אנו מודים לפרופ &#39;ג&#39; פרי ווסטנייס, אוניברסיטת בריטיש קולומביה, על זרע להביע RFP-TUB6 ו סוקר אנונימי עבור תיקונים מועיל. אנו אסירי תודה לפרופ &#39;יו דיקינסון על כך שהזהיר אותנו להשתמש בסרט תאית כתמיכה מכנית ולג&#39;ון בייקר לצילום. עבודה זו נתמכה על ידי מחקר BBSRC מעניק BB / G013993 / 1 ו- BB / D004055 / 1 ל- IM, וכן פרס BBSRC הדרכה דוקטורנט מלגות קלרנדון CK

1. יצירת החדר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חותך זכוכית, לחתוך 3 מ&quot;מ רצועות רחב מקצה שקופית מיקרוסקופ 1 מ&quot;מ עבה. באמצעות דבק סופר cyanoacrylate או קלטת דו צדדית, דבק אלה רצועות זכוכית כ 45 מ&quot;מ בנפרד על פני רוחב של שקופית מיקרוסקופ השני ( איור 1 א ). שקופית אחת לכל חדר נדרש, בתוספת שקופיות נוספות לשפוך לוחות אגר (שקופית אחת תניב 2-3 אגר לוחות). שקפים ניתן לעשות בה שימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין רצועות הזכוכית, אופנה אטם של גובה זהה מתוך גומי חדיר פול (dimethylsiloxane) מסטיק. מניחים כדור של מסטיק פולי (dimethylsiloxane) על השקופית ( איור 1B ), רטוב שקופית השני עם כמות קטנה של אתנול מוחלט 100%, ולשטח את הכדור (dimethylsiloxane) מסטיק הכדור עם השקופית השנייה עד שהוא הגיע לגובה של רצועות זכוכית ( איור 1 ג ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, לקצץ עודף פולי (שקלThylsiloxane) מסטיק עם להב סכין גילוח חוזר שטוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת חותך מתאים או סכין גילוח הרטבו באתנול מוחלט, להסיר את החלק הפנימי של מסטיק פולי (dimethylsiloxane) כדי ליצור את חלל כי יהיה מאוחר יותר להחזיק את השתיל ואת לוח אגר ( איור 1D ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקצץ את הג &#39;ל עם להב גילוח ליצור אטם עם עובי דופן הסופי של כ 2 מ&quot;מ ( איור 1E ). חדירות של גזים דרך מחסום פולי (dimethylsilaxane) הוא עצמאי של עובי מעל 50 מיקרומטר 11 . </li></ol> 2. יצירת אגר- solidified לוח של צמיחה בינונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על שקופית מיקרוסקופית עם שתי רצועות זכוכית, במקום coverslip (22 מ&quot;מ x 50 מ&quot;מ) כך שהוא נשען על שתי רצועות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נמס חצי כוח Murashige ו Skoog בינוני צמיחה המכיל 1% w / סוכרוז v ו 1.5% w / v אגר (½ MS) לתוך החלל וכתוצאה מכךמתחת coverslip עד האחרון הוא מלא לגמרי (כ 1 נפח נפח מלא) ולהשאיר עד אגר מוגדר (כ 5 דקות). הערה: תרכובות פרמקולוגיות ניתן לנהל באמצעות לוח אגר על ידי הוספת ריכוזים מתאימים למדיום נוזלי לפני הלוח הוא שפך. זה נבדק בהצלחה עבור dexamethasone 12 , isoxaben, 2,6-dichlorobenzonitrile (DCB), אוריזלין, ו latrunculin B. </li></ol> 3 . מסיים את ההגדרה הקאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איזון האוויר PFD על ידי רעד נפח קטן של PFD בצינור 7 . הוסף כמות קטנה (כ 200 μL) של אוויר PFD equilibrated אל הבאר של אטם ג &#39;ל, אבל לא למלא את החדר לחלוטין. זה PFD יסייע למנוע את השמנה של בועות אוויר מתחת ללוח אגר כפי שהוא ממוקם לתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip מן לוח אגר (בשלב 2.2 לעיל) ולהשתמש סכין גילוח לחתוך חלק של דהגודל וצורה. ואז למקם אותו לתוך הבאר של אטם ג&#39;ל ( איור 1F ). צריך להיות פער של 2-4 מ&quot;מ על אטם מסביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את החדר לחלוטין עם אוויר equilibrated PFD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד או יותר שתלי thaliana A. (עד 3 שתילים עבור הדמיה מעל 2-3 ימים) על גבי לוח אגר עם cotyledons ו hypocotyl תלוי מעל הקצה, צף PFD ( איור 1G ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג שתילים, לעקר זרעים עם אתנול 70%, צמח על בינוני MS בינוני ½ בתוספת סוכרוז 1% ו אגר 0.8%, stratify עבור 2-4 ימים ב 4 ° C, ולגדול על לוחות בכיוון אנכי ב 22 ° C ב 16 שעה בהיר / 8 שעות משטר כהה. לקבלת הדמיה שורשים לרוחב, לגדל צמחים 7-10 ימים לפני העברת לתאי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסגור את החדר, להחיל coverslip מתאימים את אופטיקה של המטרה, בעדינות לחיצה על זה עם קצה של שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עד coverslipנשענת על שתי רצועות זכוכית ( איור 1H ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאבטח את coverslip עם רצועות של 1.25 ס&quot;מ micropore רחב חיתוך סרט קלטת בחצי אורך חכם על כל קצה אם רוצים ( איור 1I ). אפשר הדגימה להסתפק כ 30 דקות לפני ההדמיה. זה ממזער את תנועת הדגימה במהלך ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף כדי לשמור על מצע מבוקר לצמיחה. השתמש 20X / 0.7NA או 63X / 1.2NA מטרות CS2. </li></ol>

