This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).

כל הפרוצדורות מבוצעות בהתאם להנחיות בעלי חיים מאוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם. 1. ההתמיינות hiPSCs לתוך hiPSC-CMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל הבארות של צלחת 6-היטב עם תערובת חלבונים דביקות מראש מקורר צמיחה פקטור-מופחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. לשאוב את תערובת חלבונים הדביקה לפני השימוש. זרעי hiPSCs לצלחות מראש מצופה, ותרבות התאים (1 x 10 5 תאים לכל טוב) ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס mTeSR1 תוספת בינונית עם מעכב ROCK 10 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן המדיום יומי עד התאים מגיעים 90 מפגש%; אז, להוסיף תערובת חלבונים דביקה-מופחת צמיחת פקטור אל (תערובת חלבונים דביקה 0.5 מ&quot;ג לכל צלחת 6-היטב, 2 בינוני מיליליטר לכל טוב) הבינונית, ותרבות התאים למשך 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס ימים נוספים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להחליף את המדיום, בעדינות למצוץ את מדיום מצלחת פטרי באמצעות ואקום עםנגיעת התאים החוצה, ולהוסיף מדיום חדש בעזרת פיפטה העברה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום בידול על ידי החלפה הבינונית עם בינוני RPMI1640 בתוספת-גורם גדילה מופחת תערובת חלבונים דביקה, B27 ללא אינסולין, ו -100 ng / ml Activin A; תרבות התאים ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני עם בינוני RPMI1640 כי כבר השלימו עם B27 ללא אינסולין, 10 ng / morphogenic העצם מ&quot;ל חלבון 4 (BMP-4), ו -10 גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי ng / ml (bFGF); תרבות התאים ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך 96 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני עם בינוני RPMI1640 בתוספת B27 ולהמשיך תרבות התאים ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס; לרענן את בינונית כל 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב אשכולות להידבקות התאים תחת המיקרוסקופ ~ 3 ימים ממועד קבלת בידול. אסוף את האשכולות ~ 7 ימים לאחר התבוננות התכווצויות ראשונה ולשטוף אותם הנקס מאוזן תמיסת מלח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים-התקבצו את הצלחת על ידי דוגרים אותם במאגר הנקס המכיל 100 U / IV collagenase מ&quot;ל במשך 10 דקות ב 37 ºC עם רעד עדין; אז, להוסיף טריפסין 0.25% בחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את פתרון האנזים עם בסרום שור עוברי 10% בטווח בינוני RPMI / B27 ואז resuspend תאים במדיום RPMI / B27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים על ידי hemocytometer. התרבות התאים על צלחות 10 ס&quot;מ ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 3, אשר יאפשר את התאים הלא-cardiomyocyte לדבוק פני השטח של המנה תרבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא, אשר מכיל את hiPSC-CMS, ולשמור על תאים (בסביבות 1 x 10 6 תאים לכל 10 ס&quot;מ צלחת) על ידי culturing אותם על משטח מצופה תערובת חלבונים דביקות. </li></ol> 2. ההתמיינות hiPSCs לתוך hiPSC-ECS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את אוכלוסיית hiPSC לתוך תאים בודדים ידי דוגרי הem עם chelating סוכן ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מעביר את תאי צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר המכיל בינוני mTeSR1 טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. Resuspend התאים בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר מעכב ROCK. לקבוע את צפיפות התאים עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של 20 יחידות NIH / פתרון תרומבין מ&quot;ל אחד טוב של צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 x 10 6 hiPSCs 250 μl של פתרון פיברינוגן 12.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. ולהוסיף 250 μl של פתרון פיברינוגן התא המכיל את תרומבין טעון היטב. שים את התערובת לחזק להקים פיגום הפיברין המכיל hiPSC בתוך דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הקרושה, פיגומים התא המכיל לתוך הבארות של צלחת 6-היטב עם מלקחיים מכסה זכוכית, וליזום בידול על ידי culturing הפיגומים ב 2 מ&quot;ל בינוני EBM2 בתוספת 2% B27 ללא אינסולין,-A Activin (50 ng / מ&quot;ל), ו- BMP-4 (25 ng / ml) עבור 24 שעות ב 5% CO <sUB&gt; 2 ו -37 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום ידי ומוצץ את המדיום הישן בעדינות באמצעות ואקום בלי לגעת תאים. הוסף בינוני EBM2 חדש בתוספת B27 ללא אינסולין, גורם (vascular endothelial growth VEGF, 50 ng / ml), אריתרופואטין (EPO, 100 ng / ml), ו β1 גורם גדילה הפיכה (TGFβ1, 10 ng / ml), ותרבות פיגומים ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן המדיום ותרבות הפיגומים ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך 48 אחר שעה; אז, שחרר את התאים מן הפיגום על ידי הוספת 200 IV collagenase U (100 U / ml) למדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים לאחר פרסומם. החלף בינוני עם 2 מ&quot;ל בינוני EGM2-MV בתוספת 2% של B27,-A VEGF (מ&quot;ל / 50 נ&quot;ג), ו SB-431,542 (10 מיקרומטר); לרענן את בינונית כל יומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -10 ימים לאחר מכן (כלומר, על ~ יום 14 לאחר בידול יזמה), לנתק את התאים עם 100 U / IV collagenase מ&quot;ל, לבודד hiPSC-ECS מקרב אוכלוסיית תאים מובחנים באמצעות-cytometry זרימה מנתח עבור ביטוי של חלבונים סמן ספציפי EC (למשל, CD31, CD144) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב את hiPSC-ECS המבודדת באמצעות פרוטוקול 3 הוקם. </li></ol></li></ol> 3. ההתמיינות hiPSCs לתוך hiPSC-SMCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי hiPSCs לצלחות כי כבר מצופות תערובת חלבונים דביקה, ותרבות התאים הבינוני mTeSR1 ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס, עם שינויים בינוניים יומיים, עד ומחוברות (~ 2 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום בידול לתאי השושלת mesodermal ידי culturing התאים עם CHIR99021 (5 מיקרומטר) ו- BMP-4 (10 ng / ml) במדיום RPMI1640 ו -2% B27 בתוספת אינסולין במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר hiPSC-SMCs עם פנוטיפ סינתטי בעיקר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים עם-A VEGF (מ&quot;ל / 25 נ&quot;ג), β גורם גדילה פיברובלסטים (FGFβ, 5 ng / ml) ב RPMI1640 לי<html> dium, ואינסולין מינוס 2% B27 ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים-A VEGF (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) במדיום RPMI1640, ו -2% B27 בתוספת אינסולין 5% CO 2 ו -37 ° צלזיוס למשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי β גורם גדילה הנגזרות טסיות (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFβ (3 ng / ml) ב RPMI1640, ו -2% B27 בתוספת אינסולין 5% CO 2 ו -37 ° צלזיוס למשך 4 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר hiPSC-SMCs עם פנוטיפ התכווצות בעיקר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים במשך 4 ימים עם-A VEGF (25 ng / ml) ו FGFβ (5 ng / ml) ב RPMI1640 ו -2% B27 מינוס אינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים למשך 7 ימים עם PDGFβ (5 ng / ml) ו TGFβ (2.5 ng / ml) ב RPMI1640 ו -2% B27 בתוספת אינסולין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את אוכלוסיות hiPSC-SMC הסופי על ידי culturing התאים לקטט (4 מ&quot;מ) המכיל בינוני מטבולית RPMI1640 עבור ~ 6 ימים. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. יצירת מיקרוסכמות IGF-המכיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זית מחממים שמן ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקצה 5 מ&quot;ל של תמיסת הג&#39;לטין 10% ל -50 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הג&#39;לטין אל שמן, מערבבים זית, ולאחר מכן לצנן במהירות עד 5 מעלות צלזיוס על ידי הוספת קרח על אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשרים וחמש דקות מאוחר יותר, להוסיף מצונן (4 ° C) אצטון על שמן זית כדי לגרום להיווצרות microsphere. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על טמפרטורה של 5 מעלות צלזיוס במשך שעה 1; אז, לאסוף את microspheres, לשטוף אותם 5 פעמים עם אצטון מראש מקורר כדי להסיר את שמן הזית, ולאפשר להם אוויר יבש על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את microspheres בתמיסה של אתנול 70% ו glutaraldehyde 0.25% לילה בשעה 4 ° C. כדי לגרום cross-linking, ולאחר מכן לנטרל את התערובת עם 100 גליצין מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IGF טען לתוך microspheres ידי ערבוב 5 microspheres מ&quot;ג עם 15 μl מזוקקים H 2 O המכיל IGF 5 מיקרוגרם ו -0.1% אלבומין בסרום שור למשך 30 דקות. </li></ol> 5. יצירת הרטייה על האתר של פציעה ו הזרקת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את CMS הנגזרות hiPSC (2 מיליון), SMCs (1 מיליון), ו ECS (1 מיליון) יחד 1 מ&quot;ל מינימום בינוני Essential (MEM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות 5 מ&quot;ג של microspheres בתמיסה 1 מ&quot;ל פיברינוגן (25 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מזרק אחד עם תמיסה המכילה תאים, מזרק אחר עם הפתרון פיברינוגן / microsphere, ומזרק השלישי עם 1 מ&quot;ל של תמיסת תרומבין (80 יחידות NIH / מ&quot;ל, בתוספת 2 μl 400 מ&quot;מ CaCl 2 ו -200 מ&quot;מ ε-aminocaproic חוּמצָה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניתוח לגרום לאוטם שריר הלב בלב החזירים באמצעות קשירת השמאלי הקדמי היורד לב כלילית כפי שתואר קודם לכן 2. הערה: בקיצור, החזירים יורקשייר נקבה (~ 13 ק&quot;ג, 45 ימים של גיל) מורדמים עם זריקה תוך שרירית של Telazol / Xylazine (4.4 מ&quot;ג / ק&quot;ג), חובר לצינור בהרדמה כללית עם isoflurane (0.5-5%). A 4 th intercפתיחת בית החזה ostal מתבצע והשאיר הקדמי היורד לב כלילית חשופה. העורק הכלילי הוא occluded ידי ליגטורה למשך 60 דקות ולאחר מכן המיתר מוסר. דפיברילציה חשמל מיידית מבוצעת במקרה של פרפור חדרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם טבעת פלסטיק סטרילית (~ 2.5 סנטימטרים) על epicardium האזור האוטם של לבבות חזירים, ולאחר מכן בעת ​​ובעונה אחת להזריק פתרונות microsphere / פיברינוגן תרומבין לזירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תערובת כדי לחזק (~ 30 שניות), ולאחר מכן להכניס את המחט של המזרק המכיל תאים באמצעות תערובת הקרושה לתוך שריר הלב אוטם ולהזריק את התאים. סגור את שכבות השריר, הרקמה התת עורית, ואת בית החזה עם 3-0 או 2-0 תפר Monocryl בהתאם לגודל החיה. עצירות 0.01-0.02 מ&quot;ג / זריקה תוך שרירית ק&quot;ג כל 8 שעות ישמש לשלוט בכאב עבור 3 הימים הראשונים לאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת תפקוד הלב באמצעות תהודה מגנטית של הלבהדמיה (MRI) לפני הליך כירורגי, שבוע אחד וארבעה שבועות לאחר ההליך הכירורגי 2, 3, 4. לאחר מחקרי MRI הסופיים, להקריב את החיה ולעבד לבם היסטולוגיה וניתוח מולקולרי 2, 3, 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Qiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+and+proliferation+time+course+of+stem+cells+transplanted+in+the+myocardium.">Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium.</a> Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+a+spatiotemporal+3D+environment+on+endothelial+cell+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced-Pluripotent+Stem+Cells+into+Smooth-Muscle+Cells:+Two+Novel+Protocols.">Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols.</a> PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).</li><li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity.">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).</li><li>Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+bodies:+a+novel+culture+method+for+enrichment+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).</li><li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li><li>Huber, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+selection+of+cardiomyocytes+during+human+embryonic+stem+cell+differentiation.">Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation.</a> FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).</li><li>Kita-Matsuo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+and+protocols+for+creation+of+stable+hESC+lines+for+fluorescent+tracking+and+drug+resistance+selection+of+cardiomyocytes.">Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes.</a> PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).</li><li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+and+endothelial+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).</li><li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+promotes+hematoendothelial+cell+development+from+human+embryonic+stem+cells.">Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (1), 122-131 (2008).</li><li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells.">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+derived+from+human+iPSCS+increase+capillary+density+and+improve+perfusion+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease.">Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).</li><li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source.">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li><li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+approaches+to+improve+cell+survival+in+myoblast+transfer+therapy.">Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).</li><li>Tang, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+administration+of+cardiac+progenitor+cells+alleviates+left+ventricular+dysfunction+in+rats+with+a+30-day-old+infarction.">Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction.</a> Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).</li><li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+and+functional+consequences+of+bone+marrow-derived+multipotent+progenitor+cell+transplantation+in+hearts+with+postinfarction+left+ventricular+remodeling.">Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling.</a> Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).</li><li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+myocardial+insulin-like+growth+factor+1+(IGF-1)+delivery+with+biotinylated+peptide+nanofibers+improves+cell+therapy+for+myocardial+infarction.">Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+insulin-like+growth+factor-1+in+mice+protects+from+myocyte+death+after+infarction,+attenuating+ventricular+dilation,+wall+stress,+and+cardiac+hypertrophy.">Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy.</a> J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).</li><li>Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiomyocyte+apoptotic+signaling+by+insulin-like+growth+factor+I.">Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I.</a> Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).</li><li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts.">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li></ol>

אף אחד.

תשואה / טוהר משופר של hiPSC-CMS פרוטוקולים קונבנציונליים להבחנה תא גזע אנושי לתוך CMS מוגבלים לעתים קרובות על ידי תשואה נמוכה וטוהר; למשל, רק 35-66% של hESC-CMS שהושגו באמצעות הפרדת Percoll היווצרות גוף לב הביעו שרשרת כבדת שרירן איטית או cTnT <sup class="xr...

אדם מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs) הם בין סוכני המבטיחים ביותר עבור טיפול בתאי משובים כי הם יכולים להיות מובחנים לתוך מגוון בלתי מוגבל פוטנציאל וכמות התאים שאינם נדחה על ידי המערכת החיסונית של החולה. עם זאת, את יכולת שכפול עצמי והבחנה יכול גם להוביל להיווצרות גידולים, וכתוצאה מכך, hiPSCs צריך להיות מובחן במלואו לתוך סוגי תאים מסוימים, כגון cardiomyocytes (CMS), תאי האנדותל (EC), ותאי שריר חלק (SMCs ), לפני מתן. אחת השיטות הפשוטות והנפוצות ביותר של ממשל תא הוא הזרקת intramyocardial ישירה, אך מספר תאים מושתלים כי הם engrafted ידי רקמת שריר לב הוא היליד נמוך באופן חריג. הרבה התשה זו ניתן לייחס לסביבה ציטוטוקסיות של הרקמה איסכמי; עם זאת, כאשר תאי גזע בעכברים עובריים (ESCs) מוזרקים היו ישירות לתוך שריר הלב של לב וללא כל פגע, only ~ 40% של 5 מיליון התאים נמסרים נשמרו במשך 3-5 שעות 1, אשר טוענת כי חלק ניכר של התאים המנוהלים יצא אתר הממשל, אולי משום שהם היו סחטו דרך מסלול המחט ידי בלחצים הגבוהים הנוצרים במהלך התכווצות שריר הלב. כאן, אנו מציגים שיטות חדשניות והרבה יותר יעילות להפקה cardiomyocytes hiPSC הנגזרת (hiPSC-CMS) 2, תאי אנדותל (hiPSC-ECS) 3, ותאי שריר חלק (SMCs) 4. יש לציין, פרוטוקול hiPSC-SMC זה הוא ראשון לחקות את המגוון הרחב של מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים שנצפו סומטיים SMCs 5 על ידי הפניית התאים כלפי פנוטיפ SMC סינטטי או תנועתיים בעיקרה. כמו כן אנו מספקים שיטה של ​​משלוח תא המשפר את קצב engraftment של התאים מוזרקים על ידי יצירת p הפיברין המכילים ציטוקיניםAtch על הזריקה. המדבקה מופיע כדי לשפר הן החזקת התא, על ידי איטום המסלול מחט כדי למנוע את התאים מפני היציאה שריר הלב, והישרדות התא, על ידי שחרור גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF) על פני תקופה של שלושה ימים לפחות.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Protocol Section 1&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>Stem cell technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Growth-factor-reduced matrigel</td><td>Corning lifescience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stem cell technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement, serum free</td><td>Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&amp;amp;D</td><td>338-AC-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R&amp;amp;D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0217889</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, NaCl, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; anhydrous)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14175079</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning Lifescience</td><td>356721</td><td></td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>Corning Lifescience</td><td>354732</td><td></td></tr><tr><td>Cell incubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Protocol Section 2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5g</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7009-1KU</td><td></td></tr><tr><td>EMB2 medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>ProSpec-Tany</td><td>CYT-241</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Life Technologies</td><td>PHC9431</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;#946;</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>EGM2-MV medium</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB555445</td><td></td></tr><tr><td>CD144</td><td>BD Bioscience</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorff Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Protocol Section 3&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stem cell technologies</td><td>720542</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-&amp;#946;</td><td>Prospec</td><td>CYT-501-10ug</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Protocol Section 4&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olive oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1514</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>291-G1-01M</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>Heating plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10Q</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Protocol Section 5&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#949;-aminocaproic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0420000</td><td></td></tr><tr><td>MEM medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482748</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia ventilator</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>47810</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia ventilator</td><td>Ohio Medical</td><td>V5A</td><td></td></tr><tr><td>Defibrillator</td><td>Physiol Control</td><td>LIFEPAK 15</td><td></td></tr><tr><td>1.5 T MRI</td><td>General Electric</td><td>Signa Horizon LX</td><td></td></tr><tr><td>7 T MRI</td><td>Siemens</td><td>10018532</td><td></td></tr><tr><td>Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)</td><td>Berlex</td><td>50419-188-02</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk suture</td><td>Ethilon</td><td>685H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 silk suture</td><td>Ethilon</td><td>622H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 monofilament suture</td><td>Ethilon</td><td>627H</td><td></td></tr></tbody></table>

pluripotent stem cell derived cardiac cells for myocardial repair

תאים אנושיים המושרה גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs) חייב להיות מובחן במלואו לתוך סוגי תאים מסוימים לפני הממשל, אך פרוטוקולים קונבנציונאלי להבחנה hiPSCs לתוך cardiomyocytes (hiPSC-CMS), תאי אנדותל (hiPSC-ECS), ותאי שריר חלק (SMCs) הם בדרך כלל מוגבל על ידי תשואה, טוהר נמוך, ו / או יציבות פנוטיפי עניה. כאן, אנו מציגים פרוטוקולי רומן להפקה hiPSC-CMS, -ECs, ו -SMCs כי הם משמעותיים יותר יעילים מאשר שיטות קונבנציונליות, כמו גם שיטה משלבת הזרקת תא עם טלאי ציטוקינים המכילים נוצרו על האתר של ממשל. המדבקה משפר הן את שימור של התאים מוזרקים, על ידי איטום המסלול מחט כדי למנוע את התאים מפני סחט של שריר הלב, והישרדות התא, על ידי שחרור גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF) על פני תקופה ארוכה. במודל החזירים של פגיעה איסכמיה-רה-פרפוזיה בשריר הלב, קצב engraftment היה יותר משני-לקפל יותר כאשרתאים נוהלו עם המדבקה המכיל ציטוקינים בהשוואה לתאים ללא תיקון, וטיפול בשני התאים ואת התיקון, אך לא עם התאים לבד, היה קשור לשיפור בתפקוד לב וגודל אוטם.

אפיון של הבדיל hiPSC-CMS, -ECs, ו -SMCs קיבולת ההפרש של hiPSCs הוערכה 2, 3, 4. Cytometry זרימה ניתוח לב טרופונין T (cTnT) ביטוי מראים כי טוהר האוכלוסייה hiPSC-CM הסופי יכול...

Watch this Scientific Journal Video about Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair at JoVE.com

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

אנו מציגים שלושה פרוטוקולי רומן ויעילים יותר להבחנה תא גזע מושר אנושי לתוך cardiomyocytes, תאי אנדותל, ותאי שריר חלק ו שיטת הצגה המשפר את engraftment של תאים מושתלים על ידי שילוב הזרקת תא עם משלוח ציטוקינים בתיווך תיקון.

תאי גזע פלוריפוטנטיים נגזרים תאי לב לתיקון שריר לב

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

pluripotent-stem-cell-derived-cardiac-cells-for-myocardial-repair

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K Views.  University of Alabama at Birmingham.  אנו מציגים שלושה פרוטוקולי רומן ויעילים יותר להבחנה תא גזע מושר אנושי לתוך cardiomyocytes, תאי אנדותל, ותאי שריר חלק ו שיטת הצגה המשפר את engraftment של תאים מושתלים על ידי שילוב הזרקת תא עם משלוח ציטוקינים בתיווך תיקון. 

Video: Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge, arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle cells. Despite optimum drug therapy, heart failure represents a leading cause of mortality and morbidity in the developed world. A major challenge in drug development is the identification of cellular assays that accurately recapitulate normal and diseased human myocardial physiology in vitro. Likewise, the major challenges in regenerative cardiac biology revolve around the identification and isolation of patient-specific cardiac progenitors in clinically relevant quantities. These cells have to then be assembled into functional tissue that resembles the native heart tissue architecture. Microcontact printing allows for the creation of precise micropatterned protein shapes that resemble structural organization of the heart, thus providing geometric cues to control cell adhesion spatially. Herein we describe our approach for the isolation of highly purified myocardial cells from pluripotent stem cells differentiating in vitro, the generation of cell growth surfaces micropatterned with extracellular matrix proteins, and the assembly of the stem cell-derived cardiac muscle cells into anisotropic myocardial tissue.

The generation of aligned myocardial tissue is a key requirement for adapting the recent advances in stem cell biology to clinically useful purposes. Herein we describe a microcontact printing approach for the precise control of cell shape and function. Using highly purified populations of embryonic stem cell derived cardiac progenitors, we then generate anisotropic functional myocardial tissue.

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Bioengineering

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

הערכת תקינות ה-DNA בתאי גזע לטיפול תאי הלב

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Genetics

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that mouse embryonic, dermal, and cardiac fibroblasts can be reprogrammed into functional induced-cardiomyocyte-like cells (iCMs) through overexpression of cardiogenic transcription factors including GATA4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 both in vitro and in vivo. However, these previous studies have shown relatively low efficiency. In order to restore heart function following injury, mechanisms governing cardiac reprogramming must be elucidated to increase efficiency and maturation of iCMs.
We previously demonstrated that inhibition of pro-fibrotic signaling dramatically increases reprogramming efficiency. Here, we detail methods to achieve a reprogramming efficiency of up to 60%. Furthermore, we describe several methods including flow cytometry, immunofluorescent imaging, and calcium imaging to quantify reprogramming efficiency and maturation of reprogrammed fibroblasts. Using the protocol detailed here, mechanistic studies can be undertaken to determine positive and negative regulators of cardiac reprogramming. These studies may identify signaling pathways that can be targeted to promote reprogramming efficiency and maturation, which could lead to novel cell therapies to treat human heart disease.

Here we present a robust method to reprogram primary embryonic fibroblasts into functional cardiomyocytes through overexpression of GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1, and miR-133 (GHMT2m) alongside inhibition of TGF-&#946; signaling. Our protocol generates beating cardiomyocytes as early as 7 days post-transduction with up to 60% efficiency.

דיכוי של Pro-fibrotic איתות Potentiates בתיווך גורם התכנות של העכבר מתחלקים Fibroblasts לתוך Cardiomyocytes המושרה

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

משלוח הנייד intramyocardial: תוכן בלבבות Murine

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Medicine

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are extremely scarce, but expanded CPCs could be useful for cell therapy. A prerequisite for their use is their ability to differentiate in a controlled manner into the various cardiac lineages using defined and efficient protocols. In addition, upon in vitro expansion, CPCs isolated from patients or preclinical disease models may offer fruitful research tools for the investigation of disease mechanisms.
Current studies use different markers to identify CPCs. However, not all of them are expressed in humans, which limits the translational impact of some preclinical studies. Differentiation protocols that are applicable irrespective of the isolation technique and marker expression will allow for the standardized expansion and priming of CPCs for cell therapy purpose. Here we describe that the priming of CPCs under a low fetal bovine serum (FBS) concentration and low cell density conditions facilitates the endothelial differentiation of CPCs. Using two different subpopulations of mouse and rat CPCs, we show that laminin is a more suitable substrate than fibronectin for this purpose under the following protocol: after culturing for 2 - 3 days in medium including supplements that maintain multipotency and with 3.5% FBS, CPCs are seeded on laminin at &#60;60% confluence and cultured in supplement-free medium with low concentrations of FBS (0.1%) for 20 - 24 hours before differentiation in endothelial differentiation medium. Because CPCs are a heterogeneous population, serum concentrations and incubation times may need to be adjusted depending on the properties of the respective CPC subpopulation. Considering this, the technique can be applied to other types of CPCs as well and provides a useful method to investigate the potential and mechanisms of differentiation and how they are affected by disease when using CPCs isolated from respective disease models.

This protocol describes an endothelial differentiation technique for cardiac progenitor cells. It particularly focuses on how serum concentration and cell-seeding density affect the endothelial differentiation potential.

אינדוקציה של אנדותל התמיינות בתאים לב בתנאים בסרום נמוך

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. Cardiac differentiation from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is modulated by defined signaling pathways that are essential for embryonic heart development. Numerous cardiac differentiation methods on 2-D and 3-D platforms have been developed with various efficiencies and cardiomyocyte yield. This has puzzled investigators outside the field as the variety of these methods can be difficult to follow. Here we present a comprehensive protocol that elaborates robust generation and expansion of patient-specific cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). We first describe a high-efficiency iPSC reprogramming protocol from a patient&#39;s blood sample using non-integration Sendai virus vectors. We then detail a small molecule-mediated monolayer differentiation method that can robustly produce beating cardiomyocytes from most human iPSC lines. In addition, a scalable cardiomyocyte expansion protocol is introduced using a small molecule (CHIR99021) that could rapidly expand patient-derived cardiomyocytes for industrial- and clinical-grade applications. At the end, detailed protocols for molecular identification and electrophysiological characterization of these iPSC-CMs are depicted. We expect this protocol to be pragmatic for beginners with limited knowledge on cardiovascular development and stem cell biology.

Here, we present a protocol to robustly generate and expand human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells.

ייצור והרחבה של קרדיומיוציטים אנושיים מתאי דם היקפיים של מטופלים

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Biology

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...