We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.

Alle Tiere wurden in voller Übereinstimmung mit dem dänischen und europäischen Vorschriften behandelt. Permission Nummer: 2012-15-2934. 1. Vorbereitung der Spritze für Hydraulik Extrusion des Spinal Cord <ol><li> Für einen erwachsenen Ratte, eine 10-ml-Spritze verwenden. Für einen erwachsenen Maus, verwenden Sie eine 5-ml-Spritze. Für Welpen, verwenden Sie eine 2,5-ml-Spritze. </li><li> Stellen Sie eine nicht-Filterpipettenspitze universell passend für 2-200 ul Pipetten durch das große Ende der Pipettenspitze trimmen, bis sie fest auf die Spritze passt. Legen Sie die eingestellte Pipettenspitze auf der Spritze. Für Welpen, eine 23 G oder ähnliche Nadel anstelle einer angepassten Pipettenspitze verwenden. </li><li> Absaugen eiskaltem sterilem PBS und die Spritze auf Eis bis zur weiteren Verwendung überlassen. </li></ol> 2. Euthanasie <ol><li> Nicht Genickbruch führen, da dies die Wirbelsäule Extrusion unmöglich macht stören. </li><li> Für erwachsene Ratte / Maus, einschläfern Gas wie CO 2 oder isofluRane. Diese Substanzen sind schädlich. Führen Sie die Euthanasie in einer Abzugshaube und behandeln die Substanzen gemäß Institution Richtlinien. (ACHTUNG: CO 2: H280, P410, P403, Isofluran: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> Um sicherzustellen, dass das Nagetier tot ist, sicherzustellen, ohne Reflex durch eine Pfote mit einer Pinzette Kneifen. Enthaupten die Nager mit großen Schere. Für Welpen, durch Enthauptung einschläfern. </li></ol></li></ol> 3. Isolierung der Wirbelsäule <ol><li> Streuen Sie Wasser auf das Fell die Haare zu steuern. </li><li> Verwendung einer Schere aufgeschnitten das Fell entlang der Wirbelsäule in einer distalen Richtung und isolieren der Wirbelsäule durch entlang der Wirbelsäule vorbei an der Beckenknochen auf beiden Seiten zu schneiden. Schneiden Sie das Rückenmark distal mit dem Beckenknochen mit einer Schere. HINWEIS: Die rostral-caudale Achse wird als die proximal-distale Achse gesamten Protokoll bezeichnet. <ol><li> Schneiden Sie die Wirbelsäule mit einer Schere die proximal zu vermeidenesten und am weitesten distal gelegenen Bereiche wie diese können die Wirbelsäule zu S-förmig für eine erfolgreiche Extrusion Rückenmark machen. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark an beiden Enden sichtbar ist. Wenn das Rückenmark nicht sichtbar ist, schneiden Sie die Wirbelsäule mit einer Schere, bis das Rückenmark sichtbar wird. </li></ol></li></ol> 4. Hydraulik Extrusion des Rückenmarks <ol><li> Legen Sie eine Petrischale (100 mm Durchmesser) gefüllt mit sterilem PBS auf Eis. </li><li> Begradigen die Wirbelsäule durch einen Zeigefinger auf dem gebogenen Teil (am weitesten proximal gelegenen Ende) der Wirbelsäule Anwendung, wodurch die Wirbelsäule so viel wie möglich Begradigung. <ol><li> Für Welpen, vermeiden Sie die Wirbelsäule Biegen, als die Wirbel wird Rendering Rückenmark Extrusion unmöglich gestört werden. </li></ol></li><li> Legen Sie die Pipettenspitze (23 G-Nadel für Welpen, alternativ 18 G-Nadel für erwachsene Mäuse) an der am meisten distalen Ende der Wirbelsäule. Wenn es richtig eingesetzt ist, wird die Spitze im Rücken Hohlraum stabilisiert. </li><li> Sicherzustellen, dass die Wirbelsäule so viel wie möglich begradigt wird. Wenden Sie stetigen Druck, und extrudieren das Rückenmark in die Petrischale auf Eis. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark auf Eis feucht zu halten, indem sie es in PBS, bis die weitere Handhabung zu halten. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Abbildung 1: Repräsentative Rückenmark. Hydraulisch Rückenmark extrudiert. Von links nach rechts: erwachsenen Ratte, erwachsenen Maus, Maus pup. Lendenwirbel Vergrößerungen von Feld markiert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 5. Identifizierung von Dorsalwurzelganglien (DRGs) <ol><li> Teilen Sie die Wirbelsäule in zwei gleiche Teile Längs Schere und legen Sie die geteilte Wirbelsäule unter dem Mikroskop. </li><li> Identifizieren Sie die T13 Wirbels Segment<html> die Bindungsstelle des am weitesten distal gelegenen Costae auf die Wirbelsäule Aufmerksamkeit Ortung nicht Costae mit den nahe gelegenen Interkostalnerven zu verwirren. Die am weitesten distal gelegenen Costae werden dem proximalen Teil des Wirbels T13 Segment befestigt und das T13 DRG distal zu Wirbel T13 und proximal zu Wirbels L1 angeordnet. </li><li> Identifizieren gleichzeitige DRGs in distaler Richtung. Für einen erwachsenen Ratte, erscheinen die gleichzeitige DRGs weiß mit deutlich sichtbaren dorsalen und ventralen Wurzeln. Für einen erwachsenen Maus, erscheint begleitend DRGs weiß mit deutlich sichtbaren dorsalen und ventralen Wurzeln. Für Welpen, erscheinen die gleichzeitige DRGs als klare Sphären. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Abbildung 2: Identifizierung von DRGs in der Wirbelsäule nach der Extrusion des Rückenmarks. Die Wirbelsäule wurde aufgeteilt Visualisierung von DRGs ermöglicht, wie durch Pfeile angedeutet ist. Am Beispiel von erwachsenen Ratte und Maus pup.<html> ref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 6. Isolierung von DRGs <ol><li> Anzahl Petrischalen (30 mm Durchmesser) entsprechend der spezifischen DRGs isoliert werden, beispielsweise L3, L4, L5. Füllen Sie die Petrischalen mit eiskaltem sterilem PBS und legen Sie sie auf Eis. </li><li> Mit Mikro Schere, schnitt dorsalen und ventralen Wurzeln so nah an den DRGs wie möglich, sie zu lösen, während die DRGs zu vermeiden beschädigen. </li><li> Mit der Spitze geschlossenen Pinzette, Schaufel sanft DRGs und übertragen sie an die entsprechenden nummerierten Petrischalen. </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Abbildung 3: Repräsentative isoliert DRGs. Von links nach rechts: erwachsenen Ratte, erwachsenen Maus, Maus pup.&quot;_blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 7. Verarbeitung von Geweben für die weitere Analyse <ol><li> Western-Blotting <ol><li> Isolieren Sie die Gewebebereich von Interesse, wie zB das Rückenmark Lendenanschwellung. Bei Bedarf trennen das Rückenmark in ipsilateralen und kontralateralen Seiten und weiter in dorsalen und ventralen Hörnern. </li><li> Platzieren des Gewebes in Lysepuffer wie TNE Lysepuffer (10 mM Tris-Base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 in doppelt destilliertem H 2 O) , die geeignete Enzyminhibitoren auf Eis. </li><li> Homogenisieren für das Gewebe etwa 30 s auf Eis ein mechanisches Schleifen Stößel. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 16000 × g bei 4 ° C und mit den Überstand zur weiteren Verarbeitung nach Standardprotokollen 5, 6 oder Halten der Überstand bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> RNA-Analyse <ol><li> Isolieren Sie das Gewebe von Interesse. </li><li> Ab sofort setzen das Gewebe in Lösung RNA-Stabilisierung der RNA für die Lagerung zu stabilisieren. </li><li> Isolieren RNA nach Standardprotokollen 7. </li><li> Konvertieren RNA zu cDNA und führen qPCR nach Standardprotokollen 7. </li></ol></li><li> Immunhistochemie <ol><li> Für gefrorenes Frischgewebe (für Rückenmark): <ol><li> Bereiten Sie Trockeneispulver durch Trockeneis Würfel Pulverisieren zu einer Menge, die zwei Esslöffel Pulver entspricht. Decken trocken Eiswürfel in ein Tuch und pulverisieren die Würfel mit einem Hammer. Platzieren Silberfolie (ca. 5 cm x 5 cm) auf einer Schicht aus trockenem Eiswürfel und decken die Silberfolie mit Trockeneispulver. </li><li> Legen Sie das Rückenmark-Bereich für weitere Analysen auf der Trockeneispulver ausgewählt Pinzette, lassen Sie es Snap-freeze, und übertragen das Rückenmark zu einem Kryo Röhrchen. Halten Sie es auf Trockeneis zu allen Zeiten oder lagern Sie es bei -80 ° C bis uns weitere. </li><li> Übertragen, das Rückenmark zu einem Kryostaten (-20 ° C). Wenn nötig, schneiden Sie das Rückenmark im