<ol>
	<li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods.">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Meth. 11, 22 (2015).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high+throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).</li><li>Baranenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+water.">Solubility of oxygen and carbon dioxide in water.</a> Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).</li><li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).</li><li>Littlejohn, G. R., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+imaging+Arabidopsis+leaves+using+perfluorodecalin+as+an+infiltrative+imaging+medium.">A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Littlejohn, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update:+improvements+in+imaging+perfluorocarbon-mounted+plant+leaves+with+implications+for+studies+of+plant+pathology,+physiology,+development+and+cell+biology.">An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology.</a> Front Plant Sci. 5, 140 (2014).</li><li>Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+in+liquid+perfluorocarbons.">Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons.</a> Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).</li><li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluid+Fluorocarbons+to+Study+Freezing+in+Plant+Tissues.">Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li><li>Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+thickness+dependence+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+membranes.">Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes.</a> J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).</li><li>Kirchhelle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Specification+of+Geometric+Edges+by+a+Plant+Rab+GTPase+Is+an+Essential+Cell-Patterning+Principle+During+Organogenesis+in+Arabidopsis.">The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis.</a> Dev Cell. 36, 386-400 (2016).</li><li>Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+division+and+elongation+underlying+the+developmental+acceleration+of+root+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).</li><li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+combinatorial+analysis+of+membrane+compartments+in+intact+plants+with+a+multicolor+marker+set.">Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set.</a> Plant J. 59, 169-178 (2009).</li><li>Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CLASP-modulated+cell+edge+barrier+mechanism+drives+cell-wide+cortical+microtubule+organization+in+Arabidopsis.">A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis.</a> Nat Commun. 2, 430 (2011).</li><li>Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototropism+and+Gravitropism+in+Lateral+Roots+of+Arabidopsis.">Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis.</a> Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).</li><li>Gendreau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+basis+of+hypocotyl+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).</li><li>von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+of+Plant+Roots+Growing+on+the+Surface+of+a+Gel.">Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel.</a> J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המוצגת כאן היא אסטרטגיה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה הדמיה confocal של פיתוח שורשים לרוחב עבור שניים עד שלושה ימים. בתקופות של עד 48 שעות, לא נצפו תופעות לוואי של מערכת ההדמיה על התפתחות שורש לרוחב. לאחר 48 שעות, הצמיחה השורשית הממוצעת החלה להאט, אם כי תת-קבוצה משמעותית של השורשים (37%) המשיכה לצמוח בקצב דומה לצמיחת השורש הממוצעת בצלחות. לכן, באמצעות הדמיה מספר גדול מספיק של שורשים, שורשים אשר הצמיחה איטית לאחר 48 שעות ניתן להרחיק. בדיקות סיסטמטיות של תאי ההדמיה לא בוצעו לתקופות ארוכות יותר מ -72 שעות, אך מומלץ להשתמש באסטרטגיות חלופיות אם יש צורך בתקופות הדמיה מורחבות. תאי הדמיה עשויים להישאר על הבמה מיקרוסקופ ברציפות, אם בתנאי הסביבה מתאימים מסופקים, או מוסר למתקן הצמיחה ומדי פעם חזר למיקרוסקופ. זה מאפשר חדרים רבים להיות צילמו במקביל/ P&gt; אחד היתרונות של החדרים המתוארים כאן הוא כי שורשים לרוחב קבועים במצבם והוא יכול להיות צילמו באמצעות ברזולוציה גבוהה עדשות טבילה במים. יציבות מרחבית ביקורתית תלוי ריכוז אגר בשימוש לוח אגר תמיכה. בתחילה נבדקו ריכוזים שונים של אגר 0.8% ל אגר של 2%, ומצאו כי ריכוזים גבוהים בטווח זה קבועים בשורשים קבועים בחלל, אך שורש הצמיחה הואט מהר יותר וחלק מהשורשים הראו סימני לחץ מכני, כולל התארכות תא מופחתת. לעומת זאת, ריכוזי אגר נמוכים לא סיפקו את התמיכה והשורשים הנדרשים ב- x, y ו- z במהלך ההדמיה. אופטימלית 1.5% אגר לוח מתקן את המיקום של הדגימה ללא תופעות מכניות שליליות. בתנאים אלה, לאחר ההתיישבות ב 30 דקות הראשונות או כך, שורשים יציבים על פני שעות רבות, המאפשר רכישת נתונים לילה. במהלך רכישת נתוני 4D, טווחי ערימת z היו בדרך כלל במחוררים על ידי 5-10 מיקרומטר נוסף אבל זה היה בעיקר כדי להתאים לצמיחה מחוץ לגובה של שורשים לרוחב ולא z- להיסחף או לנענע. למרות ריכוז אגר סטנדרטי מספק התנגדות מסוימת נגד חדירה, שורשים gravitropically גדל בסופו של דבר לחדור את אגר. עם זאת, באמצעות שינוי קטין של החדר הדמיה, שורש הצמיחה יכולה להישמר מקביל coverslip, המאפשר שורשים לרוחב מבוגר השורשים העיקריים להיות צילמו. יתר על כן, חדר הדמיה בסיסי יכול בקלות להיות מותאם אישית עבור hypocotyls. Hypocotyls הם יותר חופשי צף במערכת זו כך Z- ציר סוגר לרכישת התמונה הוגדלה בדרך כלל על 20 מיקרומטר. במחקר זה, מיקרוסקופ זקוף שימש בכל רחבי, אשר אפשרה את מאפייני המצע להיות נשלט. תא הדמיה יכול להיות מותאם לתצורות מיקרוסקופ הפוכה אבל ההשפעה תלוי זמן של coverslip נוקשה על מיירט איברים יהיה צורך להעריך. </p&gt; Littlejohn ועמיתיו יש לציין כי PFD עצמו אינו בקלות להמיס מולקולות ביולוגיות, כלומר זה לא ניתן להשתמש עבור ישירות עבור משלוח של תרכובות פרמקולוגיות 7 . בעיה זו היה להתגבר על ידי אספקת תרכובות כאלה דרך לוח של המדידה הצמיחה מוצק שבו מוטלת אגר. בעוד מערכות זלוף יישארו השיטה של ​​בחירה עבור לשטוף- out ניסויים, תא הדמיה שימש בהצלחה עבור ניהול של dexamethasone 12 ותרכובות אחרות. הערה אחת, בעוד מאמר זה היה בהכנה פון Wagenheim ועמיתיו 18 תיאר חדר הדמיה פיתוח שורש לרוחב באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון.

