Name: a rapid, scalable method for the isolation, functional study, and analysis of cell-derived extracellular matrix
Uploaded: 2017-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix at JoVE.com

Wir sind sehr dankbar, dass Dr. Belinda Willard, Proteomics und Metabolomics Labor, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, die Proteomanalyse von RCS ECM für die Durchführung. Wir erkennen die finanzielle Unterstützung von theMedical Research Council in Großbritannien, gewähren Nummer K018043, zu JCA.

1. Entfernung von Zellen mit Ammoniumhydroxidlösung <ol><li> Bereiten Sie adhärenter Zellen durch an der geeigneten Dichte Überzug. HINWEIS: Die Zellen können beliebige adhärenten Zelltyp sein, der für die Analyse ausreichend ECM erzeugt. Hier beschreiben wir die Verwendung von COS-7-Zellen, eine afrikanische grüne Affen-Nieren-Fibroblasten-ähnliche Zelllinie, die SV-40-Virus-DNA-Sequenzen enthält; RCS, eine Ratte Chondrosarkom Zelllinie; oder normalen humanen dermalen Fibroblasten (HDF) Stämmen aus juvenile Vorhaut. HDF sind aus dem Kanal 1 bis Kanal 8 nur dann verwendet. <ol><li> Platte, die Zellen auf Deckgläser für die Abbildung von lebenden Zellen und ECM, für die Fluoreszenzmikroskopie Studien von festen ECM, oder zur Herstellung von Zellen abgeleiteten ECM für kleine funktionelle Assays. Platte der Zellen auf Zellkulturschalen für die SDS-PAGE-Analyse, Immunoblot oder Proteomik-Studien. HINWEIS: Die Zellkulturbedingungen (Anzahl der Zellen und Kulturmedium zu plattieren) hängt vom Zelltyp. Die Zellzahl auf Platte müssenempirisch für die jeweilige Zelllinie oder Zellstamm aufgebaut werden. </li><li> Lassen Sie eine geeignete Zeit für die Zellen ECM zu deponieren, in der Regel&gt; 16 h. HINWEIS: Die Zeitdauer vom Zelltyp abhängen und müssen empirisch ermittelt werden. Wenn ektopische Expression leitenden, entsprechenden Zeit für die Expression des transfizierten Proteins von Interesse und zur Abscheidung von ECM. </li></ol></li><li> In einer Dunstabzugshaube, werden 20 mM Ammoniumhydroxid in einem geeigneten Gefäß durch die Stammlösung Verwässerungs 1/14 mit entsalztem H 2 O. <ol><li> Entfernen der Zellen aus dem Inkubator und schonend Kulturmedium zu entfernen. Fügen Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ / Mg 2+ , indem sie gegen die Wände der Schale sanft gießen. Rock the Gericht zweimal, und entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Kunststoff Transferpipette. Wiederholen Sie zweimal. </li></ol></li><li> In einer Dunstabzugshaube, jedes Gericht kippen und die PBS aus Schritt 1.2 mit einem Kunststoff Transferpipette entfernen. In 3ml Ammoniumhydroxid pro 100-mm-Schale und inkubieren sie für 5 min bei Raumtemperatur. Während der 5-min Inkubationszeit leicht bewegen das Gericht alle min die Lyse aller Zellen zu gewährleisten. 1,4-1,7 Schritte auch in der Dunstabzugshaube durchgeführt werden. HINWEIS: Alternative Zellentfernungsreagenzien umfassen 2 M oder 8 M Harnstoff, der mit den Zellen für 10 min inkubiert werden. </li><li> In reichlich entionisiertem H 2 O in jede Schale, mindestens 20 ml pro 100 - mm - Schale, mit Schaukeln. Entsorgen des Ammoniumhydroxid-solubilisierten Material , das aus Ammoniumhydroxid zusammengesetzt ist, lysierten Zellen und deionisiertem H 2 O-durch Aspiration mit einer Transferpipette. Übertragen Sie diese Abfalllösung in einen Behälter für flüssige Abfälle. </li><li> Waschen des unlöslichen ECM Schicht in reichlicher deionisiertem H 2 O viermal die vollständige Entfernung aller Ammoniumhydroxid-solubilisierten Materials zu gewährleisten. </li><li> Zur Untersuchung des ECM durch Immunofluoreszenz, fixieren Sie die ECM durch Zugabe von 2%Paraformaldehyd (PFA; 3 ml pro 100 mm Schale) bei Raumtemperatur für 10 min. Achtung: PFA ist sehr gefährlich im Falle von Haut- oder Augenkontakt und schweren Überbelichtung kann Lungenschäden, Würgen, Bewusstlosigkeit oder zum Tod führen produzieren. Es sollte nur in einer Dunstabzugshaube und persönliche Schutzausrüstung gehandhabt werden sollte getragen werden. </li><li> Waschen Sie jeden festen Probe zweimal mit PBS, wie in Schritt 1.2, und entsorgen Sie die PFA-Lösung in einen geeigneten Abfallbehälter. Falls notwendig, speichert das ECM Proben in PBS bei 4 ° C, bevor sie für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. </li></ol> 2. Tracking-Abscheidung eines ECM-Protein durch konfokale Mikroskopie Imaging lebender Zellen <ol><li> Zählen Sie die Zellen unter einem Hämozytometer. Für COS-7-Zellen, 250.000 Zellen auf einer 60 mm Zellkulturschale zur Transfektion plattieren. HINWEIS: Für die Live-Cell-Imaging, müssen die Zellen mit einem Vektor transfiziert werden codiert, das ECM-Protein von Interesse, fusioniert im Rahmen mit einem genetisch kodierten fluoreszierennt-Tag. Dies ist die Identifizierung des ECM-Protein von Interesse während der Bildgebung lebender Zellen zu ermöglichen. </li><li> Nach einer geeigneten Zeit für die Proteinexpression (zB 16 h) , um die Zellen von der Schale mit Trypsin-EDTA - Lösung zu entfernen, so dass sie in einem Hämocytometer zählen, und Platte ~ 150.000 Zellen auf eine 35-mm - Gitter, Glasbodenschale für die Bildgebung. Allow 2 h für die Zellen wieder zu befestigen und ECM deposition (die Zeitdauer hängt von dem Zelltyp