Inneren des Kryostaten. Legen Sie das Rückenmark in Einbettungsmaterial im Innern des Kryostaten, um es an die Objektplatte zu befestigen. </li><li> Schneiden Sie das Rückenmark in der gewünschten Dicke, beispielsweise 5 &amp; mgr; m, und sammeln sich auf Glasplatten. Erhitzen Sie die Glasplatten mit einem Finger unmittelbar vor der Gewebesammlung für eine bessere Befestigung. Halten Sie alle übrig gebliebenen Gewebe in Kryoröhrchen bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Lassen Sie die Abschnitte auf Glasplatten im Inneren des Kryostaten, bis sie bereit für die Post-Befestigung. </li><li> Post-fix die Abschnitte durch Eintauchen in 4% PFA für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Führen nach Standardprotokollen Anfärben 8. </li></ol></li><li> Fixiertem Gewebe für Kryo-Schnitte (für Rückenmark und DRGs) <ol><li> Fix Rückenmark und DRGs in 4% PFA (2 h für Rückenmark, 1,5 h für Maus DRGs und 4 h für Ratten-DRGs) bei4 ° C (in horizontaler Lage des Rückenmarks zu verhindern, dass in einer gebogenen Stellung von Befestigung). </li><li> Übertragen, um das Gewebe zu 25% w / v Saccharose über Nacht bei 4 ° C. Das Gewebe kann in 25% w / v Sucrose gespeichert werden Azid supplementiert mit wenigen Tropfen 10% -iger mikrobieller Kontamination bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung zu verhindern. Wenn nötig, schneiden Sie das Rückenmark nur die Lendenanschwellung zu bilden auf einem Silikon-Karton oder ähnliches. </li><li> Mit der Spitze eines Papiertuch, aspirieren aus dem Gewebe überschüssige Saccharoselösung. </li><li> Füllen Sie eine Kryo Form halber Strecke Material mit einzubetten. Schieben Sie alle Blasen an den Seiten der Kryo-Form mit Werkzeugen wie geschlossene Pinzette. </li><li> Legen Sie das Gewebe auf dem Einbettungsmaterial mit einer Pinzette und sorgen für die gewünschte Gewebeorientierung. </li><li> Füllen Sie die Kryo Form vollständig mit Einbettungsmaterial und schieben so weit weg von dem Gewebe wie möglich alle Blasen (zB durch geschlossene Pinzette). </li><li> Füllen Sie eine Petrischale (100 mmim Durchmesser) mit 2-methylbutan. Diese Substanz ist schädlich. Führen Sie diesen Schritt in einer Abzugshaube und geht mit dem Stoff gemäß Institution Richtlinien (ACHTUNG: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Legen Sie die Petrischale auf einer Schicht aus Trockeneis und fügen Sie zwei trockene Eiswürfel in die Petrischale. Legen Sie die Kryo-Form in der Petrischale und erlauben es dem Einbettungsmaterial vollständig einzufrieren. </li><li> Halten Sie das eingebettete Gewebe auf Trockeneis zu allen Zeiten oder bei -80 ° C in Parafilm bis zur weiteren Verarbeitung gewickelt. </li><li> Schneiden Sie das Gewebe auf einem Kryostaten (-20 ° C) in die gewünschte Dicke, beispielsweise 5 um. </li><li> Führen nach Standardprotokollen Anfärben 8. </li></ol></li><li> Fixiertem Gewebe für Paraffineinbettung (für Rückenmark und DRGs) <ol><li> Fix Rückenmark und DRGs in 4% PFA (2 h für Rückenmark, 1,5 h für Maus DRGs und 4 h für Ratten-DRGs) bei 4 ° C (Platz Rückenmarkin horizontaler Lage aus Fixierung in einer gebogenen Position zu verhindern). </li><li> Übertragen, um das Gewebe zu 25% w / v Saccharose über Nacht bei 4 ° C. Das Gewebe kann in 25% w / v Sucrose gespeichert werden Azid supplementiert mit wenigen Tropfen 10% -iger mikrobieller Kontamination bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung zu verhindern. </li><li> Isolieren Sie die Gewebebereich von Interesse, wie zB das Rückenmark Lendenanschwellung. </li><li> Füllen Sie eine Einbettform zur Hälfte mit Paraffin. </li><li> Kühlen Sie den Einbettform kurz, indem sie auf die Kühlfläche des Einbettungs Maschine platzieren das Paraffin leicht zu härten. Dies ermöglicht eine bessere Gewebe Positionierung. </li><li> Platzieren das Gewebe in der gewünschten Orientierung in dem Einbettungsform. Füllen Sie die Einbettform mit Paraffin und kühlen