We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.

כל החיות טופלו תוך ציות מלא לתקנות דניות ואירופאיות. רשות מספר: 2012-15-2934. 1. הכנת המזרק הידראולי שהחול של חוט השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חולדה בוגרת, להשתמש מזרק 10 מ&quot;ל. עבור עכבר מבוגר, להשתמש במזרק 5 מ&quot;ל. עבור גורים, להשתמש במזרק מ&quot;ל 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם קצה פיפטה הלא פילטר מתאים אוניברסלית עבור 2-200 טפטפות μL ידי זמירה סוף גדול של קצה פיפטה עד שהוא משתלב היטב את המזרק. הנח את קצה פיפטה המתואם על המזרק. עבור גורים, השתמש 23 G או מחט דומה במקום קצה פיפטה מתואם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב קר כקרח סטרילי PBS ולהשאיר את המזרק על הקרח עד לשימוש נוסף. </li></ol> 2. המתת חסד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תבצע נקע בצוואר הרחם, כמו זה יהיה להפריע את חוליות עמוד השדרה טיוח שחול בלתי אפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עכברוש / עכבר בוגר, להרדים באמצעות גז כגון CO 2 או isofluRANE. חומרים אלו הם מזיקים. בצע המתת חסד במנדף ולטפל החומרים על פי הנחיות המוסד. (זהירות: CO 2: H280, P410, P403; isoflurane: H361d, P260, P281, P280) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח כי המכרסם מת, להבטיח היעדר רפלקס ידי צובט כפה עם פינצטה. לערוף את המכרסם באמצעות מספריים גדולים. עבור גורים, להרדים על ידי עריפת ראש. </li></ol></li></ol> 3. בידוד של עמוד השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפזרי מים על הפרווה לשלוט השיער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מספריים, לחתוך את הפרווה לאורך עמוד השדרה לכיוון דיסטלי ולבודד את עמוד השדרה על ידי חיתוך משני הצדדים לאורך עמוד השדרה בעבר עצם האגן. חותכים את חוט השדרה distally עד העצם האגן עם זוג מספריים. הערה: הציר מקורי, הזנב הוא כונה כציר הפרוקסימלי-דיסטלי ברחבי הפרוטוקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את עמוד השדרה בעזרת זוג מספריים כדי למנוע את proximal-רוב ואזורים דיסטלי ביותר מכיוון שהן עשויות להפוך את עמוד השדרה מדי בצורת האות S לשחול חוט השדרה מוצלח. ודא כי חוט השדרה גלוי בשני קצותיו. אם חוט השדרה אינו גלוי, חתוך את עמוד השדרה במספריים עד חוט השדרה הופך לגלוי. </li></ol></li></ol> 4. שחול הידראולי של חוט השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי (100 מ&quot;מ קוטר) מלא PBS סטרילית על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את עמוד השדרה על ידי יישום אצבע מצד המכופף (הקצה הפרוקסימלי ביותר) של עמוד השדרה, ובכך ליישר את עמוד השדרה ככל האפשר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור גורים, למנוע כיפוף עמוד השדרה, כמו החוליות תיפגענה טיוח שחול חוט שדרה בלתי אפשרית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קצה פיפטה (23 G מחט עבור גורים, לחילופין 18 G מחט עבור עכברים בוגרים) בקצה הדיסטלי ביותר של עמוד השדרה. אם מוכנס כראוי, הקצה הוא התייצב בחלל השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי עמוד השדרה הוא יישר ככל האפשר. החל לחץ יציב, ו extrude חוט השדרה לתוך צלחת פטרי על קרח. ודא כי חוט השדרה נשמר לחות על קרח על ידי שמירה על אותה ב PBS עד לטיפולה. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> איור 1: מיתרי השדרה נציג. הידראולית הנמתח מיתרי השדרה. משמאל לימין: עכברוש מבוגר, עכבר בוגר, גור עכבר. גדלות מותנהיות בסימן תיבה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> זיהוי 5. של שורש הגבה גרעינים (DRGs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול עמוד השדרה בשני חלקים אורכים שווים באמצעות מספריים ולמקם את עמוד שדרת הפיצול תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את פלח חולית T13 ידי<html> איתור באתר המצורף של costae דיסטלי ביותר על שם לב עמוד השדרה לא לבלבל את costae עם עצבי צלע הסמוכים. Costae דיסטלי ביותר מחוברים החלק הפרוקסימלי של קטע T13 חוליה ואת T13 DRG ממוקם distally כדי T13 החוליה proximally לחוליה L1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה DRGs במקביל לכיוון דיסטלי. עבור חולדה בוגרת, DRGs במקביל מופיע לבן עם גב נראה בבירור ושורשי גחון. עבור עכבר מבוגר, DRGs במקביל מופיע לבן עם גב נראה בבירור ושורשי גחון. עבור גורים, DRGs במקביל מופיע בתחומים ברורים. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> איור 2: זיהוי של DRGs בעמוד השדרה לאחר שחול של חוט השדרה. עמוד השדרה פוצל המאפשר הדמיה של DRGs כפי שצוין על ידי חיצים. שהודגם גור חולדה ועכבר מבוגרים.<html> נ&quot;צ = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. בידוד 6. DRGs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות מספר פטרי (30 מ&quot;מ קוטר) על פי DRGs הספציפי להיות מבודדות, למשל L3, L4, L5. מלא את צלחות פטרי עם PBS סטרילי קר כקרח ומניח אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים מיקרו, הגבי לחתוך ושורשים הגחון קרוב DRGs ככל האפשר כדי לשחרר אותם תוך הימנעות מפגיעה DRGs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הקצה של פינצטה הסגור, בעדינות לגרוף את DRGs ולהעבירם צלחות פטר ממוספרים המקבילות. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> איור 3: נציג מבודד DRGs. משמאל לימין: עכברוש מבוגר, עכבר בוגר, גור עכבר.&quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. עיבוד 7. של רקמות לצורך ניתוח נוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבי סופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודד את אזור הרקמה של עניין, למשל הרחבת המותני חוט השדרה. במידת הצורך, להפריד את חוט השדרה לתוך צדדי ipsilateral ו נגדיים ויותר לתוך הגבי וקרנות גחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רקמת חיץ תמוגה כגון חיץ תמוגה TNE (10 מ&quot;מ טריס-בסיס, 150 מ&quot;מ NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 ב O כפול מזוקקים H 2) המכיל מעכבי האנזים המתאים על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize רקמת כ 30 שניות על הקרח באמצעות העלי שחיקה מכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 16,000 ב 4 ° C ולהשתמש supernatant לעיבוד נוסף על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 5, 6 או לשמור את supernatant ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA-אנליזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הרקמה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד למקום הרקמה בתמיסה ייצוב RNA כדי לייצב את RNA לאחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד RNA על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת RNA ל cDNA ולבצע qPCR פי פרוטוקולים סטנדרטיים 7. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רקמה טרי קפוא (תחולה על חוט השדרה): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן אבקת קרח יבש על ידי כתישת קוביות קרח יבשות עד לסכום המתאים שתי כפות של אבקה. מכסה קוביות קרח יבשות עטופים בבד לכתוש את הקוביות באמצעות פטיש. מניחים נייר כסף (כ 5 ס&quot;מ x 5 ס&quot;מ) על שכבה של קוביות קרח יבש ולכסות את בנייר כסף עם אבקת קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חוט השדרה באזור שנבחר עבור ניתוחים נוספים על אבקת קרח יבש באמצעות פינצטה, ולתת לו snap-הקפאה, ולהעביר את חוט השדרה לצינור קריו. שמור את זה על קרח יבש בכל עת או לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס עד לקדם אותנודואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חוט השדרה על cryostat (-20 ° C). במידת הצורך, חתוך את חוט השדרה בתוך cryostat. מניחים את חוט השדרה בהטמעת החומר בתוך cryostat כדי לצרף אותו לדיסק הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את חוט השדרה בעובי הרצוי, למשל 5 מיקרומטר, ולאסוף על צלחות זכוכית. מחמם את לוחות הזכוכית באצבע ערב לאוסף רקמה מצורפת טוב יותר. שמור את כל רקמת שאריות צינורות קריו ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הסעיפים על צלחות זכוכית בתוך cryostat עד מוכן תיאום פוסט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את הסעיפים על ידי טבילה לתוך 4% PFA במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים פי פרוטוקולים סטנדרטיים 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות קבועות עבור חתך קריו (תחולה על חוט שדרה ו DRGs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן חוט השדרה DRGs ב 4% PFA (2 h עבור חוט השדרה, 1.5 שעות עבור DRGs העכבר 4 שעות עבור DRGs עכברוש) ב4 ° C (חוט שדרה במקום במצב אופקי כדי למנוע ממנה לתקן בעמדה כפופה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה עד 25% w / v סוכרוז הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הרקמה ניתן לאחסן 25% w / v סוכרוז השלים עם כמה טיפות של אזיד הנתרן 10% על מנת למנוע זיהום מיקרוביאלי על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. במידת הצורך, חתוך את חוט השדרה כדי לפצות את ההרחבה המותני רק על לוח סיליקון או דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש הקצה של מגבת נייר, לשאוב תמיסת סוכרוז עודפת מן הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים חצי עובש קריו עם הטבעת חומר. לדחוף את כל בועות לצדדים של עובש קריו עם כלים כגון פינצטה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרקמה על חומר ההטבעה באמצעות פינצטה ולהבטיח את הכיוון לרקמה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את תבנית קריו לחלוטין עם הטבעת חומר ולדחוף כל בועות הכי רחוק מן הרקמה ככל האפשר (למשל באמצעות פינצטה סגור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא צלחת פטרי (100 מ&quot;מקוטר) עם 2-methylbutane. חומר זה מזיק. בצע פעולה זו במנדף ולטפל החומר על פי הנחיות המוסד (זהירות: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי על שכבה של קרח יבש ולהוסיף שתי קוביות קרח יבש כדי בצלחת פטרי. מניחים את התבנית קריו בצלחת פטרי לאפשר את החומר הטבעה להקפיא לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על הרקמות המוטבעות על קרח יבש בכל העת או ב -80 ° C עטופים Parafilm עד לעיבוד נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הרקמה על cryostat (-20 ° C) בעובי הרצוי, למשל 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים פי פרוטוקולים סטנדרטיים 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות קבועות עבור הטבעת פרפין (תחולה על חוט שדרה ו DRGs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן חוט השדרה DRGs ב 4% PFA (2 h עבור חוט השדרה, 1.5 שעות עבור DRGs העכבר 4 שעות עבור DRGs עכברוש) בשעה 4 ° C (חוט השדרה מקוםבמצב אופקי כדי למנוע ממנה לתקן בעמדה כפופה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה עד 25% w / v סוכרוז הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הרקמה ניתן לאחסן 25% w / v סוכרוז השלים עם כמה טיפות של אזיד הנתרן 10% על מנת למנוע זיהום מיקרוביאלי על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודד את אזור הרקמה של עניין, למשל הרחבת המותני חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא חצי עובש הטבעה עם פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצנן את בקצרה עובש ההטבעה ידי הצבתו על אזור הקירור של מכונה ההטבעה להקשיח את פרפין מעט. זה מאפשר מיצוב רקמה טוב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרקמה בכיוון הרצוי עובש ההטבעה. ממלאים את התבנית הטבעה עם פרפין לקרר מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את תבנית הטבעה המכיל פרפין ב 4 ° C למשך הלילה כדי לתת לה להתקשות לחלוטין ולהסיר את בלוק פרפין המכיל את הרקמות מתבנית ההטבעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cut סעיפים oנה microtome בעובי הרצוי, למשל 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים פי פרוטוקולים סטנדרטיים 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord.">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay.">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014)</li><li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Nervous System. , 424-426 (2012).</li><li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy:+implications+for+studies+of+neuropathic+pain.">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li><li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice.">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li><li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+electrophysiology.">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li><li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy.">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אם עמוד השדרה מופר, למשל על ידי נקע בצוואר הרחם, חוט השדרה יהיה לפצל במהלך שחול. אם חוט השדרה לא ניתן נמתח, עמוד השדרה ניתן גזוז מעט בשני קצותיו וניסיון שהחול ניתן לחזור. במקרה חוט השדרה כולו נדרש לניתוח נוסף, כלומר מורכב של הרחבת צוואר הרחם, כמו גם את ההרחבה המותני, עמוד השדרה צריך להיות מטופח רק במעט. אם רק את ההרחבה המותני נדרשת לניתוח נוסף, חוט השדרה צריך להיות מטופח לפי הפרוטוקול הנוכחי. עמוד השדרה צריך להיות יישר באמצעות קצות האצבעות כדי להקל שחול. הפרוטוקול הוא ישים מכרסמים מכל הגילים מודגם כאן על ידי עכבר בוגר (8 שבועות), גור עכבר (5 ימים) חולדה בוגרת (10 שבועות). בהתאם לסוג ומתח חיה, מספר סעיפים ובית החזה המותני עשוי להשתנות 9, </sup&gt; 10, 11. בהתאם חלבונים להיות מנותח, מכרסמים מבוגרים ניתן perfused עם פתרונות אנזים-עיכוב לפני המתת חסד. אם ביצוע ניסוי מעורבים פגיעה עצבית חד צדדי, חוט השדרה ניתן לפצל הצדדים ipsilateral ו הנגדי באמצעות פינצטה Ultra- בסדר מיד לאחר שחול. יתר על כן, כל צד יכול להיות נחלק גב ועל צדדי גחון. הרקמה אז יכול להיות מעובד על ניתוחים נוספים, המערבי סופג למשל. זלוף קיבוע transcardial עם PFA לפני שחול חוט שדרה יש להימנע, כמו זה הופך את חוט השדרה שאינו גמיש ומונע שחול הידראולי חוט שדרה. שחול חוט שדרה הידראולי יקרע את השורשים מגבים. בניסויים שבם שורשים הגבו מצורפים נחוצים, laminectomy מומלץ. יתר על כן, קרומי המוח השדרה הם איבדו ידי שחול הידראולי, אשר יכול להימנע על ידי laminectomy תקן שחול הידראולי של חוט השדרה ובידוד DRG יכול גם להתבצע באמצעות מלאכותי הנוזל השדרתי מחומצן (ACSF) במקום קר כקרח PBS. שימוש ACSF מאפשר שימור של הרקמה המבודדת בסביבה פיזיולוגית טוב יותר, וזה חשוב במיוחד במקרה של הקלטות הבאות אלקטרו 12, 13. חלופה ACSF יכול להיות PBS המכיל 1 גרם / גלוקוז L עבור הדור של תרבויות DRG העיקרי 14. שחול הידראולי של חוט השדרה היא שיטה משמעותית מהר יותר מאשר בדרך המסורתית של בידוד חוט השדרה על ידי laminectomy, צמצום זמן טיפול רקמות ולכן להקטין את הסיכון לנזק חלבון. זלוף עם מקבע לפני לבודד את חוט השדרה על ידי laminectomy עשויה להפחית את הסיכון של נזק לרקמות במהלך דיסקציה במהלך ההסרה הסופית שלחוט השדרה של עמוד השדרה. עם זאת, קיבעון רקמות מונע ישימותה ניתוחים כגון מערבי סופג. תשואות שחול הידראוליות רקמות ניזוק מבני 3 מתאימות למגוון רחב יותר של ניתוחים. זיהוי עקבי של DRGs עלול להיות קשה. עם זאת, זה חיוני עבור בדיקת רקמות, למשל בעקבות פציעת גיד הנשה. על ידי מספור DRGs פי ביחס לוקליזציה שלהם costae, DRGs ניתן לזהות באופן עקבי. הכתמה של רקמת חוט שדרה וכן של DRGs יכולה להיות מותאמת על ידי ביצוע וריאציות טיפול רקמות המאוירות מפורטות צעד פרוטוקול 7.

