Triphosphorylation הוא שינוי של 5's של RNA בביולוגיה, והוא משמש יותר ויותר ביישומים ביו-טכנולוגיים. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר 5'triphosphorylation של כל אוליגונוקלאוטיד שהוכן על ידי סינתזה אוטומטית סטנדרטית. טריפוספורילציה כימית פועלת על אוליגונוקלאוטידים המכילים רנ"א, דנ"א או חומצת גרעין לא טבעית.
כאן, L-RNA שמאלי טריפוספורי, האננטיומר של D-RNA ביולוגי, מסונתז מטוהר ומשמש בתגובת ריבוזום. טריפוספורילציה מתבצעת לאחר סינתזה אוטומטית של אוליגונוקלאוטידים ולפני ההגנה. שלבים אלה אינם מוצגים כאן, אך החוקרים צריכים להכיר את השיטות הסטנדרטיות לשניהם.
כדי להתחיל, ודא שבסביבת העבודה לזרחון יש סעפת גז עם לפחות שני קווים והבועה מחוברת למקור ארגון יבש בלחץ מתכוונן מכיוון שתגובת הטריפוספורילציה חייבת להתבצע תחת ארגון. לאחר מכן חברו מזרקי פלסטיק מיליליטר אחד לקווים כדי להקל על החיבור למנגנון התגובה. לאחר מכן, אספו את הציוד הכולל מזרקי פלסטיק של מיליליטר אחד, סטופר פוליפרופילן תלת-כיווני, מחטים לא מפרקיות, צינורות פוליפרופילן 1.5 מיליליטר, מרית מתכת קטנה, ואחסנו אותם במיכל אטום או במייבש כביסה עם חומר ייבוש בטמפרטורת החדר לפחות יום אחד לפני השימוש.
תחת לחץ ארגון, למשוך 30 מיליליטרים של נטול מים 1, 4-דיוקסן מבקבוק אטום. מעבירים לבקבוק זכוכית יבש של 30 מיליליטר ומוסיפים מלכודת ייבוש. אוטמים עם ספטה מגומי ומאחסנים במייבש עם מייבש שומנים.
באופן דומה, להכין 30 מיליליטרים של N, N-דימתילפורמיד, אצטוניטריל, ותערובת של שלושה חלקים דיוקסן וחלק אחד פירידין לפי נפח. הכן תמיסת TBAP על ידי ערבוב של טריבוטילמוניום פירופוספט מוצק עם דימתילפורמיד וטריבוטילאמין בבקבוק זכוכית של 30 מיליליטר כמתואר בכתב היד. הוסף שלוש מלכודות ציור.
אוטמים את הבקבוק עם מחיצת גומי מתחת לארגון ובועות עם ארגון למשך 30 דקות. לאחר הכנת אוליגונוקלאוטיד עם 5'הידרוקסיל חופשי על עמודת סינתזה באמצעות סינתיסייזר DNA/RNA אוטומטי. הכן את התא על ידי הסרת הבוכנה ממזרק מיליליטר יבש אחד.
חותכים את החלק העליון של המזרק באמצעות מספריים או סכין גילוח ומחברים את המזרק לעמודת הסינתזה. לחלק העליון של המזרק, חברו את הסטופר התלת-כיווני והצמידו את הכניסה הצדדית של ה-stopcock למקור הארגון היבש עם הבועה, כך שהכניסה העליונה של ה-stopcock תשמש כיציאת הזרקת הריאגנטים. הצמידו את המפעילים למעמד עם מלחציים ואטמו את כל המפרקים במעלה הזרם עם סרט איטום שעווה.
לאחר מכן התאם את ה- stopcock כך שיציאת ההזרקה תהיה סגורה והמנגנון יהיה פתוח למקור הארגון. סגרו את הבועה ואפשרו לארגון בלחץ נמוך לזרום דרך תא הפעולה למשך חמש דקות. לאחר פתיחת הבועה מחדש, חברו מזרק לתחתית עמודת הסינתזה, שיהיה מזרק הפסולת.
לאחר מכן, משוך ארגון דרך העמוד שוב ושוב באמצעות מזרק הפסולת ולאחר מכן חבר מחדש את המזרק עם הבוכנה שנדחפה במלואה פנימה. כדי להוסיף מגיב או ממס, חברו מחט למקור הארגון היבש והכניסו אותה למחיצה של הריאגנט או הממס, תוך הקפדה שלא לטבול את המחט בתכולת הבקבוק. לאחר מכן להרכיב מזרק יבש עם מחט ולהכניס אותו לתוך ריאגנט או ממיס בקבוק מחיצת מבלי לטבול אותו בתכולת הבקבוק.