כדי לחקור את התהליכים הסלולר והתת-קרקעיים המונחים ביסוד פיתוח הצומח, יש ביקוש גובר לפתרונות הדמיה לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה. האתגר העיקרי בניסויים הדמיה כזו היא שמירה על תנאים פיזיולוגיים כולל חילופי גזי מספיק בתוספת אספקת מים וחומרים מזינים 1 , 2 , 3 . כדי לנצל את היעדים עם פתחים מספריים גבוהים עבור רזולוציה אופטית אופטימלית, דגימות צריך להיות ממוקם בקירבה מקבילה בכיוון מקביל coverslip. התנועה x, y, ו- z כיוונים צריך אידיאלי להיות מינימלי במהלך הדמיה. בעוד שתילים הם רכוב לעתים קרובות במים או תמיסה מימית עבור הדמיה לטווח קצר, מים יש קיבולת נמוכה עבור המסת CO2 ו O 2 (1.54 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו 0.04 מ&quot;ג / מ&quot;ל, בהתאמה ב 20 ° C, 0.1 מגפ&quot;ס) 4 , מה שהופךזה לא מתאים עבור זמן ארוך לשגות ניסויים. מערכות זלוף כי לשמור על רמות קבועות של חמצן וחומרים מזינים הם פתרון אחד לבעיה זו פותחו עבור מיקרוסקופיה לייזר סריקה confocal (CLSM) 1 , 2 , 3 ו מיקרוסקופ גיליון אור (LSM) 5 . מערכות כמו RootChip 2 ו RootArray 3 תוכננו במיוחד עבור זמן לשגות הדמיה של השורשים המתפתחים לערב נביטה זרעים במודל מותאם אישית לבנות רב הדגימה. סידורים אלה מבטיחים הפרעה מכנית מינימלית ומעוצבים לניתוח מקבילי של שתילים מרובים, אך אינם מותאמים להדמיה של מבנים תת-תאיים. קאלדר ועמיתיו עיצבו תא מורכבת יותר זלוף מבוסס הדמיה אופטימיזציה עבור הדמיה של מבנים subcellular שבו הדגימה מוחזקת בעמדה על ידי רשתכדי לאפשר את השימוש של עדשות טבילה הגדלה גבוהה 1 . הציג כאן פתרון חלופי, פשוט לבעיה זו אשר אינו מבוסס על מערכות זלוף, אך מנצל perfluorodecalin (PFD), perfluorocarbon כי זכה לאחרונה הפופולריות כמדיום גובר עבור הדמיה ארבידופסיס 6 , 7 , 8 . ביישומים כאלה, קיבולת גבוהה של PFD עבור המסת CO 2 ו O 2 (1.9 גרם / מ&quot;ל ​​עבור O 2 ב PFD לעומת 0.04 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים) 9 , מאפשר החלפת גזי ידי הרקמה שקוע. יתר על כן, PFD הוא לא פלואורסצנטי ומדד השבירה שלו (1.313) הוא דומה לזה של מים (1.333) והוא קרוב יותר לזה של cytosol (~ 1.4) מאשר אוויר (1.000) 6 . Fluluorocarbons דווחו יש השפעה מינימלית פיזיולוגית על מגוון רחב של צמחים צמח לאבעיות 6 , עם זרעי צנון נובטים בקלות כאשר שקוע PFD ומציג צמיחה נורמלית ופיתוח לפחות שני ימים מלאים, כאשר מסופק עם מים 10 . תצפיות דומות נעשו עבור נביטה של זרעי ארבידופסיס . בהתבסס על גירוי ראמאן פיזור ישיר לתמונה הפצה של PFD ב רקמות ארבידופסיס עלה לאחר חדירת, ליטג&#39;ון ועמיתיו למסקנה כי PFD סביר להניח לא נלקח על ידי תאים חיים 8 . PFD בעבר שימש בעיקר כדי התמונה רקמות אוויר, שבו זה מגדיל באופן משמעותי את עומק הדמיה כפי שהוא בקלות חדירת מרחבי האוויר עקב מתח נמוך שלה משטח 6 . הנה, PFD הוא אימץ עבור הדמיה confocal לטווח ארוך של פיתוח שורשים לרוחב. בתצורה זו, שתילים אחד או יותר ממוקמות על לוח של בינונית צמיחה מוצק עם אגר ו שקוע PFD. PFD מאפשר gחילופי אדים בתא הדמיה, מניעת anoxia. PFD הוא נדיף מאוד ולכן הוא נשמר על ידי אטם של מסטיק פולי (dimethylsiloxane), כי יש גם חדירות גז גבוהה (1.5 x 10 -12 pmol מ -1 -1 s -1 אבא -1 עבור CO 2 ) 11 . חומרים מזינים ומים מסופקות על ידי לוח של solidified בינוני עם אגר. במקביל, זה לוח אגר בעדינות לוחץ את השורש נגד coverslip, ובכך לתקן את המיקום היחסי שלה בחדר הדמיה ומאפשר את השימוש ברזולוציה גבוהה עדשות טבילה במים. יתר על כן, לוח אגר ניתן להשתמש כדי לנהל מגוון של טיפולים תרופתי, כולל dexamethasone, oryzalin, ו isoxaben. תאי הדמיה ניתן להרכיב במספרים גדולים מן שקופיות מיקרוסקופ סטנדרטי באמצעות ציוד מינימלי. תאי ההדמיה פותחו ואופיינו ללימוד התפתחות שורש לרוחב, אך ניתנים להתאמה לדמיית איברים אחרים, כגון שורש ראשוני,היפוקוטילים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Perfluorodecalin</td>
			<td style="width:191px;">F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td>
			<td style="width:119px;">FLUTEC PP6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Poly(dimethylsiloxane) gum&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td>
			<td style="width:119px;">Item # 132700</td>
			<td style="width:167px;">Carolina Observation Gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cavity Microscope Slides</td>
			<td>VWR International Ltd, Lutterworth,&#160;UK</td>
			<td style="width:119px;">10118-600</td>
			<td>Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td style="width:119px;">604753</td>
			<td>Any &#39;super-glue&#39; suitable for glass will probably suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cellulosic cellophane membrane</td>
			<td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td>
			<td colspan="2">325P cellulose film; 80mm disc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

