שיטה זו יכולה לעזור לענות על בעיות מפתח בתחומי הווירולוגיה והמיקרוביולוגיה הקשורים לרישום בקטריופאג'ים מדגימות מורכבות ואבחון וטיפולים מבוססי בקטריופאג'. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות יעיל ומדויק של זמן של מספר רב של דגימות מניסויי ביופאנינג של תצוגת פאג', שלא ניתנים לתיקון מסורתי. להדגים את ההליך יהיו רשמי מוהנטי ויסמים ליאל, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי.
לאחר תכנון פריימרים ויצירת ריכוז מלאי, לקבל התייחסות T7 פאג DNA בריכוז של 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר. באמצעות מים אולטרה-חמים, מדללים באופן סדרתי את הדנ"א הזה פי עשרה, ממיליון פמטוגרמות למיקרוליטר למיקרו-ליטר אחד בצינורות PCR של 0.2 מיליליטר. הכינו 20 מיקרוליטרים של כל ריכוז, הקפדו להחליף טיפים של פיפטה ומערבולת את הצינורות בין כל שלב בדילול.
לאחר מכן להמיר את T7 פאג התייחסות ריכוז DNA מ femtograms לכל microliter לעותקים הגנום לכל microliter. ראשית, פיפטה 200 microliters של מדגם T7 פאג שיבוט לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר עבור כל אחד 10 הדגימות הרצויות. הוסף שני מיקרוליטרים של DNase אחד לכל צינור.
מכסים את הצינורות ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות באמבטיה יבשה מחוממת. ואז דגירה ב 100 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות באמבטיה יבשה מחוממת. צנטריפוגה הצינורות המכילים את החום שטופלו פאג'ים ב 18, 534 פעמים גרם במשך 10 שניות.
מניחים את הצינורות הצנטריפוגיים על מערבל מערבולת במצב הפעלת מגע למשך 10 שניות כדי לערבב את הפאג'ים. לסובב שוב ב 18, 534 פעמים g במשך 10 שניות. לאחר מכן, להשאיר את הדגימות על ספסל המעבדה כשעה כדי לקרר אותם לטמפרטורת החדר.
הכינו את הקדם-מימיקס של qPCR ל-10 דגימות פאג' ביופאן של ריכוז לא ידוע ושבע דגימות של ריכוזים סטנדרטיים ב-triplicate. וכתוצאה מכך premix עבור 51 דגימות המכילות 255 microliters של תערובת אב qPCR, 51 microliters של פריימרים ו 102 microliters של מים. Aliquot שמונה microliters של PCR מוכן לערבב לתוך 51 בארות של צלחת qPCR 96-well.
הבא להוסיף שני microliters של דגימות Phage T7 שטופלו חום לכל בארות אלה, מחלק אותו מתחת לפני השטח של premix qPCR. באמצעות סרט דבק, לאטום את הצלחת. לעטוף את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למזער הלבנת צילום פלואורסצנטי ולאחר מכן להמשיך להפעיל את הצלחת על ציוד qPCR.
הגדר את תנאי הרכיבה ואת הגדרות עקומת ההמסה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הפעלת ה- qPCR, עלילת ההגברה, חלקת עקומת ההמסה וההתוויה מרובת התוויה מנותחות מהנתונים הגולמיים. עלילת ההגברה מציינת אם הגברת PCR של כל דגימה מצליחה או לא.
העלילה הרב-תכליתית מייצגת את ההגברה והריקבון של האות הפלואורסצנטי לאורך מחזורי ההגברה. בעוד שתווית עקומת ההמסה משמשת לאימות הספציפיות של פריימרים, מכיוון שלכל מוצר PCR יש טמפרטורת התכה ייחודית אחת. העקומה הסטנדרטית נוצרת לאחר מכן מהדנ"א של הייחוס.
כאן יעילות ההגברה מחושבת להיות 92.4% נתונים מייצגים ממחקר qPCR מושווה לאחר מכן לאותו פאג', כי כימתו על ידי מבחנה פלאק שכבה כפולה בטווח נבדק של 10 עד 10 מיליון עותקי גנום לכל microliter. כפי שניתן לראות כאן, מספר הפאג'ים ב quantitation qPCR הוא גבוה יותר מאשר בהסטת פלאק. החוזרות של שיטת qPCR כפי שהיא מיוצגת על ידי מקדם השונות נתפסת כערכים הנעים בין 2.85% ל -27.2% בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי ישנם שיקולים רבים בפיתוח ושימוש ב- qPCR לכימות מדויק של פאג'ים, כולל טיפול והכנת דגימות וכיול של ציוד רלוונטי.
בעקבות שיטה זו, ניתן לבצע טכניקות אחרות על מנת למנות חלקיקי פאג' במגוון יישומים הכלולים בביופאנינג vivo, הכנת DNA של ספריית פאג' וזיהוי רצף ופאג'ים מהדור הבא בדגימות סביבתיות מורכבות. אל תשכחו כי פאג'ים נחשבים מפגעים ביולוגיים במעבדה ואמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי, כולל כפפות ומעילי מעבדה, תמיד צריך להיות משוחק בעת ביצוע ההליך.