sofort. </li><li> Legen Sie das paraffinhaltige bei 4 ° C über Nacht Einbettform zu lassen, es härtet vollständig und entfernen Sie den Paraffinblock das Gewebe aus der Einbettform enthält. </li><li> Cut Abschnitte ona Mikrotom in der gewünschten Dicke, beispielsweise 5 um. </li><li> Führen nach Standardprotokollen Anfärben 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord.">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay.">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014)</li><li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Nervous System. , 424-426 (2012).</li><li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy:+implications+for+studies+of+neuropathic+pain.">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li><li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice.">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li><li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+electrophysiology.">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li><li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy.">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wenn die Wirbelsäule gestört wird, beispielsweise durch zervikale Dislokation, wird das Rückenmark bei der Extrusion aufgespalten. Wenn das Rückenmark nicht extrudiert werden kann, kann die Wirbelsäule leicht an beiden Enden abgeschnitten werden und die Extrusionsversuch wiederholt werden kann. Falls das gesamte Rückenmark für eine weitere Analyse erforderlich, dh der Halsanschwellung bestehend sowie der Lenden- Erweiterung sollte die Wirbelsäule nur geringfügig beschnitten werden. Wenn nur die Lendenanschwellung für die weitere Analyse erforderlich ist, sollte das Rückenmark nach der vorliegenden Protokoll getrimmt werden. Die Wirbelsäule sollte mit den Fingerspitzen gerade gerichtet werden Extrusion zu erleichtern. Das Protokoll ist für Nagetiere aller Altersgruppen und hier wird von einer erwachsenen Maus (8 Wochen), eine Maus pup (5 Tage) und einer erwachsenen Ratte (10 Wochen) veranschaulicht. Je nach Tierart und Stamm, die Anzahl der thorakalen und lumbalen Abschnitte variieren 9, </sup&gt; 10, 11. In Abhängigkeit von den Proteinen zu analysiere erwachsenen Nagetieren können mit enzymhemmende Lösungen vor der Euthanasie perfundiert werden. Wenn ein Experiment durchführen einseitige Nervenschaden, kann das Rückenmark in ipsilateralen und kontralateralen Seiten aufgeteilt werden unter Verwendung von ultrafeinen Pinzette sofort nach der Extrusion. Ferner kann jede Seite in dorsalen und ventralen Seiten aufgeteilt werden. Das Gewebe kann dann für weitere Analysen, wie zB Western - Blot verarbeitet werden. Transkardialer Perfusionsfixierung mit PFA vor dem Rückenmark Extrusion sollte vermieden werden, da dies das Rückenmark nicht flexibel macht und verhindert, dass das Rückenmark hydraulischen Extrusion. Hydraulische Rückenmark Extrusion werden die dorsalen Wurzeln abreißen. Für Experimente, wo angebracht Dorsalwurzeln notwendig sind, wird laminectomy empfohlen. Darüber hinaus werden durch hydraulische Rückenmarkshäuten Extrusion verloren, die durch Standard laminectomy vermieden werden können Hydraulik Extrusion des Rückenmarks und DRG Isolierung auch könnte unter Verwendung oxygenierten künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) anstelle von eiskaltem PBS durchgeführt. Die Verwendung von ACSF ermöglicht die Erhaltung des isolierten Gewebes in einer besseren physiologischen Umgebung, die bei der anschließenden elektrophysiologischen Ableitungen 12 besonders wichtig ist, 13. Eine Alternative zu ACSF könnte PBS , enthaltend 1 g / l Glucose zur Erzeugung von Primär DRG - Kulturen 14. Hydraulik Extrusion des Rückenmarks ist ein wesentlich schnelleres Verfahren als die traditionelle Art des Rückenmarks Isolierung durch Laminektomie, wodurch Gewebebehandlungszeit und damit die Gefahr von Proteinschädigung vermindert wird. Perfusion mit einem Fixiermittel