We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.

Bütün hayvanlar Danimarka ve Avrupa yönetmeliklerine tam uyum içinde ele alınmıştır. İzin numarası: 2012-15-2934. Omurilik Hidrolik eldesi için Şırınga 1. Hazırlık <ol><li> bir yetişkin farenin, bir 10 ml şırınga kullanın. Yetişkin fare için, 5 ml şırınga kullanın. Yavruların için, 2.5 ml şırınga kullanın. </li><li> o şırıngaya sıkıca oturana kadar pipet büyük ucunu kırparak 2-200 uL pipetler için evrensel uygun olmayan bir filtre pipet ayarlayın. şırınga düzeltilmiş pipet yerleştirin. Yavruların için ayarlanmış bir pipet yerine 23 G veya benzeri iğne kullanın. </li><li> Aspire buz soğukluğunda steril PBS ve sonraki kullanıma kadar buz üzerinde şırınga bırakın. </li></ol> 2. Ötenazi <ol><li> Bu imkansız ekstrüzyon render sırt omurgasını rahatsız edecek şekilde, servikal dislokasyon yapmayın. </li><li> Yetişkin sıçan / fare için, örneğin CO 2 veya isoflu olarak gaz kullanılarak euthanizerane. Bu maddeler zararlıdır. Davlumbaz ötanazi gerçekleştirin ve kurum yönergelerine göre maddeleri işlemek. (DİKKAT: CO 2: H280, P410, P403; izofluran: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> kemirgen ölü olduğundan emin olmak için, cımbız ile bir pençe sıkıştırarak refleksinin yokluğu sağlamak. Büyük makas kullanılarak kemirgen başını kesmek. Yavruların için, boyunları vurularak euthanize. </li></ol></li></ol> Spinal sütun 3. İzolasyon <ol><li> saç kontrol etmek için kürk üzerine su serpin. </li><li> makas kullanılarak, bir uzak doğrultuda omurga boyunca kürk kesilerek açılır ve pelvis kemiği, son omurga boyunca her iki tarafta da kesilerek omuriliğe izole eder. bir makas ile pelvis kemiğinin distalinde omuriliği kesin. NOT: rostral-kaudal eksen protokol boyunca proksimal-distal ekseni olarak gösterilir. <ol><li> proximal- önlemek için bir makas kullanarak omuriliğe Trimbunlar gibi en distal-çoğu alanlarda çok başarılı omurilik ekstrüzyon için S-şekilli omuriliğe hale getirebilir. Omurilik iki ucunda görünür olduğundan emin olun. Omurilik görünür değilse omurilik görünür hale gelinceye kadar, makasla omurga düzeltin. </li></ol></li></ol> Omurilik 4. Hidrolik eldesi <ol><li> Buz üzerinde, steril PBS ile doldurulmuş bir petri çanağı (100 mm çapında) yerleştirilir. </li><li> böylece mümkün olduğunca fazla omurga düzleştime, omurganın bükük kısmı (proksimal-en sonu) bir parmağı uygulanarak omuriliğe düzleştirin. <ol><li> Omurlar imkansız omurilik ekstrüzyon render bozulacak şekilde yavruların için, omurga eğilmesini önlemek. </li></ol></li><li> pipet omurganın uzak-en sonunda (yavruların 23 G iğne, yetişkin fareler için alternatif 18 G iğne) yerleştirin. doğru takılmış ise, ucu omurilik boşluğuna stabilize edilir. </li><li> omurga mümkün olduğu kadar düzleştirilmiş olduğundan emin olun. sabit bir basınç uygulayın ve buz üzerinde Petri kabı içine omurilik a&#39;ya. Omurilik daha sonraki işlemler kadar PBS içinde tutarak buz üzerinde nemli tutulan olduğundan emin olun. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Şekil 1: Temsilci omurilik. Hidrolik omurilik presten. yetişkin sıçan, yetişkin fare, fare yavru: Soldan sağa. Lomber büyütme kutu ile işaretlenmiş. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Dorsal Kök Ganglia 5. Tanımlama (DRG) <ol><li> makas kullanılarak iki eşit uzunlamasına parça omurga bölünmüş ve mikroskop altında bölünmüş omuriliğe yerleştirin. </li><li> tarafından T13 vertebra segmenti tanımlamak<html> omurga ödeyen dikkat distal-en costadan bağlanma sitesini yerini yakın interkostal sinirler ile costae şaşırtmak için değil. Distal-en costae proksimal T13 vertebra segmenti parçası ve T13 DRG L1 vertebra için distal vertebra T13 ve proksimal bulunduğu bağlıdır. </li><li> uzak yönde birlikte DRG&#39;ler tanımlar. Yetişkin bir sıçan için, eşlik eden DRG açıkça görülebilir dorsal ve ventral kökleri beyaz görünür. Yetişkin bir fare için, eşlik eden DRG açıkça görülebilir dorsal ve ventral kökleri beyaz görünür. Yavruların için, eşlik eden DRG net küreler görünür. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Şekil 2: omuriliğin ekstrüzyon sonrası omurga TİG&#39;lerin tanımlanması. omurga oklarla gösterildiği gibi TİG&#39;lerin görselleştirme izin bölünmüş edilmiştir. Yetişkin sıçan ve fare yavru ile örneklenen.<html> ref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. DRG&#39;ler 6. İzolasyonu <ol><li> Belirli DRG&#39;lerde göre Sayı Petri kapları (çapı 30 mm), örneğin L3, L4, L5, izole edilmesi. buz gibi soğuk steril PBS ile Petri kapları doldurun ve buz üzerine koyun. </li><li> DRG&#39;ler zarar kaçınarak mümkün olduğunca DRG&#39;lerde yakın mikro makas, kesip dorsal ve ventral kökleri kullanarak onları serbest bırakmak için. </li><li> Kapalı cımbız ucu ile hafifçe DRG&#39;ler kepçe ve ilgili sayılı Petri aktarabilirsiniz. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Şekil 3: Temsilci DRG&#39;ler izole edilmiştir. yetişkin sıçan, yetişkin fare, fare yavru: Soldan sağa.&quot;_blank&quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Daha fazla Analizi Doku 7. İşleme <ol><li> Western lekeleme <ol><li> Omurilik lomber genişleme örneğin, ilgi doku alanını izole edin. Gerekirse, ipsilateral ve kontralateral tarafta içine ve daha dorsal ve ventral boynuz içine omurilik ayırın. </li><li> Bu buz üzerinde uygun bir enzim inhibitörleri ihtiva eden (iki kez damıtılmış H2 O, 10 mM Tris-baz, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA,% 1 NP40) TNE parçalama tamponu gibi liziz tamponu içinde doku yerleştirin. </li><li> mekanik öğütme havaneli kullanılarak buz üzerinde yaklaşık 30 saniye boyunca doku homojenize edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 16,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj ve standart protokoller 5, 6&#39;ya uygun daha fazla işlem için süpernatan kullanmak ya da daha fazla, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de süpernatan tutun. </li></ol></li><li> RNA analizi <ol><li> ilgi doku izole. </li><li> Hemen depolama RNA&#39;yı stabilize RNA stabilizasyonu solüsyon içerisinde dokuyu yerleştirin. </li><li> Standart protokollere 7&#39;ye göre RNA izole. </li><li> CDNA RNA dönüştürmek ve standart protokoller 7&#39;ye göre qPCR gerçekleştirin. </li></ol></li><li> immünohistokimya <ol><li> (Omurilik için geçerlidir) taze donmuş dokular için: <ol><li> toz, iki çorba kaşığı tekabül eden bir miktarda kuru buz küpleri toz haline kuru buz tozu hazırlamak. Bir bez kuru buz küpleri Kapak ve bir çekiç kullanarak küpleri pulverize. Kuru buz bir tabakası üzerinde gümüş folyo (yaklaşık 5 cm x 5 cm) yerleştirilir ve kuru buz tozu gümüş folyo kapağı. </li><li> cımbız kullanarak kuru buz tozu ile ilgili daha fazla analiz için seçilen omurilik alanını yerleştirin, bu ek bileşenini donma ve cryo tüp omurilik transfer edelim. her zaman kuru buz üzerinde tutun ya da bizi daha da kadar -80 ° C saklayıne. </li><li> Bir kriostada omurilik aktarın (-20 ° C). Gerekirse, kriyostat içinde omurilik kırpın. örnek diske bağlamak için kriyostat içinde gömülü malzemenin içinde omuriliği yerleştirin. </li><li> Örneğin 5 mikron, istenilen kalınlıkta omuriliği kesilmiş ve cam plakalar üzerinde toplamak. Daha iyi eki için doku koleksiyonuna hemen önce bir parmak ile cam plakalar ısıtın. sonraki kullanıma kadar -80 ° C &#39;de kriyo boruları içinde kalmış herhangi bir doku tutun. </li><li> post-sabitleme için hazır olana kadar kriyostat içinde cam plakalar üzerine bölümleri bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 PFA içine daldırılarak kesitlere düzeltin. </li><li> Standart protokollere 8&#39;e göre boyama gerçekleştirin. </li></ol></li><li> (Spinal kord ve DRG&#39;lerde için geçerlidir) cryo kesit için sabit doku <ol><li> % 4 PFA (omurilik 2 H, fare DRG&#39;ler 1.5 saat ve sıçan DRG&#39;ler 4 saat), spinal kordon ve DRG&#39;ler saptamak4 ° C (yatay konuma omurilik bükülmüş pozisyonda sabitlenmesi önlemek için). </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece / hac sakaroz% 25 ağ doku aktarın. Doku daha sonra kullanmak kadar 4 ° C &#39;de mikrobiyal kirlenmenin önlenmesi için,% 10 sodyum azid birkaç damla ile takviye / hac sakaroz% 25 ağ saklanabilir. Gerekirse, sadece silikon tahta veya benzeri lomber genişleme telafi etmek için omurilik kırpın. </li><li> Bir kağıt havlu ucunu kullanarak, doku fazlalığı sakaroz çözeltisini aspire. </li><li> gömülü malzemenin bir cryo kalıp yarım doldurun. Böyle kapalı cımbız gibi araçlarla kriyo kalıp kenarlarına kabarcıkları itin. </li><li> cımbız kullanarak gömülü malzemenin üzerine doku yerleştirin ve istenen doku yönlendirmesini sağlamak. </li><li> Gömülü malzemenin tamamen cryo kalıp doldurun ve olduğunca uzak (kapalı cımbız kullanarak örneğin) mümkün olduğunca dokudan kabarcıkları itin. </li><li> (100 mm Petri doldurun2-metilbütan çapında) &#39;de. Bu madde zararlıdır. Davlumbaz bu adımı gerçekleştirin ve kurum kurallarına göre maddeyi işlemek (DİKKAT: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Kuru buz tabakası Petri tabağına yerleştirin ve Petri kabı, iki kuru buz küpleri ekleyin. Petri kabındaki cryo kalıp yerleştirin ve gömme malzeme tamamen dondurmak için izin. </li><li> Her zaman kuru buz üzerinde gömülü doku tutun veya daha fazla işlem kadar Parafilm sarılmış -80 ° C&#39;de ilave edildi. </li><li> Bir kriyostat (-20 ° C) istenen kalınlık doku, örneğin, 5 um kesin. </li><li> Standart protokollere 8&#39;e göre boyama gerçekleştirin. </li></ol></li><li> (Spinal kord ve DRG&#39;lerde için geçerlidir) parafin katıştırma için sabit doku <ol><li> 4 ° C (yer omurilik% 4 PFA (omurilik için 2 saat, fare DRG&#39;lerde için 1.5 saat ve sıçan DRG&#39;lerde için 4 saat) omuriliği ve DRG&#39;ler Fixyatay konumda) bükülmüş pozisyonda sabitlenmesi engellemek için. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece / hac sakaroz% 25 ağ doku aktarın. Doku daha sonra kullanmak kadar 4 ° C &#39;de mikrobiyal kirlenmenin önlenmesi için,% 10 sodyum azid birkaç damla ile takviye / hac sakaroz% 25 ağ saklanabilir. </li><li> Omurilik lomber genişleme örneğin, ilgi doku alanını izole edin. </li><li> parafin ile gömme kalıp yarım doldurun. </li><li> hafifçe parafin sertleşmesine gömme makinenin soğutma alanında yerleştirerek gömme kalıp kısaca serinleyin. Bu iyi bir doku konumlandırma için izin verir. </li><li> gömme kalıp içinde istenilen yönde doku yerleştirin. parafin ile gömme kalıp doldurun ve hemen serin. </li><li> tamamen sertleşmeye ve gömme kalıp doku içeren parafin blok kaldırmak izin 4 ° C gece boyunca parafin içeren gömme kalıp yerleştirin. </li><li> Kes bölümler oistenilen kalınlıkta na mikrotom, örneğin 5 mikron. </li><li> Standart protokollere 8&#39;e göre boyama gerçekleştirin. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord.">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay.">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014)</li><li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Nervous System. , 424-426 (2012).</li><li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy:+implications+for+studies+of+neuropathic+pain.">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li><li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice.">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li><li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+electrophysiology.">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li><li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy.">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Omurga servikal dislokasyon örneğin, rahatsız edilirse, omurilik ekstrüzyon sırasında bölünmüş olacaktır. spinal kord ekstrüde edilemiyorsa, omurga her iki uçta da biraz kesilmiş olabilir ve ekstrüzyon girişimi tekrarlanabilir. Durumda, tüm omurga yani servikal genişleme ve bel genişliğine oluşan daha fazla analiz için gerekli olan, omurga sadece biraz kesilmiş olmalıdır. Sadece bel genişliğine, daha fazla analiz için gerekli olan ise, omurilik, bu protokole göre kesilmiş olmalıdır. Omurga ekstrüzyon kolaylaştırmak için parmak uçlarınızı kullanarak doğruldu gerekir. Protokol her yaştan kemirgen uygulanabilir ve burada bir yetişkin fare (8 hafta), yavru bir fare (5 gün) ve bir yetişkin farenin (10 hafta) ile tarif edilmektedir. Hayvan Çeşidi ve şekil ile ilgili olarak, torasik ve lumbar bölümlerin sayısı, 9 değişebilir </sup&gt; 10, 11. protein bağlı olarak, yetişkin kemirgenler Ötenazi öncesinde enzim inhibe edici çözümler ile perfüze edilebilir, analiz edilecek. tek taraflı sinir hasarı içeren bir deney gerçekleştirmek ise, omurilik hemen ekstrüzyon sonrası ultra-ince cımbız kullanarak ipsilateral ve kontralateral tarafta ayrılabilir. Dahası, her yan dorsal ve ventral tarafı ayrılabilir. Doku daha sonra analiz, örneğin Western blot için işlenebilir. Bu, omurilik esnek olmayan hale ve omurilik hidrolik ekstrüzyonu engellemektedir Omurilik ekstrüzyon öncesinde PFA transcardial perfüzyon fikse kaçınılmalıdır. Hidrolik omurilik ekstrüzyon dorsal kökleri koparmak olacaktır. Ekli dorsal köklerin gerekli deneyler için, laminektomi tavsiye edilir. Ayrıca, omurga beyin zarı, standart laminektomi önlenebilir hidrolik ekstrüzyon ile kaybolur spinal kord ve DRG izolasyon hidrolik ekstrüzyon yerine de buz soğukluğunda PBS oksijenlenmiş yapay serebrospinal sıvı (ACSF) ile gerçekleştirilebilir. ACSF kullanımı takip eden elektrofizyolojik kayıtları 12, 13 söz konusu olduğunda özellikle önemlidir, daha iyi bir fizyolojik bir ortamda, izole dokusunun sağlar. ACSF için alternatif bir PBS, 1 g / primer DRG kültürler 14 oluşturulması için L glikoz ihtiva eden olabilir. Omuriliğin hidrolik ekstrüzyon laminektomi ile omurilik izolasyonu geleneksel şekilde, doku işleme süresini azaltan ve bu nedenle protein hasarı riskini azaltmak daha önemli ölçüde daha hızlı bir yöntemdir. bir sabitleyici ile perfüzyon önce Diseksiyon sırasında ve son çıkarılması sırasında doku hasarı riskini azaltabilir laminektomi ile omurilik izole etmekomurilikten omurilik. Ancak, doku tespit gibi Western blot olarak analizlere uygulanabilirliğini engellemektedir. Hidrolik ekstrüzyon verimi analizler daha geniş bir aralığı için uygun yapısal hasar görmemiş doku 3. DRG&#39;ler Tutarlı kimlik zor olabilir. Bununla birlikte, bu, örneğin siyatik sinir zedelenmesini takiben, doku analizi için gereklidir. costadan kendi lokalizasyon göreli göre DRG&#39;ler numaralama ile, DRG tutarlı tespit edilebilir. DRG&#39;lerin gibi omurilik dokusu boyama protokolü Adım 7&#39;de tarif gösterilen doku işlem varyasyonları gerçekleştirerek optimize edilebilir.