כמה היבטים של פיתוח צמחים, כגון מורפוגנזה שורש לרוחב, להתרחש על פני זמן של כמה ימים. כדי לחקור את התהליכים הבסיסיים התאים הסלולר, זמן ברזולוציה גבוהה לשגות אסטרטגיות מיקרוסקופיה כי לשמר תנאים פיזיולוגיים נדרשים. רקמות הצמח חייב להיות מזין נאותה אספקת מים עם חילופי גזי מתמשכת אבל, כאשר שקוע משותק תחת coverslip, הם רגישים במיוחד anoxia. אסטרטגיה אחת אשר הועסק בהצלחה היא השימוש במערכת זלוף כדי לשמור על אספקה ​​מתמדת של חמצן וחומרים מזינים. עם זאת, הסדרים כאלה יכול להיות מסובך, מסורבל, ודורשים ציוד מיוחד. מוצג כאן היא אסטרטגיה חלופית עבור מערכת הדמיה פשוטה באמצעות perfluorodecalin כמו מדיום טבילה. מערכת זו היא קלה להתקנה, דורש ציוד מינימלי, והוא רכוב בקלות על הבמה מיקרוסקופ, המאפשר מספר חדרי הדמיה להיות מוגדר הדמיה שווהאלל. במערכת זו, שיעורי הצמיחה שורש לרוחב הם נבדלים משיעורי צמיחה בתנאים סטנדרטיים על צלחות אגר במשך היומיים הראשונים, וצמיחה שורש לרוחב ממשיך בשיעורים מופחתים לפחות עוד יום. רקמות הצמח מסופקים עם חומרים מזינים דרך אגר לוח זה יכול לשמש גם כדי לנהל מגוון של תרכובות פרמקולוגיות. המערכת הוקמה כדי לפקח על התפתחות שורש לרוחב, אבל הוא להתאמה בקלות התמונה איברים צמח אחרים כגון hypocotyls השורשים העיקריים.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development at JoVE.com