vor das Rückenmark durch Laminektomie zu isolieren, das Risiko von Gewebeschäden bei der Präparation und bei der endgültigen Entfernung des verringern kannRückenmark von der Wirbelsäule. Allerdings schließt Gewebefixierung seine Anwendbarkeit auf Analysen wie Western Blotting. Hydraulische Extrusions Ausbeuten strukturell unbeschädigte Gewebe 3 geeignet für ein breiteres Spektrum von Analysen. Konsistente Erkennung von DRGs kann schwierig sein. Dies ist jedoch für die Gewebeanalyse unerlässlich, zB Ischiasnerv Verletzung folgen. Durch die Nummerierung der DRGs nach ihrer Lokalisation in Bezug auf die Costae, DRGs konsistent identifiziert werden. Die Färbung der Rückenmarksgewebe sowie von DRGs kann durch Ausführen der dargestellten Gewebebehandlung Variationen in Protokollschritt 7 skizziert optimiert werden.

Das Ziel dieser Methode ist das Rückenmark sowie zu identifizieren und zu isolieren DRGs 1, 2 zu isolieren. Hydraulik Extrusion des Rückenmarks ist ein wesentlich schnelleres Verfahren als die traditionelle Art des Rückenmarks Isolierung durch Laminektomie, dh durch die Wirbelsäule eine nach brechen, und dieses Verfahren verringert das Risiko von Gewebe durch die Dissektion Prozess verursachten Schaden 3, 4 . DRGs kann schwierig sein, zu identifizieren. Die korrekte Identifizierung ist für Gewebeanalyse sehr wichtig, zB Ischiasnerv Verletzung folgen. Durch die Nummerierung der DRGs nach ihrer Lokalisation in Bezug auf die Costae, DRGs konsistent identifiziert werden. Gewebe durch die hier gezeigt , isoliert Techniken können auf eine Vielzahl von Analysen , einschließlich Western - Blotting 5 aufgebracht werden,6, qPCR 7 und immunhistochemischen Färbung 8. Wenn DRGs identifizieren, ist es wichtig zu berücksichtigen , daß die Anzahl der Rückenmarkssegmente bekannt ist mit Tiertyp und Dehnungs 9, 10, 11 zu variieren. Die Vorteile bei der Durchführung dieses Verfahrens bei Mäusen sind die hohe Anzahl von gentechnisch veränderten Varianten und den relativ niedrigen Wohnkosten. Die Vorteile bei der Verwendung von Ratten sind die relativ hohen Gewebeausbeute und wenn Nervenverletzungen beteiligt, wird das Verfahren mit der Größe erleichtert werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 14084-08</td>
			<td>For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5427 R</td>
			<td>For centrifugation of homogenized tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># CM 3050 S</td>
			<td>For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 3</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11231-30</td>
			<td>For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 5</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11252-20</td>
			<td>For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 %</td>
			<td>Abbott</td>
			<td># 002185</td>
			<td>For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane GPR rectapur</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 24872.298</td>
			<td>For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># RM 2155</td>
			<td>For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 76243</td>
			<td>For paraffin embedding; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin tissue embedding station</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># EG1160</td>
			<td>For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestel, motor cordless</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># Z359971-1EA</td>
			<td>For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td># 121V</td>
			<td>For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># P7741</td>
			<td>For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor, Phosstop</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 04906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, 1-200 &#956;l, no filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td># 70.1189.105</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Complete</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 05892791001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># R0901</td>
			<td>For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Protect Mini KiT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 74124</td>
			<td>For RNA isolation; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td># REF0203</td>
			<td>For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge</td>
			<td>Bochem</td>
			<td># 4070</td>
			<td>For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, 130 mm cutting edge</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td># 1902.0130</td>
			<td>For isolation of spinal cord (adult rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 15009-08</td>
			<td>For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x</td>
			<td>Leica</td>
			<td># 10446370</td>
			<td>Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td># 10010-015</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 23 G x 1&#34;, 0.6 x 25 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-2325R</td>
			<td>For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-1838S</td>
			<td>Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura</td>
			<td># 4583</td>
			<td>Tssue embedding material for later cryosectionning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNE-lysis buffer</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 10128-582</td>
			<td>For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Hydraulisch extrudiert Rückenmark zeigen eine glatte unbeschädigten Oberfläche in Figur 1 gezeigt. Die Lendenanschwellung kann leicht als der verdickte Bereich des Rückenmarks identifiziert werden, boxed in Abbildung 1. Die dorsalen und ventralen Seiten des Rückenmarks kann entsprechend der Morphologie durch Auge identifiziert werden. In Figur 1 ist die Bauchseite dem Betrachter zugewandt, identifizierbar durch eine klare Mittellinie entlang der gesamten Rückenmarks. Zwei breitere Linien entlang des Rückenmarks ermöglichen Identifizierung der dorsalen Seite. Am distalsten Ende der Cauda equina manchmal bleiben bei erwachsenen Ratten und erwachsene Mäuse befestigt. Einzel DRGs kann nur während in der Wirbelsäule, Figur 2 befindet identifiziert werden. Nach der Isolierung, Figur 3 können die einzelnen DRGs nicht Aussehen identifiziert werden. Bei Bedarf ist es daherwichtig, dass sie eindeutig auf Trennung getrennt zu halten. Nach der Isolierung kann das Rückenmark und die DRGs verarbeitet und gefärbt werden , wie in Schritt 7.3 und dargestellt in Abbildung 4 dargestellt. 4a zeigt eine immunhistochemische Färbung eines DRG - Abschnitt , wo die Neuronen und deren umgebenden Satelliten Gliazellen deutlich sichtbar sind. Durch die korrekte Identifizierung der DRG ist es möglich, die Wirkung der Ischiasnerv Verletzungen am soma des verletzten Neuronen sowie auf deren umgebenden Satelliten Gliazellen zu analysieren. Figur 4b zeigt eine Nissl - Färbung eines hydraulisch extrudiert Rückenmark , wo das Gewebe intakt ist , wie durch die glatten Kanten des Abschnitts reflektiert. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Abbildung 4: Repräsentative Gewebeschnitten. A. Immunhistochemische Färbung von DRG-Seite. B. Nissl gefärbten Section von hydraulisch extrudiert Rückenmark. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Hydraulische Extrusion des Rückenmarks und Isolierung von Dorsalwurzelganglien in Nagetiere

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

hydraulic-extrusion-spinal-cord-isolation-dorsal-root-ganglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

47.6K Aufrufe.  Aarhus University. Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage. 

Serie: Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Mess Spinal Präsynaptische Hemmung bei Mäusen durch Spinalgan Mögliche Aufnahme<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...