Bu yöntem genel amacı omurilik izole etmek için ayrıca, 2 DRG&#39;ler 1 belirlemek ve izole etmek. Omuriliğin hidrolik ekstrüzyon aynı anda spinal vertebra bir kırarak yani laminektomi ile omurilik izolasyonu, geleneksel bir şekilde daha önemli ölçüde daha hızlı bir yöntemdir ve bu yöntem diseksiyon işlemi 3, 4 yol açtığı doku hasarı riskini azaltır . DRG belirlemek zor olabilir. Doğru tanımlama, örneğin siyatik sinir yaralanmasından sonra, doku analizi için son derece önemlidir. costadan kendi lokalizasyon göreli göre DRG&#39;ler numaralama ile, DRG tutarlı tespit edilebilir. Burada gösterilen tekniklerle izole edilmiş bir doku, Western blotting 5 de dahil olmak üzere analiz, geniş bir aralığına uygulanabilmektedir6, qPCR 7 ve immünohistokimyasal 8. DRG&#39;ler belirlenmesi, omurilik segment sayısı hayvan türü ve zorlanma 9, 10, 11 ile değiştiği bilinmektedir dikkate almak önemlidir. Farelerde bu yöntemin gerçekleştirilmesi avantajları mevcut genetiği değiştirilmiş çeşitleri ve nispeten düşük konut giderlerinin yüksek sayısıdır. fareler kullanarak avantajları nispeten yüksek doku verim ve sinir yaralanmaları içeren eğer, prosedür boyutu ile hafifletti olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 14084-08</td><td>For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td># 5427 R</td><td>For centrifugation of homogenized tissue</td></tr><tr><td>Cryostat microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td># CM 3050 S</td><td>For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Forceps, Dumont, # 3</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11231-30</td><td>For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used</td></tr><tr><td>Forceps, Dumont, # 5</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11252-20</td><td>For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100%</td><td>Abbott</td><td># 002185</td><td>For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td></tr><tr><td>Iso-pentane GPR rectapur</td><td>VWR chemicals</td><td># 24872.298</td><td>For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td># RM 2155</td><td>For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Paraffin wax pellets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 76243</td><td>For paraffin embedding; Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Paraffin tissue embedding station</td><td>Leica Biosystems</td><td># EG1160</td><td>For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Pellet pestel, motor cordless</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># Z359971-1EA</td><td>For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Petri dish, 35 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td># 121V</td><td>For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used</td></tr><tr><td>Petri dish, 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># P7741</td><td>For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor, Phosstop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 04906845001</td><td>Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Pipette tip, 1-200 &amp;mu;L, no filter</td><td>Sarstedt</td><td># 70.1189.105</td><td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Protease inhibitor, Complete</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 05892791001</td><td>Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>RNAlater solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># R0901</td><td>For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Rneasy Protect Mini KiT</td><td>Qiagen</td><td># 74124</td><td>For RNA isolation; Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11</td><td>Swann-Morton</td><td># REF0203</td><td>For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used</td></tr><tr><td>Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge</td><td>Bochem</td><td># 4070</td><td>For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used</td></tr><tr><td>Scissors, 130 mm cutting edge</td><td>Hounisen</td><td># 1902.0130</td><td>For isolation of spinal cord (adult rat)</td></tr><tr><td>Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 15009-08</td><td>For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Standard syringes, 2.5 mL, 5 mL, 10 mL</td><td>Terumo</td><td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td><td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1X and eyepiece 10X</td><td>Leica</td><td># 10446370</td><td>Other manufacturer/type may be used</td></tr><tr><td>Sterile PBS</td><td>GIBCO</td><td># 10010-015</td><td>For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols</td></tr><tr><td>Syringe needle 23 G x 1&quot;, 0.6 x 25 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-2325R</td><td>For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used</td></tr><tr><td>Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-1838S</td><td>Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used</td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td># 4583</td><td>Tssue embedding material for later cryosectionning</td></tr><tr><td>TNE-lysis buffer</td><td>VWR chemicals</td><td># 10128-582</td><td>For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols</td></tr></tbody></table>

hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Hidrolik ekstrüde omurilikler, Şekil 1 &#39;de gösterilen düz bir hasarsız bir yüzey gösterir. Bel genişliğine kolaylıkla Şekil 1 &#39;de kutulu omurilik kalınlaştırılmış alanı olarak tanımlanabilir. omurilik dorsal ve ventral taraf morfolojiye göre göz ile tespit edilebilir. Şekil 1&#39;de, ventral tarafı tüm omurilik boyunca açık bir orta hat ile tanımlanabilir görüntüleyici karşı karşıyadır. omurilik boyunca iki geniş çizgiler sırt tarafında tanımlanmasını sağlar. uzak-en sonunda, KES zaman yetişkin farelerde ve yetişkin farelerde takılı kalabilir. Omurga, Şekil 2&#39;de yer alan ise bireysel DRG&#39;ler yalnızca tespit edilebilir. Izolasyon, Şekil 3 ardından, bireysel DRG görünüm tarafından tespit edilemez. Gerekirse, bu nedenle,Onları tutmak için önemlidir açıkça izolasyon üzerine ayrılmış. Aşama 7.3&#39;deki ve Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi izole edildikten sonra, omurilik ve DRG işlenir ve boyandı. Şekil 4a nöronlar ve onların çevresindeki uydu glial hücreler açıkça görülebilir bir DRG bölümünün bir immunohistokimyasal boyanma gösterir. DRG doğru tanımlanması ile o yaralı nöronun soma yanı sıra çevrelerindeki uydu glial hücreler üzerinde siyatik sinir yaralanması etkisini analiz etmek mümkündür. Şekil 4b bölümün düzgün kenarlı tarafından yansıtılan doku bozulmamış bir hidrolik presten omuriliğin bir Nissl boyamasını göstermektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Şekil 4: Örnek doku bölümleri. Bir. DRG bölümünün immünohistokimyasal boyama. B. Nissl lekeli sectiohidrolik ekstrude omurilik n. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents at JoVE.com

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Kemirgenler dorsal kök gangliyon Omurilik ve İzolasyon hidrolik eldesi

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

hydraulic-extrusion-spinal-cord-isolation-dorsal-root-ganglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

47.9K Görüntüleme.  Aarhus University. Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage. 

Video: Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Nörobilim

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Dorsal Kök Ganglion Makrofajlarının Hızlı İzolasyon

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

DRG Kültürlerinde Nöronal Aşırı Duyarlılığı İncelemek için İleri İn Vitro Model

Harvesting, Embedding, and Culturing Dorsal Root Ganglia in Multi-compartment Devices to Study Peripheral Neuronal Features

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia (DRG). One proposed cause of this hypersensitivity is associated with the interaction between immune cells in the peripheral tissue and neurons. In vitro models have provided foundational knowledge in understanding how these mechanisms result in nociceptor hypersensitivity. However, in vitro models face the challenge of translating efficacy to humans. To address this challenge, a physiologically and anatomically relevant in vitro model has been developed for the culture of intact dorsal root ganglia (DRGs) in three isolated compartments in a 48-well plate. Primary DRGs are harvested from adult Sprague Dawley rats after humane euthanasia. Excess nerve roots are trimmed, and the DRG is cut into appropriate sizes for culture. DRGs are then grown in natural hydrogels, enabling robust growth in all compartments. This multi-compartment system offers anatomically relevant isolation of the DRG cell bodies from neurites, physiologically relevant cell types, and mechanical properties to study the interactions between neural and immune cells. Thus, this culture platform provides a valuable tool for investigating treatment isolation strategies, ultimately leading to an improved screening approach for predicting pain.