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Views.  University of Oxford.  מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה. 

Video: A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use products. Based on their chemical structure and estradiol-like biological properties, they have been classified as endocrine disrupting compounds (EDC). Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked to various health defects including cancer, behavioral disorders and infertility, with greater vulnerability indicated during early developmental periods. Cellular and molecular studies with the genetically tractable nematode model Caenorhabditis elegans have demonstrated that exposure to BPA causes apoptosis, embryonic lethality and disruption in the DNA repair mechanisms. We have previously reported that exposure of C. elegans embryos to low doses of different bisphenols decreases fecundity. In addition, we have shown that the effects of exposure during the very early stages of development persist into adulthood as assayed by quantifying habituation behavior, a form of non-associative learning. Here, we provide detailed protocols for embryonic exposure to low-dose EDCs as well as the associated fecundity and anterior touch habituation assays, along with representative results.

Exposure to environmental toxicants can acutely impact development with long-term effects. Detailed protocols are provided to illustrate a strategy using an effective lab model to study the effect of early embryonic exposure to bisphenol A. We provide fecundity and behavioral assays to monitor the effectiveness of our toxicant exposure bio-assays.

השלכות התנהגותיות, הרבייה לטווח ארוך של חשיפה עובריים חשיפה לרעלים במינון נמוך

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניתוח