonyum hidroksit ekstraksiyon tamamen ECM hücrelerin üst tarafı ile ilişkili ve salgılanmış hücreleri ortadan kaldırır, fakat sınırlayıcı olmayan çapraz bağlı olduğundan, ECM proteinleri aynı zamanda aşağıdaki ve bazlar çevresinde tabak üzerine monte ECM ince bir tabaka bırakmak çıkarılır hücrelerin 11,17 arasında </&gt; Sup. Malzeme, aynı zamanda serbest salgılanmadan önce ya da hücre yüzeyinden alımından sonra da hücre içi ECM proteinlerini içerdiği için, amonyum hidroksit ekstre serbest ne kadar ECM ölçmek için karmaşıktır. Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi İzole ECM ile deneyler geniş bir yelpazede yürütebilme hücre biyolojisi ve doku fizyolojisi bağlamında önemlidir ve aynı zamanda doku rejenerasyonu ve doku mühendisliği alanlarında etkileri vardır. yöntem, hücrelerin, doğal çapraz bağlama mekanizmaları ile kökenli hücre tipine uygun oranlarda mevcut tek tek ECM proteinleri ile, kendi ana boyutta karmaşık ECM yapıları monte bu saflaştırıldı kollajenler ya da saflaştırılmış ECM proteinleri oluşan jeller üzerinde avantajlara sahiptir. beklenen Örneğin, RCS ECM&#39;nin proteomik çalışmada, bol matrilins COMP / TSP5 gösterdikıkırdak ECM 19,20 (Şekil 4). Genel olarak, hücre kaynaklı ECM analizi kovalent çapraz bağlanma ile sonuçlanan bir geniş, çok-protein ağı ve bir çok ECM proteinleri çözülemediği olma özelliği ile engellenmektedir ve ayrıca ECM potansiyel kirlenme hücre içi proteinleri ile ayıklar. Proteomik analizi için doku ECM fraksiyonunu izole etmek için tasarlanmış bir çok-aşamalı bir prosedür 21 tespit toplam protein grubu ECM proteinlerinin% 8 elde edildi. Ancak, ECM proteinleri gelen peptidler belirlenen toplam peptitlerin% 73 idi. hücresinden türetilmiş ECM izolasyonu ve analiz için bu yöntem, hızlı ve güvenilir bir şekilde ECM proteinlerini muhafaza ederken, hücresel maddeyi temizler. Bu yöntem, hücre tipleri ve alt bir uygulama aralığı için kullanılan ve hücre kültüründe ECM biyoloji ve hücre-ECM etkileşimlerin analizine kolaylaştırır. yöntem farklı ölçeklerde nasıl uygulanabileceğini Bizim protokoller detay exp geniş bir yelpazede ele almakECM organizasyon, dinamikleri, ya da kompozisyon ile ilgili erimental sorular ve hücreler izole ECM fonksiyonel etkileri. Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi Geleceğe bakıldığında, yöntem, 3D hücre kültürleri ile kullanım için adapte edilebilir; Bu fizyolojik alaka genişletmek olacaktır. Hücresizleştirilmiş yerel doku kayıp ya da hasar görmüş doku rejenerasyonu için ve kalp yetmezliği 22 sonra da transplantasyon alternatif olarak bir iskele olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Verici kullanılabilirliği ve immunorejection sorunlarının üstesinden gelmek için bir potansiyele sahiptir. Bu raporda açıklanan yöntemin gelecekte uygulamaları daha bu yaklaşımın kapsamını artıracak 3D hücre kültürleri veya doku Decellularization ile kullanımını araştırmak olabilir.

Son birkaç on yıl içinde, hücre dışı matriks (ECM) çoklu hücre fizyolojik ve patolojik süreçlerde rol alan bir, çeşitli dinamik ve karmaşık bir ortam olarak kabul haline gelmiştir. Doku düzeyinde, ECM hücre sinyallerini, motilite, farklılaşma, anjiyogenez, kök hücre biyolojisi, tümörogenez, fibrozis, vb 1,2 etkiler. ECM organizasyon ve ECM-bağımlı süreçlerin çalışma böylece hücre biyolojisi ve doku fizyolojisi için geniş etkileri vardır. ECM kompozisyon, organizasyon ve fonksiyonel özellikleri bir mekanistik anlayışa ulaşmak, ECM doğru izolasyon yöntemleri gereklidir. Doku 3 izolasyon güvenilemez ECM proteinleri erken tespiti ise, kültürlenmiş hücrelerden ECM&#39;nin hazırlanması artık daha yaygın hale gelmiştir. hücre kökenli ECM izolasyonu ve analiz iki ana nedenden dolayı karmaşıktır. İlk olarak, hücrelerin varlığı veir bol hücre içi proteinleri zor bir ayrık hücre dışı bir yapı olarak ECM izole etmek yapabilirsiniz. Gerçekten de, bazı ECM proteinleri hücre içinde hem de ECM 4 rollere sahiptir; ECM içinde proteinlerin çalışma, hücre içinde kendi rolleri ile karıştırılmamalıdır Bu nedenle, hücre kaynaklı ECM&#39;den hücre içi proteinlerin etkili şekilde uzaklaştırılması önem taşımaktadır. İkinci olarak, hücre-türevi ECM genellikle kovalent olarak çapraz bağlantılı ECM montajı üzerine ve standart deterjanlarda nedenle çözünmeyen birçok büyük, oligomerik proteinler, oluşmaktadır. Bu özellikler çıkarma ve ECM daha fazla analiz karmaşık hale getirebilir. Bu sorunları çözmek için, bir yöntem olup, hücresel bileşenlerden ECM proteinlerinin verimli ayrılmasını sağlayan gereklidir. Çeşitli yöntemler, hücre kültürü veya doku ekstreleri ya ECM izolasyonu için literatürde tarif edilmiştir. Bu yöntemlerin birçoğu bol ECM pr çıkarılması hedefleniyorotein dokulardan kollajen ve nötr tuzlar 3, asidik koşullar 5,6 veya pepsin 7 kullanımını içerir. Doku özütlerinin toplam ECM izolasyonu genellikle önceden ECM izolasyonuna doku decellularization içerir. Örneğin, bir sıralı özütleme yöntemi, insan kardiyak doku 8 ECM izole tarif edilmiştir. İlk olarak, gevşek bağlı ECM proteinleri sodyum dodesil sülfat (SDS) önce, 0.5 M NaCI ile ekstre edildi hücreleri çıkarmak için kullanılmıştır. Son olarak, kalan ECM proteinleri 4 M guanidin 8 ile ekstre edildi. ECM ayrıca 8 M üre 9 kullanarak hücresizleştirilmiş örneklerinden çözündürülebilir. Diğer teknikler santrifüjleme ile çözünür hücre lizatından çözünmeyen ECM proteinlerinin ayrılması önce her iki hücreleri ve ECM çıkarmak için, örneğin deoksikolik asit 10 olarak deterjan kullanımı. izolasyon ve bu raporda açıklanan hücre kökenli ECM analizi için yöntem Repro sağlarhücre malzemenin çıkartılması in situ imünofloresansta analiz ya da daha fazla biyokimyasal analiz için elde edilebilir hücresinden türetilmiş ECM bırakmak için tekrarlanabilir bir yöntem. Bu yöntem, herhangi bir yapışık hücre tipi için uyarlanabilir ve immunoblotting ya da kütle spektrometrisi, veya fonksiyonel çalışmalarda izole ECM&#39;nin kullanımı için alt-prosedürler için ölçeklenebilir. Yöntem ayrıca, gerçek zamanlı olarak ilgi konusu bir etiketli protein ECM birikmesini izlemek için canlı hücre konfokal mikroskobu ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Bu ızgaralı cam tabanlı bir çanak kullanımı ile elde edilir. Genel olarak, yaklaşım, hücre-türevli ECM ve tespit etmek ve çökelmesini ve bireysel ECM proteinlerinin dinamiklerini izlemek için kapsam doğru bir izolasyon sağlar.

<table><tbody><tr><td>Antibody to COL1A1</td><td>Novus</td><td>NB600-408</td><td>Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200</td></tr><tr><td>Antibody to fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F3648</td><td>Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 h. IF: 1/200</td></tr><tr><td>Antibody to thrombospondin 1</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>MA5-13398</td><td>Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 h</td></tr><tr><td>Antibody to RFP</td><td>Abcam</td><td>ab62341</td><td>Rabbit polyclonal. WB: 1/2,000 for 2 h</td></tr><tr><td>Antibody to &amp;beta;-actin</td><td>Sigma</td><td>A1978</td><td>Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10,000 for 1.5 h</td></tr><tr><td>Antibody to &amp;alpha;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5,000 for 1.5 h</td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>C2925</td><td>Fluorescent cell marker. Use at 1 &amp;micro;M for 30 min</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P-5282</td><td>Stock = 50 mg/mL in DMSO. 1/50 for 45 min</td></tr><tr><td>FITC-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>Sigma</td><td>F8771</td><td>IF: 1/50 for 1 h</td></tr><tr><td>FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG</td><td>SIgma</td><td>F7512</td><td>IF: 1/50 for 1 h</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-80010</td><td>WB: 1/50,000 for 1 h</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-80011</td><td>WB: 1/100,000 for 1 h</td></tr><tr><td>Vectorshield mounting medium with DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td>Store at 4 &amp;deg;C in the dark</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>Warm before use</td></tr><tr><td>Fibroblast growth medium</td><td>PromoCell</td><td>C-23010</td><td>Warm before use, supplement with 50 &amp;micro;g/mL ascorbic acid</td></tr><tr><td>Phenol red-free DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>21063-029</td><td>Warm before use</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Warm before use</td></tr><tr><td>Gridded glass-bottomed dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-C-GRID</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH, 28-30% solution</td><td>Sigma</td><td>221228</td><td>Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% solution</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td>Dilute to 2% (v/v) in PBS</td></tr><tr><td>Deoxycholic acid</td><td>Sigma</td><td>D2510</td><td>Use at 2% (v/v) final concentration</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Dilute to 0.5% (v/v) final concentration</td></tr><tr><td>GelCode Blue stain reagent</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>24590</td><td>Protein stain for SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Precision Plus protein standards</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td>Protein standards for SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell</td><td>Biorad</td><td>1703940</td><td>Efficient transfer of high molecular weight proteins</td></tr><tr><td>PVDF transfer membrane</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010</td><td>Immobilon-PSQ&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ponceau S stain</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td>Reversible protein stain for PVDF membrane</td></tr><tr><td>WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate</td><td>LI-COR</td><td>926-80200</td><td></td></tr><tr><td>High performance chemiluminescence film</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filtration unit, MILLEX-GV</td><td>Millipore</td><td>ML481051</td><td></td></tr><tr><td>SP8 AOBS confocal laser scanning microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>Environmental chamber needed for temperature and CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; control (Life Imaging Services)</td></tr><tr><td colspan="4">Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot</td></tr></tbody></table>

a rapid, scalable method for the isolation, functional study, and analysis of cell-derived extracellular matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

açıklanan protokol hücreleri çıkarmak ve hücre kökenli ECM geride bırakmak için 1.1-1.5 eylemleri adımları. Protokol COS-7 hücreleri cam lameller üzerine 96 saat için büyütülmüştür üzerinde gerçekleştirilmiştir ve hücre-türevi ECM floresan mikroskobu ile analiz edildi. DAPI ve falloidin boyama sırasıyla (Şekil 1) &#39;e göre, hücre çekirdeğinde aktin hücre iskeletinin kaybı ile oluşturulan amonyum hidroksit ile işlem, etkili bir şekilde hücre çıkarıldı. 2 M üre ile hücrelerinin alınması amonyum hidroksit kadar etkili değildir; DAPI ve Phalloidin boyama izleri tedavi sonrasında tespit edildi. 8 M üre amonyum hidroksit benzer bir etkiye (Şekil 1) vardı. Daha sonra, hücre kökenli ECM amonyum hidroksit, tedavi öncesi ve sonrası görselleştirildi (2.1-2.11 adım). COS-7 hücreleri bir monomerik kırmızı floresan proteini (MRFP) ile transfekte edildi trombospondin-1 C-terminal trimer (mRFPovTSP1C) 1 etiketli1 ve ızgarah cam tabanı ile 35 mm çanak yetiştirilen. mRFPovTSP1C ifade eden çok sayıda sağlıklı hücreleri içeren iki saat sonra kaplama, uygun bir ızgara kare konfokal mikroskop altında görüntülendi. Bir referans resmi, faz kontrast bu alanda alındı ve daha sonra, floresan zaman atlamalı görüntüleme, 2 saat (Şekil 2A) her 1 dak gerçekleştirilmiştir. Hücreler daha sonra, amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve çanak aynı ızgara kare faz kontrastı altında taşındı ve floresan mikroskobu ile yeniden analiz edilmiştir. Hücreler artık kılavuz kare mevcuttu, fakat mRFPovTSP1C karakteristik puncta (Şekil 2A) ve floresan mikroskobu ile tespit ECM içinde kalmıştır. Hücre çıkarılması öncesinde ECM yatırılır herhangi mRFPovTSP1C floresans model öncesi ve hücre sonrası kaldırma karşılaştırarak tanımlanmıştır. Her iki görüntüde tespit flüoresan puncta (Figu2A yeniden, örneğin ok) ECM ile ilişkili olduğu çıkarılmaktadır. Amonyum hidroksit ile işlem daha sonra kültür, yapışkan hücrelerden alınan yerel ECM izole etmek için kullanılmıştır. İnsan dermal fibroblastları (HDF) 96 saat boyunca cam lameller üzerinde büyütüldü. Hücreler, amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve ECM karakteristik fibril ve ağ örgüsü boyama kalıbı 16 (Şekil 2B) göstermektedir, bir anti-kollajen I antikoru ile problanmıştır. Fibronektin model verme RCS hücreleri (Şekil 2C) çıkarılmasından sonra yaklaşık sabit olmayan permeabilize fare kondrosarkom hücreleri (RCS) ve ECM içinde incelenmiştir. &quot;Test&quot; hücreler fenotipik veya fonksiyonel çalışmalar için ECM üzerine yeniden kaplanabilir böylece ECM&#39;nin amonyum hidroksit izolasyonu steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Örneğin, &quot;test&quot; COS-7 hücreleri, steril RCS hücreleri tarafından üretilen ECM ve t üzerine, 2 saat için kaplanmıştırTavuk kendi ECM üretiminde COS-7 hücreleri (3.1-3.9 adımlar) (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında, sabit geçirgen ve FITC falloidin boyama ile F-aktin organizasyon için analiz edilmiştir. daha büyük bir ölçekte, yöntem, biyokimyasal işlemler için ECM izole etmek için kullanılmıştır. Örneğin, RCS hücreleri 7 gün için iki 100 mm&#39;lik bir hücre kültür tabaklarında büyütülmüş ve adımda 4,1-4,7 prosedürler takip edildi. Hücre türevi ECM proteinleri, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içine kazınarak toplandı ve indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrıldı. Jel proteini için lekeli ve dört büyük bant her izole edilmiş ve kütle spektrometrisi (Şekil 4A) ile analiz edilmiştir. 5 / kıkırdak oligomerik matriks proteini (TSP5 / COMP) ve matrilin-1, trombospondin, fibronektin dahil olmak üzere ECM proteinleri, bir dizi (1, TSP1) trombospondin, (Şekil 4B) tanımlandı. Alternatif olarak, ECM küçük ölçekli hazırlıkları immunoblotlarda tarafından değerlendirilebilir. Örneğin, ektopik mRFPovTSP1C bir anti-TTT antikoru (Şekil 4C) olan bir PVDF membrana aktarıldı ve RFP problanmış, SDS-PAGE ile ayrılarak ifade eden COS-7 hücreleri hücre-türevi ECM. Bu teknik, TSP1 (mRFPovTSP1C) bir yerli trimerik ve TSP1 C-terminal bölgesinde (MRFP-TSP-5-1C) 17 (Şekil 4C) arasında pentamer bir mühendislik arasındaki birikme farklılıkları tespit etmek için yeterince hassastır. HDF endojen ECM incelemek için, hücre lizatı veya izole edilmiş ECM&#39;de spesifik proteinlerin varlığı bağışıklık-beneklemesi ile incelenmiştir. Bol miktarda hücre içi proteinlerdir α-tübülin ve β-aktin izole ECM (Şekil 4D), eksik oysa karakteristik ECM proteinleri, fibronektin ve trombospondin-1, ECM tespit edilmiştir. Şekil 1: Hücre çıkarması Yöntemlerinin Karşılaştırılması. COS-7 hücreleri% 2 PFA sabit lamelleri 96 saat için, yüksek yoğunlukta yetiştirilir ve% 0.5 Triton X100 geçirgen ya da hücre çıkarılması için belirtildiği gibi muamele edildi. Lameller sonra çekirdekleri görselleştirmek için F-aktin ve DAPI görselleştirmek için FITC falloidinle boyandı. Ölçek çubuğu 25 mikron =. Bu rakam Hücre Bilimi 11 Journal of orijinal yayından değiştirilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig2.jpg" /> Şekil 2: İzole ECM ECM Proteinlerin tanımlanması. (A) Faz-kontrast ve floresan görüntülerimRFPovTSP1C ifade ve 2 saat boyunca bir cam tabanlı, ızgara baz ile, 35 mm bir kap üzerinde yetiştirilen COS-7 hücreleri. Fotoğraflar önce ve amonyum hidroksit ile hücrelerin çıkarılmasından sonra gösterilmiştir. Izgara harfi kenarı noktalı bir çizgi ile faz-kontrast görüntüleri gösterilir. Beyaz oklar önce ve hücre çıkarılmasından sonra mevcut olan flüoresan puncta örnekleri göstermektedir. Ben dolaylı immünofloresan HDF ECM kollajen (B) tespiti. HDF 96 saat boyunca büyütüldü ve amonyum hidroksit ile kaldırılır ve ECM ECM sadece FITC-konjuge anti-tavşan ikincil antikoru ile boyanmış insan fibriler kollajen I için lekeli edildi. Indirekt immunfloresan tarafından tespit edilen (C) RCS hücreleri etrafında veya izole RCS ECM içinde fibronektin lokalizasyonu. RCS hücreleri% 2 PFA sabit 48 saat boyunca büyütüldü ve fibronektin ve DAPI ile boyanmıştır. Paralel yemekler, hücreler, 20 mM amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve ECM fibr için lekelionectin ve DAPI ile. Hücreler, tek başına FITC ile konjüge edilmiş anti-fare IgG antikoru ile boyandı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55051/55051fig3.jpg" /> Şekil 3: Fonksiyonel Çalışmaları Steril ECM kullanımı. RCS &quot;matris üretici&quot; hücreleri cam lameller üzerinde 48 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra hücreleri çıkarmak için, steril koşullar altında, 20 mM amonyum hidroksit ile muamele edilmiştir. COS-7, &quot;test&quot; hücreler% 0.5 Triton X100 geçirgen,% 2 PFA, sabit ya da 2 saat süre ile izole RCS ECM olmayan lamelleri kaplama ve çekirdek görselleştirmek için F-aktin ve DAPI görselleştirmek için FITC falloidinle lekeli . RCS ECM üzerine kaplanır COS-7 hücreleri daha geniş yayılan ve büyük mikrofilaman demetleri (örneğin ok) ve kenar tüyler oluşanles. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55051/55051fig4.jpg" /> Şekil 4: SDS-PAGE, kütle spektrometresi, ve immünolojik işaretleme ile izole edilmiş ECM Proteinlerin Tanımlanması. (A), RCS hücreleri 7 gün için büyütülmüştür ve 20 mM amonyum hidroksit ile çıkarıldı; ECM, 100 mM DTT ihtiva eden, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içine kazınmıştır. ECM hazırlanması indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Dört önemli bantlar (oklar 1-4) protein lekeleme ile teşhis edildi. RCS ECM bantlar 1-4 (B) Proteinler MALDI kütle spektrometrisi ile tanımlandı. (C), ya mRFPovTSP1C (trimeri) ya da MRFP-TSP-5-1C (pentamer), 48 saat için kültürlenmiştir ifade eden COS-7 hücreleriH ve 20 mM amonyum hidroksit ile ayrılmış ve ECM 100 mM DTT ihtiva eden, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde izole edilmiştir. ECM, preparat bir PVDF membrana aktarıldı indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmış ve anti-RFP antikoru ile problanmıştır. Bu panel Bioscience Reports 17 özgün bir yayından değiştirilir. (D) HDF 96 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra hücreleri çıkarmak için, ya PBS içinde% 2 deoksikolik asit (hücre lisatı) ile ya da 20 mM amonyum hidroksit ile muamele edilmiştir. ECM, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde kazınmıştır. belirtildiği gibi, iki fraksiyon, bir PVDF membrana aktarıldı indirgeme koşulları altında bir% 10 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmış ve antikorlar ile problanmıştır. her panel, moleküler ağırlık belirteçleri konumları kDa cinsinden belirtilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig4large.jpg" target="_blank">Bu fi büyük halini görmek için buraya tıklayınız</a>şekil.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix at JoVE.com

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Hücre kaynaklı Ekstrasellüler Matrix A Hızlı, İzolasyon, Fonksiyonel Çalışmaları Ölçeklenebilir Yöntem ve Analiz

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

a-rapid-scalable-method-for-isolation-functional-study-analysis-cell

Research

JoVE Journal

Biology

16.4K Görüntüleme.  University of Bristol. The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies. 

Video: A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Kanser Araştırmaları

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Biyomühendislik

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Kanser Biyolojisinde 3 Boyutlu Modeller: Heterosferoidlerde İnvazyon Dinamiği

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Yazar Spotlight: Baş ve Boyun Kanseri İlerlemesi Sırasında Kanser ve Bağışıklık Hücreleri Arasındaki Karışmanın Deşifre Edilmesi

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.
IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 &plusmn; 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 &#181;g/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 &#181;g/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

İzole Kapların vazodilatasyon ve Sıkı cilt Fare Ekstraselüler Matrix İzolasyonu

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

Hücre dışı matriks liflerinin kurban Hollow Fiber membran hücre kültürü ile üretim

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Hücre kaynaklı Ekstrasellüler Matrix A Hızlı, İzolasyon, Fonksiyonel Çalışmaları Ölçeklenebilir Yöntem ve Analiz

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

İzole Kapların vazodilatasyon ve Sıkı cilt Fare Ekstraselüler Matrix İzolasyonu

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Hücre dışı matriks liflerinin kurban Hollow Fiber membran hücre kültürü ile üretim

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi