Name: a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development
Uploaded: 2017-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development at JoVE.com

Tohum ekspres RFP-TUB6 ve faydalı düzeltmeler için isimsiz bir inceleme uzmanı olan British Columbia Üniversitesi&#39;nden Prof. Geoffrey Wasteneys&#39;e teşekkür ediyoruz. Profesör Hugh Dickinson&#39;a mekanik bir destek olarak selüloz filmi ve fotoğraf için John Baker&#39;i bizi uyarması için minnettarız. Bu çalışma BBSRC araştırma hibeleri BB / G013993 / 1 ve BB / D004055 / 1 IM tarafından desteklendi ve bir BBSRC Doktora Eğitim Ödülü ve CK Clarendon Bursu

1. Oda Oluşturma <ol><li> Bir cam kesici kullanarak, 1 mm kalınlığında bir mikroskop lamasının ucundan 3 mm genişliğinde şeritleri kesin. Bir siyanoakrilat süper yapıştırıcı veya çift taraflı bant kullanarak, bu cam şeritleri yaklaşık 45 mm uzaklıkta ikinci bir mikroskop lamı boyunca geniş tutkal edin ( Şekil 1A ). Oda başına bir slayt gereklidir, ayrıca agar plakaları dökmek için ilave slaytlar gerekir (bir slaytta 2-3 agar plak oluşur). Slaytlar tekrar kullanılabilir. </li><li> Cam şeritler arasında, gaza nüfuz eden poli (dimetilsiloksan) zamktan aynı yükseklikte bir conta oluşturun. Slayt üzerine poli (dimetilsiloksan) sakız topu koyun ( Şekil 1B ), ikinci bir slaydı az miktarda% 100 mutlak etanol ile ıslatın ve ikinci slaytla poli (dimetilsiloksan) sakız topunu yüksekliğe ulaşıncaya kadar düzleştirin ( Şekil 1C ). <ol><li> Gerekirse fazla poly (dimeTilsiloksan) sakızın tıraş bıçağı ile yıkanması ve düzleşmenin tekrarlanması. </li></ol></li><li> Mutlak etanolde ıslatılmış uygun bir kesici veya jilet kullanarak, daha sonra fide ve agar levhayı tutacak boşluğu oluşturmak için poli (dimetilsiloksan) sakızının iç kısmını çıkarın ( Şekil 1D ). </li><li> Yaklaşık 2 mm&#39;lik bir son duvar kalınlığına sahip bir conta oluşturmak için jiletin dikkatli bir şekilde traş bıçağı ile düzeltilmesi ( Şekil 1E ). Gazların bir poli (dimetilsilaksan) bariyeri içerisinden geçirgenliği, 50 μm&#39;nin üzerindeki kalınlıklardan bağımsızdır 11 . </li></ol> 2. Agarla Katılaşmış Büyüme Orta Levrağını Oluşturma <ol><li> İki cam şeritli mikroskopik bir slaytta, iki cam şerit üzerine oturacak şekilde lamel yerleştirin (22 mm x 50 mm). </li><li> Elde edilen boşluğa% 1 w / v sukroz ve% 1.5 w / v agar (½ MS) içeren pipet eritilmiş yarı kuvvetli Murashige ve Skoog büyüme ortamıSonuncusu tamamen dolana kadar (yaklaşık 1 mL toplam hacim) lamelin altına yerleştirin ve agara ayarlanıncaya kadar bırakın (yaklaşık 5 dak.). Not: Farmakolojik bileşikler, döşeme dökülmeden önce sıvı ortama uygun konsantrasyonların eklenmesiyle agar plakasından uygulanabilir. Bu, deksametazon 12 , izoksaben, 2,6-diklorobenzonitril (DCB), oryzalin ve latrunculin B için başarıyla test edildi. </li></ol> 3 . Oda Kurulumunun Tamamlanması <ol><li> Hava, küçük bir hacimdeki PFD&#39;yi bir tüpte sallayarak PFD&#39;yi dengeye çıkarır 7 . Jel contanın kuyusuna hava ile dengelenmiş küçük miktar (yaklaşık 200 mcL) hava-dengelenmiş PFD ekleyin, ancak bölmeyi tamamen doldurmayın. Bu PFD, odaya yerleştirildiğinde agar plakasının altındaki hava kabarcıklarının tıkanmasını önlemeye yardımcı olacaktır. </li><li> Agar levhasındaki lamelleri çıkarın (yukarıdaki adım 2.2&#39;de) ve bir kısmını kesmek için tıraş bıçağı kullanınBoyutu ve şekli. Daha sonra jel contanın kuyusuna yerleştirin ( Şekil 1F ). Contanın her yerine 2-4 mm boşluk bırakılmalıdır. </li><li> Odayı hava ile dengelenmiş PFD ile tamamen doldurun. </li><li> PFD&#39;de ( Şekil 1G ) yüzen, kotiledonlar ve hipokotil kenar üzerinde asılı olan agar döşeme üzerine bir veya daha fazla A. thaliana fidanı (2-3 gün boyunca görüntüleme için 3 fide kadar) yerleştirin. </li><li> Fideler elde etmek için tohumları% 70 etanol, 1% sükroz ve% 0.8 agar ile takviye edilmiş ½ MS ortamında tohum sterilize edin, 4 ° C&#39;de 2-4 gün süreyle tabakalandırın ve 16 ° C&#39;de 22 ° C&#39;de dikey yönlendirilmiş plakalarda büyütün H hafif / 8 saat karanlık rejim. Yanal kökleri görüntüleme için, görüntüleme odalarına aktarılmadan önce 7-10 gün boyunca bitkiler yetiştirin. </li><li> Odası kapatmak için, objektif optik uygun bir lamel uygulayın, hafifçe lamel kadar bir cam mikroskop lamı kenarıyla aşağı bastırıyorHer iki cam şerit üzerine oturmaktadır ( Şekil İH ). </li><li> İstenirse, lamelin her iki ucunda yarım uzunlukta kesilmiş 1.25 cm genişliğinde mikrogözenek cerrahi bant şeritleri ile sabitleyin ( Şekil 1I ). Görüntülemeden önce numunenin yaklaşık 30 dakika yerleşmesine izin verin. Bu görüntüleme sırasında numune hareketini en aza indirir. </li><li> Büyüme için kontrollü bir altlığı korumak için dik bir mikroskop ile görüntüleme gerçekleştirin. 20X / 0.7NA veya 63X / 1.2NA CS2 hedeflerini kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods.">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Meth. 11, 22 (2015).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high+throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).</li><li>Baranenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+water.">Solubility of oxygen and carbon dioxide in water.</a> Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).</li><li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).</li><li>Littlejohn, G. R., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+imaging+Arabidopsis+leaves+using+perfluorodecalin+as+an+infiltrative+imaging+medium.">A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Littlejohn, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update:+improvements+in+imaging+perfluorocarbon-mounted+plant+leaves+with+implications+for+studies+of+plant+pathology,+physiology,+development+and+cell+biology.">An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology.</a> Front Plant Sci. 5, 140 (2014).</li><li>Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+in+liquid+perfluorocarbons.">Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons.</a> Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).</li><li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluid+Fluorocarbons+to+Study+Freezing+in+Plant+Tissues.">Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li><li>Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+thickness+dependence+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+membranes.">Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes.</a> J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).</li><li>Kirchhelle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Specification+of+Geometric+Edges+by+a+Plant+Rab+GTPase+Is+an+Essential+Cell-Patterning+Principle+During+Organogenesis+in+Arabidopsis.">The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis.</a> Dev Cell. 36, 386-400 (2016).</li><li>Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+division+and+elongation+underlying+the+developmental+acceleration+of+root+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).</li><li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+combinatorial+analysis+of+membrane+compartments+in+intact+plants+with+a+multicolor+marker+set.">Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set.</a> Plant J. 59, 169-178 (2009).</li><li>Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CLASP-modulated+cell+edge+barrier+mechanism+drives+cell-wide+cortical+microtubule+organization+in+Arabidopsis.">A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis.</a> Nat Commun. 2, 430 (2011).</li><li>Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototropism+and+Gravitropism+in+Lateral+Roots+of+Arabidopsis.">Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis.</a> Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).</li><li>Gendreau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+basis+of+hypocotyl+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).</li><li>von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+of+Plant+Roots+Growing+on+the+Surface+of+a+Gel.">Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel.</a> J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada sunulan yöntem, iki ila üç gün boyunca gelişen yanal köklerin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme için basit bir stratejidir. 48 saate kadar periyodlar için, görüntüleme sisteminin yanal kök gelişimine olumsuz etkisi gözlemlenmemiştir. 48 saat sonra, ortalama yanal kök büyümesi yavaşlamaya başladı, ancak köklerin önemli bir alt kümesi (% 37) plakalardaki ortalama kök büyümesiyle karşılaştırılabilir oranlarda büyümeye devam etti. Bu nedenle, yeteri kadar sayıda kök görüntüleyerek, büyümesi 48 saat sonra yavaşlayan kökler hariç tutulabilir. Görüntüleme odalarının sistematik testleri 72 saatten uzun süreler için gerçekleştirilmedi, ancak uzatılmış görüntüleme periyotları aranıyorsa alternatif stratejiler önerilir. Görüntüleme odaları, eğer uygun çevresel koşullar sağlanırsa veya bir büyüme tesisine kaldırılır ve mikroskopta periyodik olarak geri gönderilirse, mikroskop sahnesinde sürekli olarak bırakılabilir. Bu, sayısız odaların paralel olarak görüntülenmesini sağlar. &lt;/ P&gt; Burada açıklanan odacıkların bir avantajı, yanal köklerin konumlarına sabitlenmesidir ve yüksek çözünürlüklü su daldırmalı lensler kullanılarak görüntülenebilir. Mekansal kararlılık kritik olarak destekleyici agar levhasında kullanılan agar konsantrasyonuna bağlıdır. Başlangıçta bu aralıktaki yüksek konsantrasyonların uzaydaki kökleri sabitlediğini, ancak kök büyümesinin daha hızlı yavaşladığını ve bazı köklerin, azalmış hücre uzaması da dahil olmak üzere mekanik stres belirtileri sergilediğini ortaya koyan başlangıçta% 0.8 agardan% 2 ağza kadar çeşitli konsantrasyonlar test edildi. Buna karşılık, düşük agar konsantrasyonları, gerekli destek sağlamadı ve görüntüleme sırasında x, y ve z&#39;de sürüklenen kökler. Optimum% 1.5 agar kütüğü, olumsuz mekanik etkiler olmadan numunenin konumunu düzeltir. Bu koşullar altında, ilk 30 dakika içerisinde yerleştikten sonra, kökler gece gündüz veri edinimine izin vererek, birçok saat boyunca kararlıdır. 4D verilerinin edinimi sırasında z-yığın aralıkları genelde bEk bir 5-10 um ile raketlenmişti, ancak bu temelde z-drift veya sallantıdan ziyade yanal köklerin düzlem dışı büyümesini barındıracaktı. Standart agar konsantrasyonu penetrasyona karşı bir miktar direnç sağlamasına karşın, gravitropik olarak büyüyen kökler agara nihayet nüfuz eder. Bununla birlikte, görüntüleme odasının ufak bir modifikasyonuyla, kök büyümesi lamel paralel olarak paralel tutulabilir, böylece daha büyük lateral kökler ve birincil kökler görüntülenebilir. Dahası, temel görüntüleme bölmesi, hipokotiller için kolayca özelleştirilebilir. Hypocotyls bu sistemde daha serbestçe yüzer, bu nedenle görüntü yakalama için z ekseni braketi genellikle yaklaşık 20 μm&#39;ye kadar yükselmiştir. Bu çalışmada, substrat özelliklerinin kontrol edilmesine izin veren dik bir mikroskop kullanılmıştır. Görüntüleme odası, ters mikroskop konfigürasyonlarına uyarlanabilir, ancak organları müdahale etmek için katı örtücülerin zamana bağlı etkisi değerlendirilmelidir. </p&gt; Littlejohn ve meslektaşları, PFD&#39;nin kendisinin biyolojik molekülleri kolayca çözmediğini ve bunun farmakolojik bileşiklerin 7 sağlanması için doğrudan kullanılamayacağı anlamına geldiğini belirtti. Bu problem, bu bileşiklerin agar levhasının üzerinde durduğu katılaşmış büyüme ortamı plakası içinden temin edilerek engellendi. Perfüzyon sistemleri yıkama deneyleri için tercih edilen yöntem olmaya devam ederken, görüntüleme bölmesi deksametazon 12 ve diğer bileşiklerin uygulanması için başarıyla kullanılmıştır. Bir makale, bu makale von Wagenheim ve meslektaşları18 hazırlanırken, ışık saçlı mikroskopi kullanılarak yanal kök gelişimini görüntüleyen bir odayı açıkladı.