המטרה הכללית של שיטה זו היא לבודד את חוט השדרה וכן לזהות ולבודד DRGs 1, 2. שחול הידראולי של חוט השדרה היא שיטה מהירה יותר באופן משמעותי מאשר בדרך המסורתית של בידוד חוט השדרה על ידי laminectomy, כלומר על ידי שבירת חוליות עמוד השדרה אחת בכל פעם, ושיטה זו מפחיתה את הסיכון של נזק לרקמות שנגרם על ידי תהליך לנתיחה 3, 4 . DRGs עלול להיות קשה לזהות. זיהוי נכון חשוב מאוד עבור בדיקת רקמות, למשל בעקבות פציעת גיד הנשה. על ידי מספור DRGs פי ביחס לוקליזציה שלהם costae, DRGs ניתן לזהות באופן עקבי. רקמות המבודדים על ידי הטכניקות הפגינו כאן ניתן ליישם במגוון רחב של ניתוחים כולל מערבי סופג 5,6, qPCR 7 והכתים 8 immunohistochemical. כאשר זיהוי DRGs, חשוב לקחת בחשבון כי מספר מגזרי חוט שדרה ידוע להשתנות עם סוג חיה ומתח 9, 10, 11. היתרונות בביצוע שיטה זו בעכברים הם המספר הגבוה של הגירסות זמינות מהונדס גנטיות ואת הוצאות הדיור הנמוכות יחסית. היתרונות בשימוש חולדות הם התשואה גבוהה יחסית רקמות ואם מעורבי פציעות עצבות, ההליך יהיה הקל עם גודל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 14084-08</td>
			<td>For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5427 R</td>
			<td>For centrifugation of homogenized tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># CM 3050 S</td>
			<td>For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 3</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11231-30</td>
			<td>For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 5</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11252-20</td>
			<td>For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 %</td>
			<td>Abbott</td>
			<td># 002185</td>
			<td>For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane GPR rectapur</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 24872.298</td>
			<td>For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># RM 2155</td>
			<td>For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 76243</td>
			<td>For paraffin embedding; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin tissue embedding station</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># EG1160</td>
			<td>For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestel, motor cordless</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># Z359971-1EA</td>
			<td>For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td># 121V</td>
			<td>For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># P7741</td>
			<td>For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor, Phosstop</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 04906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, 1-200 &#956;l, no filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td># 70.1189.105</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Complete</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 05892791001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># R0901</td>
			<td>For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Protect Mini KiT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 74124</td>
			<td>For RNA isolation; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td># REF0203</td>
			<td>For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge</td>
			<td>Bochem</td>
			<td># 4070</td>
			<td>For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, 130 mm cutting edge</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td># 1902.0130</td>
			<td>For isolation of spinal cord (adult rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 15009-08</td>
			<td>For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x</td>
			<td>Leica</td>
			<td># 10446370</td>
			<td>Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td># 10010-015</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 23 G x 1&#34;, 0.6 x 25 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-2325R</td>
			<td>For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-1838S</td>
			<td>Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura</td>
			<td># 4583</td>
			<td>Tssue embedding material for later cryosectionning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNE-lysis buffer</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 10128-582</td>
			<td>For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

הידראולי נמתח מייתרי שדרה להציג משטח ניזוק חלק שמוצג באיור 1. ההגדלה המותני ניתן לזהות בקלות כאזור המעובה של חוט השדרה, התאגרף באיור 1. הגבו ו גחון הצדדים של חוט השדרה יכולים להיות מזוהים על ידי עין על פי המורפולוגיה. באיור 1, בצד הגחון עומד בפני הצופה, המזוהים על ידי קו האמצע אחת ברורה לאורך חוט השדרה כולו. שני קווים רחבים לאורך חוט השדרה לאפשר זיהוי של הצד הגבה. בקצה הדיסטלי-ביותר, equina cauda עשוי לעתים נשאר צמוד חולדות מבוגרי עכברים בוגרים. DRGs הפרט ניתן לזהות רק בעוד ממוקם עמוד השדרה, איור 2. בעקבות הבידוד, איור 3, DRGs הפרט לא ניתן לזהות לפי המראה. במידת הצורך, ולכןחשוב לשמור אותם מופרדים בבירור על הבידוד. לאחר בידוד, חוט השדרה DRGs ניתן לעבד ומוכתמת כפי שמתואר בשלב 7.3 וייצג באיור 4. איור 4 א מראה מכתים immunohistochemical של קטע DRG שבו נוירונים ותאי גלייה בלוויין הסובבת אותם גלויים לעין. על ידי זיהוי נכון של DRG אפשר לנתח את ההשפעה של פציעות גיד הנשה על סומה של נוירון הפצוע וכן על ותאי גלייה בלוויין הסובבת אותם. איור 4 מראה מכתים Nissl של חוט שדרה נמתח הידראולית שבו הרקמה היא תמה כפי שמשתקפים הקצוות החלקים של הסעיף. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> איור 4: קטעי רקמה נציג. א. מכתים immunohistochemical של סעיף DRG. B. Nissl מוכתם section של חוט שדרה נמתח הידראולית. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents at JoVE.com

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

hydraulic-extrusion-spinal-cord-isolation-dorsal-root-ganglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

47.7K Views.  Aarhus University. Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage. 

Video: Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

מדידת השדרה Presynaptic עיכוב בעכברים על ידי הקלטה פוטנציאלית הגבי רוט<em&gt; בVivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video