לאחר מכן, מלאו את המזרק בארגון, משכו את המחט מהמחיצה וגירשו את הארגון. לאחר מילוי המזרק בארגון וסילוק פעם נוספת, מלאו את המזרק בנפח הנדרש של ממס או מגיב בלחץ ארגון. התאם את ה-stopcock כך שמקור הארגון יהיה סגור ויציאת ההזרקה תהיה פתוחה.
לאחר שהעצירה במכשיר מתכווננת במהירות, הסירו את המזרק והמחט המלאים מבקבוק המקור, נגבו כל ממס שנדבק לצד או לקצה המחט ולאחר מכן הכניסו את המחט ליציאת ההזרקה. לאחר מכן גירשו ריאגנט לתוך האנטי-תא של המפעילים, הסירו את המחט וסגרו את יציאת ההזרקה תוך פתיחת המנגנון מחדש למקור הארגון. משכו בעדינות את הנוזל מהאנטי-תא עד עמודת הסינתזה באמצעות מזרק הפסולת, כך שכל הנוזלים מוחזקים כעת במזרק הפסולת.
כעת דחפו באיטיות את התמיסה בחזרה למעלה אל עמודת הסינתזה, תוך הבטחה שאין בועות גז בעמודה. כדי לערבב או להתסיס, משכו בעדינות את התמיסה למעלה ולמטה מעל העמודה עם מזרק הפסולת. כדי להסיר מגיב או ממס מהעמודה, משכו באיטיות את התמיסה לתוך מזרק הפסולת.
לאחר שעיקר התמיסה עברה למזרק הפסולת, משכו את ארגון דרך כדי לשטוף את הממס הנותר מהעמודה. לאחר מכן, הסר את סרט איטום השעווה סביב מפרק מזרק הפסולת. לאחר מכן להסיר את המזרק ולהשליך את פתרון הפסולת.
לאחר מכן, החליפו את מזרק הפסולת במזרק יבש חדש ואטמו מחדש את המפרק. לאחר הרכבת מנגנון הטריפוספורילציה, התחל את תגובת הטריפוספוריה על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של פירידין דיוקסן לאנטי-תא כפי שהוכח בעבר. אבל אל תמשוך דגימה לעמודת סינתזה עדיין.
לאחר המסת SalPCl בדיאוקסן כמתואר בכתב היד, הוסיפו אותו לתא האנטי והועמסו על עמודת הסינתזה באמצעות מזרק יבש. לאחר מכן תן לו להגיב במשך 15 דקות ולאחר מכן הסר והשלך את פתרון SalPCl באמצעות מזרק פסולת כפי שהודגם בעבר. מיד לאחר הסרת תמיסת ה-SalPCl, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של תמיסת TBAP לאנטי-תא והועמסו על עמודת הסינתזה.
תן לו להגיב 20 דקות עם תסיסה ולהשליך כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, שטף את העמוד עם 0.5 מיליליטרים של N, N-דימתילפורמיד, ואז 0.5 מיליליטרים של אצטוניטריל, והסיר את הממס לאחר כל תוספת. לאחר הוספת תמיסת מחמצן, הסרתו ושטיפת העמוד עם אצטוניטריל שוב באמצעות אותו הליך שהוצג, מפרקים את המנגנון ושוטפים את העמוד בחמישה מיליליטרים של אצטוניטריל.
לאחר מכן, יבשו את העמודה. נקה את האוליגונוקלאוטיד הטריפוספורי מתוך התמיכה המוצקה וההגנה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, מומסים את האוליגונוקלאוטיד המיובש המוגן במאגר העמסת אוריאה, מחוממים ל-80 מעלות צלזיוס, ואז מעמיסים על ג'ל פוליאקרילאמיד ומריצים במשך שעה עד שעתיים ב-25 עד 35 וואט.
בסוף האלקטרופורזה של הג'ל, לאחר הסרת צלחת הג'ל, מפרקים אותה ועוטפים את הג'ל בסרט פוליוויניל כלוריד. לאחר מכן, זהה את רצועות המוצר על ידי הצללה אחורית עם אור UV של 254 ננומטר והוציא את רצועת המוצרים העיקרית באמצעות סכין גילוח. מרסקים את הג'ל הכריתה על ידי הוצאתו דרך מזרק פלסטיק או מכני.