Yazar Spotlight: Kronik Ağrı Tedavisinin Etkinliğini Artırmak için In Vitro ve İn Vivo Modeller

This protocol provides a technique to harvest and culture explanted dorsal root ganglion (DRG) from adult Sprague Dawley rats in a multi-compartment (MC) device.

Periferik Nöronal Özellikleri İncelemek için Çok Bölmeli Cihazlarda Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması, Gömülmesi ve Kültürlenmesi

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia ...

Biyomühendislik

Harvesting DRG from Rat Spine: A Procedure to Extract Dorsal Root Ganglion from the Spine of a Rat Model

Source: Schmidt, L. B. et al. <a href="https://www.jove.com/video/59296" target="_blank">The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we demonstrate the extraction of dorsal root ganglion or DRG from a harvested rat spine for downstream applications.

Sıçan Omurgasından DRG Toplama: Bir Sıçan Modelinin Omurgasından Dorsal Kök Ganglionunu Çıkarmak İçin Bir Prosedür

Source: Schmidt, L. B. et al. The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. J. Vis. Exp. (2019)
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

Baş ve Boyun Kanseri

Analizler ve teknikler

Spinal Cord Extraction: A Protocol to Isolate Murine Spinal Cord for In Vitro Studies

Source: Na&#39;ara, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/52990" target="_blank">In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model.</a> J. Vis. Exp. (2016)
In this video, we describe a step-by-step protocol to isolate spinal cord from a mouse model for in vitro studies.

Omurilik Ekstraksiyonu: İn Vitro Çalışmalar için Murin Omuriliğini İzole Etmek İçin Bir Protokol

Source: Na&#39;ara, S. et al. In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model. J. Vis. Exp. (2016)
In this video, we ...

İn vivo çalışmalar

Isolation of DRG Neurons and Coculture with Schwann Cell Precursors to Generate Schwann Cells

Source: Tsui, Y, et al. <a href="https://app.jove.com/v/55794">Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells as a Source for the Generation of Mature Schwann Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a procedure for isolating dorsal root ganglion (DRG) neurons from rat embryos and co-culturing them with Schwann cell precursors to generate mature Schwann cells. The isolated DRGs are processed to isolate neurons and glial cells. The isolated cells are cultured to purify the neurons, which are then co-cultured with Schwann cell-like cells (SCLCs) in a co-culture medium. Interaction with the DRG neurons leads to the maturation of SCLCs into Schwann cells.

DRG Nöronlarının İzolasyonu ve Schwann Hücreleri Oluşturmak için Schwann Hücre Öncüleri ile Kokültür

Generation of Fate-committed Schwann Cells via Coculture with DRG Neurons
1. Preparation of purified rat DRG neurons

	Autoclave all dissection tools ...

Kemirgenler dorsal kök gangliyon Omurilik ve İzolasyon hidrolik eldesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Dorsal Kök Ganglion Makrofajlarının Hızlı İzolasyon

Periferik Nöronal Özellikleri İncelemek için Çok Bölmeli Cihazlarda Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması, Gömülmesi ve Kültürlenmesi

Periferik Nöronal Özellikleri İncelemek için Çok Bölmeli Cihazlarda Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması, Gömülmesi ve Kültürlenmesi

Periferik Nöronal Özellikleri İncelemek için Çok Bölmeli Cihazlarda Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması, Gömülmesi ve Kültürlenmesi

Sıçan Omurgasından DRG Toplama: Bir Sıçan Modelinin Omurgasından Dorsal Kök Ganglionunu Çıkarmak İçin Bir Prosedür

Omurilik Ekstraksiyonu: İn Vitro Çalışmalar için Murin Omuriliğini İzole Etmek İçin Bir Protokol

DRG Nöronlarının İzolasyonu ve Schwann Hücreleri Oluşturmak için Schwann Hücre Öncüleri ile Kokültür