und muß empirisch ermittelt werden) zu beginnen. HINWEIS: Verwenden Sie ein Zellmedium, das nicht Phenolrot enthält, da dies eine rote Färbung geben können, die Bildqualität auswirkt. </li><li> Während der obigen Zeitraum von 2 h, stellen ein konfokales Mikroskop mit einem 37 ° C Inkubator Kammer und einer CO 2 -Angebot auf. Dass die Temperatur in der Kammer und in der Schale auf 37 ° C vor der Bildgebung zu stabilisieren; dies kann bis zu 1 Stunde dauern. </li><li> Inkubieren Sie die auf die Schale mit einem fluoreszierenden Zellmarker für 30 min gridded 35 mm plattierten Zellen. Dann waschen Sie die Zellenzweimal in Phenolrot-freiem Kulturmedium vor der Bilderzeugung. HINWEIS: Eine cytoplasmatische können fluoreszierende Marker verwendet werden, um Zellvolumen sichtbar zu machen, oder ein membran Einbeziehung Marker verwendet werden können Zellränder sichtbar zu machen. </li><li> Mit dem 20x-Objektiv und Phasenkontrast auf einem konfokalen Mikroskop, identifizieren ein geeignetes Planquadrat, das eine Anzahl (&gt; 3) von adhärenten enthält, gesunde Zellen. Bestätigen Sie die Expression des Zielproteins der Wahl in den Zellen innerhalb des ausgewählten Planquadrat die 63X oder 100X Ziele und die entsprechenden Wellenlängen unter Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Richten Sie Fluoreszenz und Phasenkontrast-Zeitraffer-Bildgebung einen z-Stack-Software. Stellen Sie die &quot;Start&quot; Stack zu sein knapp unterhalb der ECM-Schicht und dem &quot;Ende&quot; Stack knapp über dem Zellkörper zu sein. Stellen Sie die z-Schrittweite auf 0,3 um und die z-Volumen zwischen 5 und 10 &amp; mgr; m Tiefe in insgesamt, je nach Zelltyp. Dies gibt zwischen 15-30 z Schnitte pro Zeitpunkt. </li><li> Capture-Fluoreszenz (für rot fluoreszierendes Protein (RFP), Anregung = 555 nm und Emission = 584 nm) und Phasenkontrast-Bilder in regelmäßigen Abständen über einen festgelegten Zeitraum. Verwenden Sie zum Beispiel die Zeitraffer-Software das Zeitintervall, in 2 Minuten und die Dauer bis 2 h einzustellen. Wählen Sie die Schaltfläche &quot;Start&quot; Erfassung von z-Schnittbilder über den definierten Zeitraum zu beginnen. </li><li> Am Ende des Zeitraums, entfernen Sie die Zellen, die aus Schale, wie 1,1-1,5 in den Schritten, die Lokalisierung des fluoreszenzmarkierten Proteins von Interesse in der ECM zu bestätigen. </li><li> Verwenden der Phasenkontrast-Bildgebung und die 20x-Objektiv das entsprechende Planquadrat zu verlagern. </li><li> Wechseln Sie in das 63X Ziel und zu identifizieren, die ECM-Schicht unter Fluoreszenzmikroskopie. Vergleichen Sie dieses Bild mit dem Pre-Extraktion Bild </li></ol> 3. Sterile Herstellung von Zell abgeleiteten ECM für Zell funktionelle Assays <ol><li> Wachsen einer Population von Zellen (die &quot;Matrix-Hersteller&quot; Zellen) auf Deckgläsern und anderen popunung (die &quot;test&quot; Zellen) in Standard-Kultur in einer Schale 100 mm Zellkultur für 24 Stunden mindestens. ANMERKUNG: Diese können zwei beliebige unterschiedliche adhärenten Zelltypen sein, und das experimentelle Design kann die Transfektion von einer oder beiden Zellpopulationen umfassen eine fluoreszenzmarkierte ECM-Protein zu exprimieren. </li><li> In einer laminaren Strömungshaube, wie für die Zellkultur verwendet wird , herzustellen sterile Lösungen von PBS ohne Ca 2+ / Mg 2+, 20 mM Ammoniumhydroxid (siehe Schritt 1.3) und deionisiertes H 2 O , indem jeweils durch ein steriles 0,2 Passieren um-Filter in eine geeignete sterile Behälter. </li><li> sterile Technik Pflege, vorsichtig waschen die &quot;Matrix-Hersteller&quot; Zellen auf Deckgläsern dreimal mit sterilem PBS (siehe Schritt 1.2). </li><li> Entfernen Sie die PBS durch Absaugen mit einer sterilen Pipette und entsorgen sie in einem geeigneten flüssigen Abfallbehälter. In 20 mM sterile Ammoniumhydroxid (3 ml / 100-mm-Schale) und brüten sie für 5 min mit in Abständen zu schaukeln. </li><li> In großen Mengensterilem deionisiertem H 2 O in die &quot;Matrix - Hersteller&quot; Schale, mindestens 20 ml pro 100 - mm - Schale, mit Schaukeln, und das Zelllysat in einen geeigneten Abfallbehälter ausleeren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.5 noch viermal die vollständige Entfernung des Ammoniumhydroxid-solubilisierten Materials zu gewährleisten. HINWEIS: Das ECM abgelegt durch die &quot;Matrix-Hersteller&quot; Zellen auf den Deck liefert dann eine sterile ECM für funktionelle Assays mit irgendwelchen Testzellen von Interesse. </li><li> Inkubieren der Testzellen aus der Zell Lager-Schale mit 1,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung pro 100 mm Schale (von 0,05% w / v Trypsin und 0,02% w / v EDTA in Hanks balancierter Salzlösung), bis die Testzellen von der Schale abgelöst werden . In Zellmedium Zentrifugation der Testzellen bei 400 × g für 5 Minuten, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren der Testzellen in frisches, steriles Medium und zählen sie in einem Hämozytometer. Platte, die eine entsprechende Anzahl dieser Testzellen auf die sterile, isoliert ECM auf coverslips. Kultur sie in der entsprechenden Zelle Medium für 2-3 h, oder für die Zeitdauer für die Versuchsplanung erforderlich. </li><li> Um die Organisation des Aktin-Zytoskelett untersuchen, fixieren die Testzellen in 2% PFA und färben sie mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -phalloidin (Anregung = 490 nm und Emission = 525 nm) sichtbar zu machen F-Actin und mit 4 &#39;, 6 -diamidino-2-phenylindol (DAPI; Anregung = 358 nm und Emission = 461 nm) , um die Kerne 11 zu visualisieren. HINWEIS: Vergleichen Sie die Morphologie und die Aktin-Organisation in den Test auf heterologen Zellen abgeleiteten ECM mit Testzellen auf ihre eigenen ECM plattiert plattierten Zellen. </li></ol> 4. Isolierung von ECM für SDS-PAGE, Immunblot-Analyse oder Proteomics <ol><li> Wachsen anhaftenden Zellen von Interesse auf 100 mm Zellkulturschalen (5 bis 10 Gerichte für die Proteomik oder 1-2 Gerichte für Immunoblotting) für 24-96 h, je nach Zelltyp, Sekretion und Ablagerung von ECM zu ermöglichen. </li><li> Entfernen Sie die Zellen als Beschribed in Schritten von 1,1 bis 1,5. </li><li> Kippen Sie jede Platte in einem Winkel zu entwässern Rest H 2 O an den Boden der Schale und vorsichtig entfernen Sie alle verbleibenden H 2 O mit einem p200 pipettieren , bis die Platte vollständig trocken ist. </li><li> Parallel Wärme SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 100 mM Dithiothreitol (DTT) bis 95 ° C für 2 min ein Heizblock verwendet, und dann zu der Platte hinzuzufügen. 200 &amp; mgr; l Probenpuffer pro 100 mm Platte ist geeignet für Proben, die durch Immunoblot untersucht werden. <ol><li> Bis ECM durch Massenspektrometrie analysiert, erzielen eine konzentrierte Probe durch die SDS-PAGE-Probenpuffer von der Schale zu sammeln (wie in den Schritten 4.5 und 4.6 beschrieben, weiter unten), wieder Erhitzen auf 95 ° C, und unter Verwendung des gleichen Aliquots in 2-3 zusätzliche Platten. </li></ol></li><li> Verwenden Sie einen Zellschaber, um gründlich die ECM von der Schüssel kratzen, um sicherzustellen, dass alle Bereiche der Schale gekratzt wurden. </li><li> Mit dem Zellschaber, sammeln die Probe auf einer Seite der Schale und nehmen Sie sie mit einem 200&amp; mgr; l-Pipettenspitze in ein Rohr. </li><li> Die zurückbleibenden SDS-PAGE-Probenpuffer Extrakt aus der Zellschaber Spitze in die Röhre um den Verlust von ECM-Material zu minimieren. Für eine konzentrierte Probe erneut erhitzen die gleiche SDS-PAGE-Probenpuffer Aliquot auf 95 ° C und wiederverwenden es über 2-3 zusätzliche Platten. </li><li> Lösen Sie die ECM - Proteine durch SDS-PAGE 12, unter Verwendung von entweder 7% oder 4-7% Steigung Polyacrylamidgelen. HINWEIS: Es ist bequem vorgefärbten Proteinmarker zu verwenden. </li><li> Um die Auflösung der hochmolekularen ECM-Proteine ​​erhöhen, verlängern die Gel Laufzeit, so dass die 37 kDa Molekulargewichtsmarker verläuft in der Nähe der Unterseite des Gels und Molekulargewichtsmarker &lt;37 kDa haben das Gel ablaufen. </li><li> Für Proteomanalyse von ECM-Proteine, färben das Gel mit einem Protein-Färbung und ein Bild aufzunehmen. Schneiden Sie Bänder von Interesse aus dem Gel, verdauen sie mit Trypsin und analysieren sie durch Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation (MALDI) -Masse Spektrometrie &lt;sup&gt; 13. </li><li> Alternativ kann für eine umfassendere Analyse des ECM - Extrakt und die gesamte Probe zu analysieren, um das Gel Spur in Abschnitte schneiden, verdauen sie mit Trypsin und führen Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) 14. </li><li> Alternativ 15 Immunoblotting übertragen Proteine aus dem SDS-PAGE - Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran bei 15 V für mindestens 1 h 10 min (Halbtrockenverfahren) , um die Übertragung der hochmolekularen ECM Proteine zu gewährleisten . Visualisieren Sie die Gesamtzahl auf die Membran übertragen Protein mit einer Ponceau S-Färbung. </li><li> Nach dem Schritt 4.11 Verwenden Antikörper die Anwesenheit einzurichten , und / oder eine semi-quantitative Analyse einzelner ECM Proteine 15 machen. <ol><li> Blockieren der Membran mit 2% (w / v) Milch in TBS-Tween 20 (Blockierungspuffer) über Nacht bei 4 ° C. Verdünnte spezifische Antikörper gegen ECM-Proteine ​​in Blocking-Puffer und Inkubation mit der Membran für 1,5 h bei Raumtemperatur (Antikörper gegen fibronectin verdünnt 1/600 und Antikörper gegen Thrombospondin-1, verdünnt 1/150; Ergänzende Tabelle 1). </li><li> Testen der Qualität der ECM Isolierung durch die gleiche Blot mit Antikörpern gegen reichlich intrazelluläre Proteine ​​erneut Sondieren wie Actin oder Tubulin (anti-Aktin verdünnt 1 / 10.000 und anti-Tubulin-1 / 5.000 verdünnt). </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Das Verfahren hat einige wichtige Schritte, die die erfolgreiche Isolierung und Analyse von ECM zu gewährleisten, die befolgt werden müssen. Beispielsweise wird Ammoniumhydroxid verwendet, um die Zellen zu entfernen, und ECM für die Analyse zu isolieren. Obwohl Ammoniumhydroxid in wässrigen Lösungen im Dunkeln stabil ist und bei Raumtemperatur gelagert werden, Flaschen muss zwischen jedem Gebrauch wieder dicht verschlossen werden. Da das Gas aus der Lösung verdampfen kann, wodurch die Konzentration zu reduzieren, haben wir eine frische Flasche beginnen alle 6-8 Wochen wird dringend empfohlen. Darüber hinaus sollte die Arbeitslösung frisch für jedes Experiment durchgeführt werden. Es ist auch wichtig, dass die Zellen vollständig mit reichlichen Waschungen in entionisiertem Wasser entfernt. Wenn diese Schritte nicht ausreichend durchgeführt werden, kann Zellmaterial auf dem Teller bleiben und Downstream-Analysen verunreinigen. Wenn Zellen für 10 Tage oder länger, zusätzliches Wasser wäscht angebaut worden erforderlich sein. Es ist wichtig zu nOTE dass die isolierten ECM - Schicht im Vergleich zu den Zellen 11 typischerweise sehr dünn ist, so Sorgfalt erforderlich ist , wenn das ECM während der Abbildung identifizieren. Für eine effektive Extraktion des isolierten ECM in SDS-PAGE-Probenpuffer, ist es wesentlich, daß die Probenpuffer ein Reduktionsmittel enthält. Für die wirksamste Entfernung des ECM, kochend heißen Probenpuffer verwendet werden. Für Experimente, in denen ECM Proben werden durch SDS-PAGE-Elektrophorese für die Proteinfärbung oder Proteomik gelöst werden, ist es entscheidend, eine konzentrierte Probe durch Abschaben mehrere Platten-Wert von ECM in der gleichen aliquoten Probenpuffer zu erreichen. Technische Änderungen und Fehlerbehebung Die Produktion und Sekretion von ECM - Proteine können signifikant zwischen Zelltypen variieren, so Zeiträume für die Sekretion und Ablagerung von ECM sollte de novo für jeden Zelltyp bestimmt werden. Es ist auch wichtig, sich bewusst zu sein, dass ECM Zusammensetzung dynamisch in Relation t änderno Zelldichte und der Zeit in Kultur 18. Dieser Faktor sollte berücksichtigt werden, wenn Experimente entwerfen. Natürlich ist die Auswahl eines Zelltyps für dieses Verfahren an Bedeutung, insbesondere, wenn ECM für die Analyse durch Massenspektrometrie Extraktion, die eine erhebliche Menge an Gesamt ECM-Protein erfordern. Einschränkungen der Technik Zellen, die sehr geringe Mengen an ECM Proteine ​​sezernieren wird zur Verwendung bei diesem Verfahren schwieriger sein. Nicht anhaftende Zellen, Kulturen 3D-Zelle oder Assays Zellinvasion sind derzeit für ECM Isolation durch dieses Verfahren nicht geeignet. Das Verfahren ist besonders geeignet zur Verwendung mit Standard &quot;2-dimensional&quot; Zellkulturen. Weil das Ammoniumhydroxid Extraktion die Zellen vollständig entfernt, zugeordnete ECM mit den Oberseiten der Zellen und sezerniert wird, jedoch nicht vernetzt, werden ECM-Proteine ​​ebenfalls entfernt, auf der Schale verlassen eine dünne Schicht zusammengesetzt ECM von unten und um die Basen der Zellen 11,17 </sup&gt;. Es ist komplex zu quantifizieren, wie viel ECM wird durch die Ammoniumhydroxid-Extraktion freigesetzt, da das freigesetzte Material auch ECM-Proteine ​​enthält, die entweder vor von der Zelloberfläche zur Sekretion oder nach Aufnahme intrazellulär vorliegen. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden Die Fähigkeit, eine breite Palette von Experimenten mit isolierten ECM zu führen ist wichtig, im Rahmen der Zellbiologie und Gewebephysiologie, und es hat auch Auswirkungen auf den Gebieten der Geweberegeneration und Tissue Engineering. Das Verfahren hat Vorteile gegenüber Gele aus gereinigtem Kollagen oder andere gereinigte ECM-Proteine ​​in dass die gebildeten Zellen montieren komplexe ECM Strukturen an ihrer nativen Größe, mit nativer Vernetzungsmechanismen und mit den einzelnen ECM Proteine ​​in Verhältnissen entsprechend dem Zelltyp Herkunft. Zum Beispiel zeigte die Proteom-Studie von RCS ECM reichlich Matriline und COMP / TSP5, wie erwarteteine knorpelige ECM 19,20 (Abbildung 4). Im Allgemeinen ist die Analyse von Zellen abgeleiteten ECM durch seine Natur als umfangreiches Netzwerkmultiprotein behindert, die in kovalenter Vernetzung und die Unlöslichkeit vieler ECM-Proteine ​​führt, und auch durch die mögliche Kontamination von ECM-Extrakte mit intrazellulären Proteinen. Ein mehrstufiges Verfahren entwickelt , um die ECM - Fraktion aus Geweben für Proteomanalyse zur Isolierung ergab 8% der ECM - Proteine in der gesamten Gruppe von Proteinen 21 identifiziert. Jedoch Peptide aus ECM-Proteine ​​waren 73% der gesamten Peptide identifiziert. Dieses Verfahren zur Isolierung und Analyse von Zellen abgeleiteten ECM schnell und zuverlässig entfernt Zellmaterial während ECM-Proteine ​​erhalten bleibt. Dieses Verfahren kann für eine Reihe von Zelltypen und Downstream-Anwendungen verwendet werden, und erleichtert die Analyse der ECM biology und Zell-ECM-Wechselwirkungen in Zellkultur. Unsere Protokolle Detail, wie das Verfahren auf verschiedenen Ebenen angewendet werden kann, eine breite Palette von exp zu adressierenerimental Fragen in Bezug auf ECM-Organisation, Dynamik oder Zusammensetzung, sowie die funktionalen Auswirkungen der isolierten ECM auf Zellen. Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering Mit Blick auf die Zukunft könnte das Verfahren für die mit 3D-Zellkulturen Verwendung angepaßt werden; dies würde ihre physiologische Relevanz erweitern. Dezellularisiertes natives Gewebe hat ein großes Potenzial als ein Gerüst für die Regeneration von verlorenen oder beschädigten Gewebes und als Alternative zur Transplantation, beispielsweise nach 22 Herzinsuffizienz. Es hat das Potenzial, die Probleme der Spender Verfügbarkeit und Immunabstoßung zu überwinden. Zukünftige Anwendungen des Verfahrens in diesem Bericht beschriebenen könnte seine Verwendung mit 3D-Zellkulturen oder Gewebe Dezellularisierung untersuchen, was den Anwendungsbereich dieses Ansatzes erhöhen würde.

In den letzten Jahrzehnten hat sich die extrazelluläre Matrix (ECM) als eine vielfältige, dynamische und komplexe Umgebung geworden erkannt, die in mehreren Zell-physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt ist. Auf der Ebene der Gewebe beeinflusst die ECM - Zell - Signal, Motilität, Differenzierung, Angiogenese, Stammzellbiologie, Tumorentstehung, Fibrose, usw. 1,2. Die Studie von ECM-Organisation und ECM-abhängige Prozesse hat somit weitreichende Auswirkungen für die Zellbiologie und Gewebephysiologie. Um ein mechanistisches Verständnis von ECM-Zusammensetzung, Organisation und funktionelle Eigenschaften, Methoden für die präzise Trennung von ECM erreichen sind erforderlich. Während die früheste Erkennung von ECM - Proteine verlassen nach der Isolierung aus Geweben 3 hat sich die Herstellung von ECM aus kultivierten Zellen nun häufiger geworden. Die Isolierung und Analyse von Zellen abgeleiteten ECM ist kompliziert aus zwei Hauptgründen. Erstens, die Anwesenheit von Zellen, und dieir reichlich intrazellulärer Proteine ​​kann es schwierig machen, die ECM als diskrete extrazelluläre Struktur zu isolieren. Tatsächlich haben einige ECM Proteine Rollen innerhalb der Zelle als auch in der ECM 4; Daher ist die effiziente Entfernung von intrazellulären Proteinen aus Zellen stamm ECM ist entscheidend, wenn die Untersuchung von Proteinen innerhalb der ECM nicht mit ihren Rollen in der Zelle zu verwechseln ist. Zweitens Zellen stamm ECM wird von vielen großen, oligomere Proteinen, die oft kovalent vernetzt bei ECM Montage und sind daher unlöslich in Vollwaschmitteln. Diese Eigenschaften können Extraktions- und die weitere Analyse der ECM komplizieren. Um diese Probleme anzugehen, ist ein Verfahren erforderlich, die eine effiziente Trennung von ECM-Proteinen aus Zellkomponenten ermöglicht. Verschiedene Verfahren wurden in der Literatur für die Isolierung von ECM entweder aus Zellkultur oder Gewebeextrakten beschrieben. Viele dieser Methoden sind bei der Extraktion des reichlich vorhandenen ECM pr gerichtetotein, Kollagen, aus Geweben und umfassen die Verwendung von Neutralsalzen 3, sauren Bedingungen 5,6 oder Pepsin 7. Isolierung von Gesamt-ECM aus Gewebeextrakten beinhaltet oft Dezellularisierung des Gewebes vor der Isolierung des ECM. Zum Beispiel wurde ein sequentielles Extraktionsverfahren beschrieben , das 8 ECM aus menschlichem Herzgewebe isoliert. Zunächst wurden lose gebundene ECM-Proteine ​​extrahiert, mit 0,5 M NaCl vor der Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde verwendet, um die Zellen zu entfernen. Schließlich wurden die verbleibenden ECM - Proteine unter Verwendung von 4 M Guanidin - 8 extrahiert. ECM kann auch von dezellularisierter Proben unter Verwendung von 8 M Harnstoff 9 gelöst werden. Andere Techniken verwenden Detergentien wie Desoxycholsäure 10, beide Zellen und ECM zu extrahieren , bevor unlösliches ECM Proteine aus der löslichen Zelllysat durch Zentrifugation abtrennt. Das Verfahren zur Isolierung und Analyse von Zellen abgeleiteten ECM in diesem Bericht beschrieben wird, liefert eine Reproproduzierbar Verfahren zur Entfernung von Zellmaterial, so dass Zellen abgeleiteten ECM , die durch für weitere biochemische Analyse in situ Immunfluoreszenz oder extrahiert analysiert werden. Dieses Verfahren kann für jede adhärenten Zelltyp angepasst werden und kann für nachgeschaltete Verfahren skaliert werden, wie beispielsweise Immunoblotting oder Massenspektrometrie, oder für die Verwendung des isolierten ECM in funktionellen Studien. Das Verfahren kann auch in Verbindung mit der konfokalen Mikroskopie lebender Zellen verwendet werden ECM Ablagerung eines getaggten Proteins von Interesse in Echtzeit zu verfolgen. Dies wird durch die Verwendung einer gerasterten, Glasbodenschale erzielt. Insgesamt bietet der Ansatz eine genaue Isolierung von Zellen abgeleiteten ECM und auch den Umfang zu identifizieren und die Abscheidung und die Dynamik der einzelnen ECM-Proteine ​​überwachen.

<table><tbody><tr><td>Antibody to COL1A1</td><td>Novus</td><td>NB600-408</td><td>Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200</td></tr><tr><td>Antibody to fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F3648</td><td>Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 h. IF: 1/200</td></tr><tr><td>Antibody to thrombospondin 1</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>MA5-13398</td><td>Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 h</td></tr><tr><td>Antibody to RFP</td><td>Abcam</td><td>ab62341</td><td>Rabbit polyclonal. WB: 1/2,000 for 2 h</td></tr><tr><td>Antibody to &amp;beta;-actin</td><td>Sigma</td><td>A1978</td><td>Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10,000 for 1.5 h</td></tr><tr><td>Antibody to &amp;alpha;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5,000 for 1.5 h</td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>C2925</td><td>Fluorescent cell marker. Use at 1 &amp;micro;M for 30 min</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P-5282</td><td>Stock = 50 mg/mL in DMSO. 1/50 for 45 min</td></tr><tr><td>FITC-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>Sigma</td><td>F8771</td><td>IF: 1/50 for 1 h</td></tr><tr><td>FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG</td><td>SIgma</td><td>F7512</td><td>IF: 1/50 for 1 h</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-80010</td><td>WB: 1/50,000 for 1 h</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-80011</td><td>WB: 1/100,000 for 1 h</td></tr><tr><td>Vectorshield mounting medium with DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td>Store at 4 &amp;deg;C in the dark</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>Warm before use</td></tr><tr><td>Fibroblast growth medium</td><td>PromoCell</td><td>C-23010</td><td>Warm before use, supplement with 50 &amp;micro;g/mL ascorbic acid</td></tr><tr><td>Phenol red-free DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>21063-029</td><td>Warm before use</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Warm before use</td></tr><tr><td>Gridded glass-bottomed dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-C-GRID</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH, 28-30% solution</td><td>Sigma</td><td>221228</td><td>Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% solution</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td>Dilute to 2% (v/v) in PBS</td></tr><tr><td>Deoxycholic acid</td><td>Sigma</td><td>D2510</td><td>Use at 2% (v/v) final concentration</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Dilute to 0.5% (v/v) final concentration</td></tr><tr><td>GelCode Blue stain reagent</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>24590</td><td>Protein stain for SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Precision Plus protein standards</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td>Protein standards for SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell</td><td>Biorad</td><td>1703940</td><td>Efficient transfer of high molecular weight proteins</td></tr><tr><td>PVDF transfer membrane</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010</td><td>Immobilon-PSQ&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ponceau S stain</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td>Reversible protein stain for PVDF membrane</td></tr><tr><td>WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate</td><td>LI-COR</td><td>926-80200</td><td></td></tr><tr><td>High performance chemiluminescence film</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filtration unit, MILLEX-GV</td><td>Millipore</td><td>ML481051</td><td></td></tr><tr><td>SP8 AOBS confocal laser scanning microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>Environmental chamber needed for temperature and CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; control (Life Imaging Services)</td></tr><tr><td colspan="4">Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot</td></tr></tbody></table>

a rapid, scalable method for the isolation, functional study, and analysis of cell-derived extracellular matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

Das Protokoll, beschrieben in den Schritten 1,1-1,5 wirkt Zellen zu entfernen, und hinter der Zelle stamm ECM verlassen. Das Protokoll wurde auf COS-7-Zellen durchgeführt wird für 96 h auf Glasdeckgläschen gezüchtet und die Zellen stamm ECM wurde durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Ammoniumhydroxid - Behandlung entfernt , die Zellen wirkungsvoll , da durch den Verlust der Zellkerne und Aktin - Zytoskelett etabliert nach DAPI und Phalloidin - Färbung, bzw. (Abbildung 1). Die Extraktion der Zellen mit 2 M Harnstoff war nicht so wirksam wie Ammoniumhydroxid; Spuren von DAPI und Phalloidin-Färbung wurden nach der Behandlung festgestellt. 8 M Harnstoff hatte eine ähnliche Wirkung wie Ammoniumhydroxid (Abbildung 1). Als nächstes Zellen abgeleiteten ECM vor und nach der Behandlung Ammoniumhydroxid visualisiert wurde (Schritte von 2,1 bis 2,11). COS-7 - Zellen wurden mit einem monomeren rot fluoreszierendes Protein transfiziert (mRFP) -markierte Thrombospondin-1 C-terminalen Trimer (mRFPovTSP1C) 11 und auf einer 35 - mm - Schale mit einem gerasterten Glasbasis gewachsen. Zwei Stunden nach der Plattierung, ein geeignetes Planquadrat, das mehrere gesunde Zellen enthielt exprimieren mRFPovTSP1C wurde unter einem konfokalen Mikroskop sichtbar gemacht. Ein Referenzphasenkontrastbild wurde dieser Bereich genommen, und dann Fluoreszenz Zeitraffer-Bildgebung wurde alle 1 min für 2 h (2A) durchgeführt. Die Zellen wurden dann unter Verwendung von Ammoniumhydroxid entfernt, und das gleiche Gitterquadrat in der Schale wurde unter Phasenkontrast verlagert und dann durch Fluoreszenzmikroskopie erneut analysiert. Die Zellen waren nicht mehr in der Planquadrat, aber mRFPovTSP1C blieb innerhalb des ECM, durch Fluoreszenzmikroskopie als charakteristische puncta (2A) nachgewiesen. Jede mRFPovTSP1C in der ECM Entfernung vor der Zelle abgelagert wurde durch Vergleich der Fluoreszenzmuster prä- identifiziert und post-Entfernung von Zellen. Die fluoreszierende puncta in beiden Bildern identifiziert (Figure 2A, beispielsweise Pfeile) sind geschlossen mit dem ECM verbunden zu sein. Ammoniumhydroxid Behandlung wurde dann aus kultivierten, anhaftenden Zellen zu isolieren nativen ECM verwendet. Humane dermale Fibroblasten (HDF) wurden für 96 h auf Glasdeckgläschen gezüchtet. Die Zellen wurden unter Verwendung von Ammoniumhydroxid entfernt, und das ECM wurde mit einem anti-Kollagen - I - Antikörper sondiert, die eine charakteristische fibrilläre und meshwork Färbemuster zeigten 16 (2B). Fibronectin Strukturieren wurde um feste, nicht-permeabilisierten Zellen , Ratte Chondrosarkom (RCS) und innerhalb des ECM nach der Entfernung der RCS - Zellen (2C) untersucht. Das Ammoniumhydroxid Isolierung von ECM wurde ebenfalls unter sterilen Bedingungen durchgeführt, so daß &quot;test&quot; Zellen auf die ECM für phänotypischen oder funktionellen Studien wieder ausplattiert werden konnten. Zum Beispiel, &quot;test&quot; COS-7-Zellen wurden für 2 h auf sterilem ECM plattierten von RCS-Zellen produziert, und then sie wurden fixiert, permeabilisiert, und F-Actin - Organisation von FITC-Phalloidin - Färbung im Vergleich zu COS-7 - Zellen analysiert , um ihre eigenen ECM Herstellung (Schritte 3,1-3,9) (Abbildung 3). Bei einem größeren Maßstab wurde das Verfahren verwendet ECM für biochemische Verfahren zu isolieren. Zum Beispiel wurden RCS-Zellen auf zwei 100 mm-Zellkulturschalen gezüchtet für 7 Tage, und die Prozeduren in Schritten von 4,1 bis 4,7 wurden befolgt. Proteine ​​in der Zelle stamm ECM wurden gesammelt, indem sie in heißes SDS-PAGE-Probenpuffer Abkratzen und wurden durch SDS-PAGE auf einem 7% Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen getrennt. Das Gel wurde Protein - gefärbt, und die vier Hauptbanden wurden jeweils isoliert und durch Massenspektrometrie (4A) analysiert. Eine Reihe von ECM - Proteinen, einschließlich Fibronectin, Thrombospondin 1 (TSP1), Thrombospondin 5 / Cartilage Oligomeric Matrix Protein (TSP5 / COMP) und Matrilin-1 identifiziert wurden (4B). Alternativ kleinere Präparate von ECM kann durch Immunoblots ausgewertet werden. Beispielsweise Zellen abgeleiteten ECM von COS-7 - Zellen ektopisch exprimieren mRFPovTSP1C durch SDS-PAGE, auf eine PVDF - Membran und sondiert für RFP mit einem Anti-Antikörper , RFP (4C) getrennt. Diese Technik ist empfindlich genug , um Unterschiede zwischen einem nativen Trimer von TSP1 (mRFPovTSP1C) und ein angelegtes Pentamer des TSP1 C-terminalen Region (mRFP-TSP-5-1C) 17 (4C) in der Abscheidung zu erkennen. Um das endogene ECM von HDF, das Vorhandensein von spezifischen Proteinen in Zelllysat oder dem isolierten ECM untersuchen wurde durch Immunoblotting untersucht. Die charakteristische ECM Proteine Fibronektin und Thrombospondin-1 wurden in der ECM festgestellt, während die intrazelluläre Proteine reichlich α-Tubulin und β-Aktin aus dem isolierten ECM (4D) nicht anwesend sind. Abbildung 1: Vergleich der Methoden der Zellentnahme. COS-7-Zellen wurden für 96 h auf Deckgläsern mit hoher Dichte gezüchtet, in 2% PFA fixiert und in 0,5% Triton X100 permeabilisiert oder behandelt wurden, wie für die Zellentfernung angegeben. Deckgläser wurden dann mit FITC-Phalloidin gefärbt F-Actin und DAPI sichtbar zu machen Kerne zu visualisieren. Maßstabsbalken = 25 &amp; mgr; m. Diese Zahl wird im Journal of Cell Science 11 von einer ursprünglichen Veröffentlichung geändert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig2.jpg" /> Abbildung 2: Identifizierung von ECM - Proteine in isolierten ECM. (A) Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder vonCOS-7-Zellen mRFPovTSP1C und aufgewachsen auf einer 35-mm-Schale mit einem Glasboden, gridded Basis für 2 h zum Ausdruck. Bilder vor und nach der Entfernung der Zellen durch Ammoniumhydroxid gezeigt. Die Kante des Gitters Buchstabe wird in der Phasenkontrast-Bilder mit einer gestrichelten Linie angedeutet. Weiße Pfeile zeigen Beispiele für fluoreszierende puncta, die vor und nach der Zellentnahme vorhanden waren. (B) Nachweis von Kollagen I in HDF ECM durch indirekte Immunofluoreszenz. HDF wurden für 96 h entfernt und mit Ammoniumhydroxid gezüchtet und der ECM wurde für menschliche fibrillärem Kollagen I. gefärbt, um die ECM auch allein mit FITC-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper gefärbt wurde. (C) Lokalisierung von Fibronektin rund RCS - Zellen oder in isolierten RCS ECM, wie durch indirekte Immunfluoreszenz nachgewiesen. RCS-Zellen wurden für 48 h, fixiert in 2% PFA, und gefärbt für Fibronektin und mit DAPI gezüchtet. Parallel Gerichte wurden die Zellen mit 20 mM Ammoniumhydroxid entfernt und der ECM wurde fibr gefärbtenonectin und mit DAPI. Zellen wurden mit FITC-konjugiertem anti-Maus-IgG-Antikörper allein gefärbt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die Verwendung von sterilem ECM für funktionelle Studien. RCS &quot;Matrix Produzent&quot; Zellen wurden für 48 h auf Glasplättchen gezüchtet und dann mit 20 mM Ammoniumhydroxid unter sterilen Bedingungen behandelt, um die Zellen zu entfernen. COS-7 &quot;test&quot; Zellen wurden 2 h auf Deckgläsern mit oder ohne isoliert RCS ECM überzogen, in 2% PFA fixiert, in 0,5% Triton X100 permeabilisiert, und gefärbt mit FITC-Phalloidin F-Actin und DAPI sichtbar zu machen Kerne zu visualisieren . COS-7 auf RCS ECM plattierten Zellen verteilt umfangreicher und bildeten große microfilament Bündel (Beispiel siehe Pfeil) und Rand ruffles. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig4.jpg" /> Abbildung 4: Identifizierung von Proteinen aus isolierter ECM durch SDS-PAGE, Massenspektrometrie oder Immunoblotting. (A) wurden RCS - Zellen für 7 Tage wachsen gelassen und mit 20 mM Ammoniumhydroxid entfernt werden ; das ECM wurde in heißer SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 100 mM DTT abgekratzt. Die ECM-Präparat wurde unter reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE auf einem 7% Polyacrylamidgel getrennt. Vier signifikante Banden (Pfeile 1-4) wurden durch Proteinfärbung identifiziert. (B) Proteine , die von RCS ECM Banden 1-4 wurden durch MALDI - Massenspektrometrie identifiziert. (C) COS-7 - Zellen, die entweder mRFPovTSP1C (Trimer) oder mRFP-TSP-5-1C (Pentamer) für 48 kultiviert wurden ,h und mit 20 mM Ammoniumhydroxid entfernt, und das war ECM isoliert in heißes SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 100 mM DTT. Die ECM-Präparation wurde durch SDS-PAGE auf einem 7% Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und mit einem anti-RFP-Antikörper sondiert. Diese Platte wird von einer ursprünglichen Veröffentlichung in Bioscience Reports geändert 17. (D) HDF wurden für 96 h gezüchtet und dann entweder mit 2% Desoxycholsäure in PBS (Zelllysat) oder mit 20 mM Ammoniumhydroxid Zellen zu entfernen. Das ECM wurde geschabt in heißes SDS-PAGE-Probenpuffer. Die beiden Fraktionen wurden durch SDS-PAGE auf einem 10% Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran übertragen und mit Antikörpern sondiert, wie angegeben. In jeder Platte sind die Positionen der Molekulargewichtsmarker in kDa angegeben. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieses fi anzuzeigen</a>Abbildung.

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A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.4K Aufrufe.  University of Bristol. The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies. 

Serie: A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Forschung

Biotechnik

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Die Herstellung von extrazellulären Matrix-derived Foams und Mikroträgern als gewebespezifische Zellkultur und Delivery-Plattformen

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.
IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 &plusmn; 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 &#181;g/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 &#181;g/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

Vasodilatation isolierter Gefäße und die Isolierung der extrazellulären Matrix von Fest-Haut Mäuse

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Immunologie und Infektion

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

Produktion von Fasern der extrazellulären Matrix über Opfer Hohlfaser-Membran Zellkultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Biologie

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Invasion Assay Using 3D Matrices

The extracellular matrix (ECM) is a network of molecules that provide a structural framework for cells and tissues and helps facilitate intercellular communication. Three-dimensional cell culture techniques have been developed to more accurately model this extracellular environment for in vitro study. While many cell processes during migration through 3D matrices are similar to those required for movement across rigid 2D surfaces, including adherence, migration through ECM also requires cells to modulate and invade this polymeric-mesh of ECM. In this video, we will present the structure and function of ECM and the basic mechanisms of how cells migrate through it. Then, we will examine the protocol of an assay for tube formation by endothelial cells, whose steps can be generalized to other experiments based on 3D matrices. We will finish by exploring several other biological questions that can be addressed using ECM invasion assays.

Cell Invasion Assay Using 3D Matrices

3D-Invasionsassay

The extracellular matrix (ECM) is a network of molecules that provide a structural framework for cells and tissues and helps facilitate intercellular ...