We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.

Todos os animais foram manipulados em plena conformidade com os regulamentos dinamarqueses e europeus. permissão número: 2012-15-2934. 1. Preparação da Seringa por hidráulico Extrusão da Medula Espinhal <ol><li> Para um rato adulto, use uma seringa de 10 ml. Para um rato adulto, use uma seringa de 5 mL. Para filhotes, use uma seringa mL 2.5. </li><li> Ajuste uma ponteira sem filtro universalmente adequado para 2-200 pipetas ul por aparar a extremidade da ponta da pipeta até que ele se encaixa com firmeza na seringa. Colocar a ponta da pipeta ajustado na seringa. Para filhotes, use um 23 G ou agulha similar ao invés de uma ponteira ajustado. </li><li> Aspirar gelada PBS estéril e deixar a seringa no gelo até à sua utilização. </li></ol> 2. eutanásia <ol><li> Não execute deslocamento cervical, como isso vai perturbar a coluna vertebral tornando extrusão impossível. </li><li> Para o adulto rat / mouse, eutanásia usando gás como o CO 2 ou isofluRane. Estas substâncias são prejudiciais. Executar a eutanásia em um exaustor e lidar com as substâncias de acordo com as diretrizes da instituição. (ATENÇÃO: CO 2: H280, P410, P403; isoflurano: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> Para garantir que o roedor está morto, garantir a ausência de reflexo por beliscar uma pata com uma pinça. Decapitar o roedor usando tesoura grande. Para filhotes, eutanásia por decapitação. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento da coluna vertebral <ol><li> Borrifar água sobre a pele para controlar o cabelo. </li><li> Utilizando um par de tesouras, o corte aberto da pele ao longo da coluna vertebral num sentido distal e isolar a coluna vertebral através do corte em ambos os lados ao longo da coluna vertebral além do osso pélvico. Cortar a medula espinhal distal ao osso pélvico com um par de tesouras. NOTA: O eixo rostral-caudal é denotado como o eixo proximal-distal ao longo do protocolo. <ol><li> Aparar a coluna vertebral utilizando um par de tesouras para evitar o proximal-mais e distais-maioria das áreas que estes podem tornar a coluna vertebral também em forma de S para o sucesso de extrusão medula espinhal. Certifique-se de que a medula espinhal é visível em ambas as extremidades. Se a medula espinhal não é visível, a guarnição da coluna vertebral com uma tesoura até a medula espinhal se torna visível. </li></ol></li></ol> 4. hidráulico Extrusão da Medula Espinhal <ol><li> Coloque uma placa de Petri (100 mm de diâmetro) cheio com PBS estéril em gelo. </li><li> Endireitar a coluna vertebral através da aplicação de um dedo indicador na parte dobrada (proximal a maior parte final) da coluna vertebral, endireitando assim a coluna espinal, tanto quanto possível. <ol><li> Para filhotes, evitar a flexão da coluna vertebral, as vértebras como será interrompido render extrusão medula espinal impossível. </li></ol></li><li> Insira a ponta da pipeta (23 G agulha para filhotes, alternativamente, 18 G agulha para ratos adultos) na distal-most final de coluna vertebral. Se inserido correctamente, a ponta é estabilizada na cavidade medular. </li><li> Certifique-se de que a coluna vertebral é endireitada, tanto quanto possível. Aplicar pressão constante, e expulsar a medula espinhal na placa de Petri sobre gelo. Certifique-se que a medula espinhal é mantido úmido no gelo, mantendo-o em PBS até novo tratamento. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Figura 1: medulas espinhais representativos. Hidraulicamente extrudados medulas espinhais. Esquerda para a direita: rato adulto, rato adulto, filhote de cachorro mouse. alargamentos lombares marcada pela box. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 5. Identificação de gânglios das raízes dorsais (DRG) <ol><li> Dividir a coluna vertebral em duas partes longitudinais iguais, utilizando tesouras e colocar a coluna vertebral dividida sob o microscópio. </li><li> Identificar o segmento T13 vértebra por<html> localizar o local de ligação do distal-mais costae na coluna vertebral prestando atenção para não confundir o costae com os nervos intercostais nas proximidades. Os distal maioria costae estão ligados à parte proximal do segmento vértebra T13 eo T13 DRG está localizado distalmente ao T13 vértebra e proximal ao da vértebra L1. </li><li> Identificar DRGs concomitantes no sentido distal. Para um rato adulto, DRGs concomitantes aparecem em branco com o dorsal claramente visível e raízes ventrais. Para um rato adulto, DRGs concomitantes aparecem em branco com o dorsal claramente visível e raízes ventrais. Para filhotes, DRGs concomitantes aparecem como esferas claras. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Figura 2: Identificação de DRG na coluna vertebral após a extrusão da medula espinhal. A coluna vertebral foi dividido permitindo a visualização de DRGs como indicado pelas setas. Exemplificado pelo rato adulto e filhote de cachorro mouse.<html> ref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 6. Isolamento de DRGs <ol><li> Número pratos de Petri (30 mm de diâmetro) de acordo com as DRGs específicos a ser isolado, por exemplo, L3, L4, L5. Encha as placas de Petri com PBS gelado estéril e colocá-los em gelo. </li><li> Usando micro tesouras, dorsal cortar e raízes ventrais tão perto dos DRGs quanto possível para libertá-los, evitando danificar os DRGs. </li><li> Com a ponta da pinça fechadas, gentilmente retire DRGs e transferi-los para os correspondentes placas de Petri numeradas. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Figura 3: Representante isolado DRGs. Esquerda para a direita: rato adulto, rato adulto, filhote de cachorro mouse.&quot;_blank&quot;&gt; Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 7. processamento de tecidos para análise posterior <ol><li> western blotting <ol><li> Isolar a área de tecido de interesse, por exemplo o alargamento de medula lombar da coluna vertebral. Se necessário, separe a medula espinhal em lados ipsi e contralateral e mais para dorsal e ventral chifres. </li><li> Colocar o tecido em tampão de lise, tais como lise tampão TNE (10 mM de base Tris, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de NP40 em dupla H2O destilada) contendo inibidores de enzimas apropriados em gelo. </li><li> Homogeneizar o tecido durante aproximadamente 30 s sobre gelo utilizando um pilão de trituração mecânica. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 16000 xg, a 4 ° C e utilizar o sobrenadante para processamento adicional de acordo com protocolos padrão 5, 6 ou manter o sobrenadante a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> ARN-análise <ol><li> Isolar o tecido de interesse. </li><li> Colocar imediatamente o tecido em solução de estabilização para estabilizar o ARN ARN para armazenamento. </li><li> Isolar o ARN de acordo com protocolos convencionais 7. </li><li> Converter o ARN em ADNc e executar qPCR de acordo com protocolos convencionais 7. </li></ol></li><li> A imuno-histoquímica <ol><li> Para o tecido fresco congelado (aplicável a medula espinhal): <ol><li> Prepare pó de gelo seco por pulverização cubos de gelo seco a um valor correspondente a duas colheres de sopa de pó. Cobrir cubos de gelo seco em um pano e pulverizar os cubos usando um martelo. Coloque a folha de prata (cerca de 5 cm x 5 cm) sobre uma camada de cubos de gelo seco e cobrir a folha de prata com pó de gelo seco. </li><li> Coloque a área da medula espinhal seleccionado para posteriores análises sobre o pó de gelo seco, usando uma pinça, deixe-o snap-congelamento, e transferir a medula espinhal a um tubo de crio. Mantenha-o em gelo seco em todos os momentos ou armazená-lo a -80 ° C até mais USe. </li><li> Transferir a medula espinal de um criostato (-20 ° C). Se necessário, cortar a medula espinhal dentro do criostato. Coloque a medula espinhal em material de incorporação dentro do criostato, a fim de anexá-lo ao disco de amostra. </li><li> Cortar o cordão espinal na espessura desejada, por exemplo, 5 um, e recolher em placas de vidro. Aqueça as placas de vidro com um dedo imediatamente anteriores à colheita de tecidos para melhor fixação. Manter qualquer tecido restante em tubos de crio