עבור אוליגונוקלאוטידים קצרים מ -15 נוקלאוטידים, יש לגדל פי שלושה את נפח הג'ל של מים נטולי נוקלאז למשך 12 שעות לפחות עם תסיסה או רעד. לאחר מכן הסר חתיכות ג'ל מוצקות על ידי העברת התמיסה דרך מזרק המצויד במסנן 0.2 מיקרומטר והתרכז על ידי ליופיליזציה. לאחר הריכוז, הסירו את שאריות המלחים וההצדעה באמצעות עמוד הרחקה בגודל חד פעמי והתרכזו בליופיליזציה כפי שהוכח קודם לכן.
לאחר הכנת 10 מיקרוליטרים של תמיסת RNA המכילה תבנית פריימר פולימראז ריבוזים ו-L-RNA וטריפוספט טרינוקלאוטידים כפי שמתואר בכתב היד, חישולו על ידי חימוםו ל-90 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת וקירורו ל-23 מעלות צלזיוס ב-0.2 מעלות צלזיוס לשנייה בתרמוציפלר PCR. לאחר דגירה של תמיסת הרנ"א ב-17 מעלות צלזיוס, עצרו את התגובה על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של ריכוז כפול של מאגר הזינוק ככל שהתגובה מתקדמת, קחו 10 אליקוטים של מיקרוליטר ומרווים עם חמישה מיקרוליטרים של 0.5 EDTA טוחנים ב-pH 8 ועבדו כל דגימה כדי לבודד RNA כמתואר בכתב היד. ממיסים את הרנ"א המחודד ב-10 מיקרוליטרים של מאגר טעינת ג'ל פורמלי ומכינים פריימר מסומן קצה שלא תוקן כמתואר בטקסט.
לאחר הכנת הדגימות, מחממים ל-80 מעלות צלזיוס. טען חמישה מיקרוליטרים של הדגימה בכל באר והפעל את הג'ל ב-40 וואט במשך כ-40 דקות. לאחר הסרת צלחת הג'ל מהמעמד, יש לסרוק באמצעות סורק ג'ל פלואורסצנטי או זרחני כדי לדמיין תוצרי הרחבה של L-RNA חוצי כיראליים.
לאחר טיהור ג'ל, הצללה אחורית של UV חושפת את נוכחותם של 5'triphosphate כמוצר עיקרי יחיד כפי שמוצג עבור גוזם DNA AAA ו- CCC וטרימר GAA L-RNA. מוצר הצד של 5'hydroxyl נראה לעתים קרובות כפס נודד איטי יותר, אשר בודד וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה עבור גוזמי DNA. רצועות נוספות במהלך טיהור ג'ל מתואמות עם תוצרי צד של 5'דיפוספט, מונופוספט ו-H-פוספונט בספקטרומטריית מסה של תוצרי התגובה הלא-מפורזים.
מוצרי 5'triphosphate מראים שיא מסה ראשוני המתאים ל-5'triphosphate יחד עם מסות 5'di ומונופוספט. טרינוקלאוטידים הקשורים לטריפוספטים הקשורים לטריפוספטים כימיים שימשו עם פריימר L-RNA ותבנית L-RNA בתגובת פילמור RNA שנותחה על ידי PAGE וצולמה באמצעות סורק ג'ל פלואורסצנטי. המכפלה המורחבת המסומנת על ידי עיגולים שחורים הדגימה את הסינתזה של גרסת L-RNA של ריבוזים של ראש הפטיש המקודדת על ידי התבנית.
חשיפה למים במהלך טריפוספורילציה תפחית את היבול. בצע את השלבים להכנת ריאגנטים יבשים ולהרכבת מנגנון התגובה בזהירות. הזז נוזלים דרך המנגנון באיטיות כדי למנוע שבר באטמים.
טריפוספורילציה כימית חיונית להכנת טריפוספטים אוליגונוקלאוטידים לא ביולוגיים, כולל רנ"א שמאלי. זה איפשר סינתזה של ריבוזים חוצי כיראליים של גרסאות תמונת המראה של מולקולות RNA שנמצאו בביולוגיה.