a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Deixar as seções sobre placas de vidro dentro do criostato até estar pronto para pós-fixação. </li><li> Pós-fixar as secções por imersão em PFA a 4% durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Realização da coloração de acordo com protocolos padrão 8. </li></ol></li><li> tecido fixado para o seccionamento crio (aplicável a medula espinhal e DRGs) <ol><li> Fix medula espinal e DRGs em PFA a 4% (2 h para a medula espinal, 1,5 h para DRG de rato e 4 h para DRG de rato) em4 ° C (local de medula espinal em posição horizontal para evitar que se fixa numa posição dobrada). </li><li> Transferir o tecido a 25% w / v de sacarose durante a noite a 4 ° C. O tecido pode ser armazenada em 25% w / v de sacarose suplementado com algumas gotas de 10% de azida de sódio para prevenir a contaminação microbiana a 4 ° C até uso posterior. Se necessário, a guarnição da medula espinal para compensar o alargamento lombar, apenas em uma placa de silicone ou semelhante. </li><li> Com a ponta de uma toalha de papel, aspirar a solução de sacarose em excesso a partir do tecido. </li><li> Encher um meio caminho molde crio com material de incorporação. Empurre todas as bolhas para os lados do molde crio com ferramentas tais como pinças fechadas. </li><li> Coloque o tecido sobre o material de incorporação, usando uma pinça e assegurar a orientação tecido desejado. </li><li> Encher o molde com material de crio completamente a incorporação e empurrar quaisquer bolhas tão longe do tecido quanto possível (por exemplo, utilizando pinças fechadas). </li><li> Encha uma placa de Petri (100 mmem diâmetro) com 2-metilbutano. Esta substância é prejudicial. Execute esta etapa em um exaustor e lidar com a substância, de acordo com as diretrizes da instituição (CUIDADO: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Colocar a placa de Petri sobre uma camada de gelo seco e adicionar dois cubos de gelo seco para a placa de Petri. Coloque o molde de crio na placa de Petri e permitir que o material de embutir para congelar completamente. </li><li> Manter o tecido embebido em gelo seco em todos os momentos, ou a -80 ° C envolvido em Parafilm até ulterior processamento. </li><li> Cortar o tecido num crióstato (-20 ° C) na espessura desejada, por exemplo, 5 | im. </li><li> Realização da coloração de acordo com protocolos padrão 8. </li></ol></li><li> tecido fixo para parafina-incorporação (aplicável a medula espinhal e DRGs) <ol><li> Fix medula espinal e DRGs em PFA a 4% (2 h para a medula espinal, 1,5 h para DRG de rato e 4 h para DRG de rato) a 4 ° C (medula espinhal lugarem posição horizontal para evitar que se fixa numa posição dobrada). </li><li> Transferir o tecido a 25% w / v de sacarose durante a noite a 4 ° C. O tecido pode ser armazenada em 25% w / v de sacarose suplementado com algumas gotas de 10% de azida de sódio para prevenir a contaminação microbiana a 4 ° C até uso posterior. </li><li> Isolar a área de tecido de interesse, por exemplo o alargamento de medula lombar da coluna vertebral. </li><li> Preencher um meio caminho molde a incorporação com parafina. </li><li> Arrefecer o molde brevemente a incorporação, colocando-o sobre a área de refrigeração da máquina incorporação para endurecer a parafina ligeiramente. Isto permite um melhor posicionamento do tecido. </li><li> Colocar o tecido na orientação desejada no molde incorporação. Encha o molde de incorporação com parafina e se refrescar imediatamente. </li><li> Coloque o molde contendo a incorporação de parafina, a 4 ° C durante a noite para deixar endurecer completamente e remover o bloco de parafina contendo o tecido a partir do molde de incorporação. </li><li> seções de corte Snd micrótomo na espessura desejada, por exemplo, 5 | im. </li><li> Realização da coloração de acordo com protocolos padrão 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord.">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay.">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014)</li><li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Nervous System. , 424-426 (2012).</li><li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy:+implications+for+studies+of+neuropathic+pain.">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li><li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice.">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li><li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+electrophysiology.">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li><li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy.">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Se a coluna vertebral é perturbado, por exemplo, por deslocamento cervical, da medula espinhal vai dividir durante a extrusão. Se a medula espinal não pode ser extrudido, a coluna vertebral pode ser ligeiramente cortadas em ambas as extremidades e a tentativa de extrusão pode ser repetida. No caso de ser necessária toda a medula espinal para análise posterior, isto é, que consiste no alargamento do colo do útero, bem como o alargamento lombar, a coluna vertebral só deve ser ligeiramente cortadas. Se apenas o alargamento lombar é necessário para uma análise mais aprofundada, a medula espinhal deve ser aparado de acordo com o presente protocolo. A coluna vertebral deve ser esticado usando a ponta dos dedos para facilitar a extrusão. O protocolo é aplicável para roedores de todas as idades e é aqui exemplificada por um rato adulto (8 semanas), um cachorro rato (5 dias) e um rato adulto (10 semanas). Dependendo do tipo de animal e tensão, o número de seções torácica e lombar pode variar 9, </sup&gt; 10, 11. Dependendo das proteínas a ser analisada, roedores adultos pode ser perfundido com soluções inibidoras da enzima antes da eutanásia. Se realizar um experimento envolvendo a lesão do nervo unilateral, a medula espinhal podem ser divididos em lados ipsi e contralaterais, usando uma pinça ultra-finas imediatamente após a extrusão. Além disso, cada um dos lados pode ser dividida em lados dorsal e ventral. O tecido pode então ser processada para análises posteriores, por exemplo, transferência de Western. Transcardial perfusão-fixação com PFA antes da extrusão da medula espinal deve ser evitada, já que isto torna a medula espinal não-flexível e impede medula espinal extrusão hidráulico. Hidráulica extrusão medula espinhal vai arrancar as raízes dorsais. Para experiências em que são necessários raízes dorsais em anexo, laminectomia é recomendado. Além disso, as meninges espinais são perdidas por extrusão hidráulico, o que pode ser evitado por laminectomia padrão extrusão hidráulico da medula espinal e do isolamento de DRG também poderia ser realizada utilizando oxigenado fluido cerebrospinal artificial (ACSF) em vez de PBS gelado. O uso de ACSF permite a preservação do tecido isolado em um melhor ambiente fisiológico, o que é particularmente importante no caso de gravações electrofisiológicos subsequentes 12, 13. Uma alternativa para ACSF poderia ser PBS contendo 1 g / l de glicose para a produção de culturas de DRG primário 14. extrusão hidráulico da medula espinal é um método significativamente mais rápido do que a forma tradicional de isolamento da medula espinal por laminectomia, reduzindo o tempo de tratamento de tecido e, portanto, diminuindo o risco de danos proteína. A perfusão com um fixador, antes de se isolar a medula espinal por laminectomia pode reduzir o risco de danos no tecido durante a dissecção e durante a remoção final dada medula espinal a partir da coluna vertebral. No entanto, a fixação do tecido impede a sua aplicabilidade a análises, tais como transferência de Western. Rendimentos de extrusão hidráulicos estruturalmente tecido danificado 3 adequado para uma ampla gama de análises. identificação consistente de DRGs pode ser difícil. No entanto, isso é essencial para a análise de tecido, por exemplo, após lesão do nervo ciático. Numerando os DRGs de acordo com a sua localização em relação ao costae, DRGs pode ser identificado de forma consistente. Coloração de tecidos da medula espinal, bem como de DRGs podem ser optimizadas efectuando as variações de tratamento de tecido ilustradas descritas no protocolo de passo 7.

O objectivo geral do presente método é isolar a medula espinal, bem como para identificar e isolar DRGs 1, 2. Extrusão hidráulico da medula espinal é um método significativamente mais rápido do que a forma tradicional de isolamento da medula espinal por laminectomia, ou seja, quebrar as vértebras da coluna vertebral, um de cada vez, e este método reduz o risco de dano tecidual causado pelo processo de dissecção 3, 4 . DRGs podem ser difíceis de identificar. A correta identificação é muito importante para a análise do tecido, por exemplo, após a lesão do nervo ciático. Numerando os DRGs de acordo com a sua localização em relação ao costae, DRGs pode ser identificado de forma consistente. Tecido isolado pelas técnicas demonstradas aqui pode ser aplicado a uma ampla gama de análises incluindo Western blotting 5,6, 7 e qPCR coloração imuno-histoquímica 8. Ao identificar DRGs, é importante ter em conta que o número de segmentos da medula espinhal é conhecida a variar com o tipo e estirpe de animais 9, 10, 11. As vantagens de executar este método em ratinhos são o elevado número de variantes geneticamente modificados disponíveis e as despesas relativamente baixas de habitação. As vantagens em utilizar os ratos são o rendimento do tecido relativamente alta e se envolvendo lesões nervosas, o procedimento será facilitado com o tamanho.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 14084-08</td>
			<td>For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5427 R</td>
			<td>For centrifugation of homogenized tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># CM 3050 S</td>
			<td>For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 3</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11231-30</td>
			<td>For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 5</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11252-20</td>
			<td>For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 %</td>
			<td>Abbott</td>
			<td># 002185</td>
			<td>For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane GPR rectapur</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 24872.298</td>
			<td>For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># RM 2155</td>
			<td>For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 76243</td>
			<td>For paraffin embedding; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin tissue embedding station</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># EG1160</td>
			<td>For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestel, motor cordless</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># Z359971-1EA</td>
			<td>For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td># 121V</td>
			<td>For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># P7741</td>
			<td>For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor, Phosstop</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 04906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, 1-200 &#956;l, no filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td># 70.1189.105</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Complete</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 05892791001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># R0901</td>
			<td>For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Protect Mini KiT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 74124</td>
			<td>For RNA isolation; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td># REF0203</td>
			<td>For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge</td>
			<td>Bochem</td>
			<td># 4070</td>
			<td>For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, 130 mm cutting edge</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td># 1902.0130</td>
			<td>For isolation of spinal cord (adult rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 15009-08</td>
			<td>For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x</td>
			<td>Leica</td>
			<td># 10446370</td>
			<td>Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td># 10010-015</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 23 G x 1&#34;, 0.6 x 25 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-2325R</td>
			<td>For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-1838S</td>
			<td>Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura</td>
			<td># 4583</td>
			<td>Tssue embedding material for later cryosectionning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNE-lysis buffer</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 10128-582</td>
			<td>For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Medulas espinhais hidraulicamente extrudido apresentar uma superfície lisa sem danos mostrado na Figura 1. O alargamento lombar pode ser facilmente identificadas como a área mais espessa da medula espinal, encaixotado na Figura 1. Os lados dorsais e ventrais da espinal medula pode ser identificada a olho nu de acordo com a morfologia. Na Figura 1, o lado ventral está voltada para o observador, identificável por uma linha média clara ao longo de toda a medula espinhal. Duas linhas mais amplas ao longo da medula espinal permitir a identificação do lado dorsal. No distal mais-end, a cauda eqüina pode, por vezes permanecem ligados em ratos adultos e ratos adultos. DRGs individuais só podem ser identificados, enquanto localizado na coluna vertebral, a Figura 2. A seguir ao isolamento, A Figura 3, os DRGs individuais não podem ser identificados pela aparência. Se necessário, é, por conseguinte,importante mantê-los claramente separados no isolamento. Após o isolamento, a medula espinal e DRGs podem ser processados e corados tal como descrito no passo 7.3 e representada na Figura 4. Figura 4a mostra uma coloração imuno-histoquímica de uma seção DRG onde os neurônios e suas células gliais satélite envolvente são claramente visíveis. Pela identificação correta do DRG é possível analisar o efeito de lesões do nervo ciático na soma do neurônio ferido, bem como sobre as suas células gliais por satélite circundantes. A Figura 4b mostra uma coloração de Nissl de uma medula espinal hidraulicamente extrudido em que o tecido está intacta tal como reflectido pelas extremidades lisas da secção. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Figura 4: cortes de tecido representativo. Uma. coloração imuno-histoquímica da secção DRG. B. Nissl manchado sectioN de medula espinal hidraulicamente extrudida. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents at JoVE.com

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Extrusão hidráulico da medula espinhal e Isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

hydraulic-extrusion-spinal-cord-isolation-dorsal-root-ganglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

47.6K visualizações.  Aarhus University. Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage. 

Vídeo: Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Cromatina imunoprecipitação de Tissue Dorsal Root Gânglios seguintes Lesão Axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Medindo Spinal pré-sináptica Inibição em Ratos por raiz dorsal Gravação Potencial<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modelagem de Cancerous Neural Invasion: o gânglio Modelo de raiz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...