Bitki gelişiminin altında yatan hücresel ve subselüler süreçleri incelemek için, yüksek çözünürlüklü uzun vadeli zaman atlamalı görüntüleme stratejileri için artan bir talep vardır. Bu tür görüntüleme deneylerinde kilit bir zorluk, yeterli gaz alışverişi artı bir su ve besin maddesi arzı 1 , 2 , 3 artı içeren fizyolojik koşulların bakımıdır. Optimum optik çözünürlük için yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip objektifleri kullanmak için, numuneler lamine camlara paralel olarak yerleştirilmelidir. Görüntüleme sırasında x, y ve z yönlerinde hareket ideal bir şekilde minimum olmalıdır. Fide genellikle kısa süreli görüntüleme için suya veya sulu çözeltiye monte edilirken, su, CO 2 ve O 2&#39;yi çözmek için düşük kapasiteye sahiptir (sırasıyla 20 ° C, 0.1 MPa&#39;da 1.54 mg / mL ve 0.04 mg / mL) Hangi yaparUzun zaman atlamalı deneyler için uygun değildir. Sürekli oksijen ve besleyici seviyelerini koruyan perfüzyon sistemleri bu sorunun bir çözümündedir ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) 1 , 2 , 3 ve ışık levha mikroskopisi (LSM) için geliştirilmiştir. RootChip 2 ve RootArray 3 gibi sistemler, gelişmekte olan köklerin zaman aşımı görüntülemesi için özel olarak tasarlanmış ve özel olarak inşa edilmiş çok örnekli bir aygıta çimlenen tohumları dahil etmiştir. Bu düzenlemeler minimal mekanik bozulmayı sağlar ve birden fazla fidenin paralel analizi için tasarlanmıştır, ancak subselüler yapıların görüntülenmesi için optimize edilmemiştir. Calder ve meslektaşları, alt hücreli yapıların görüntülenmesi için optimize edilmiş daha karmaşık bir perfüzyon tabanlı görüntüleme haznesi tasarladılar; buradaki örnek, bir ağ tarafından konumunda tutulduYüksek büyütmeli daldırma merceklerinin kullanılmasına izin vermek için 1 . Burada, perfüzyon sistemlerine dayalı olmayan, ancak yakın zamanda Arabidopsis görüntüleme 6 , 7 , 8 için bir montaj aracı olarak popülerlik kazanan bir perflorokarbon olan perflorodekalin (PFD) kullanan, bu probleme alternatif, basit bir çözüm sunulmuştur . Bu tür uygulamalarda, CO 2 ve O 2&#39;yi çözmek için PFD&#39;nin yüksek kapasitesi (PFD&#39;de O 2 için 1.9 g / mL, sudaki 0.04 mg / mL&#39;ye kıyasla) 9 dalmış doku ile gaz değişimine izin verir. Ayrıca, PFD floresan değildir ve refraktif indeksi (1.313) suyun (1.333) ile karşılaştırılabilir ve hava (1.000) 6&#39;ya göre sitosolünkine (~ 1.4) daha yakındır. Perflorokarbonların, çeşitli bitkiler ve bitki türleri üzerinde minimum fizyolojik etkisi olduğu bildirilmiştir.Çay tohumları, PFD&#39;ye batırıldığında kolayca çimlenir ve su ile beslendiğinde en az iki tam gün normal büyüme ve gelişme gösterir. Benzer gözlemler, Arabidopsis tohumlarını çimlemek için yapılmıştır 6 . Littlejohn ve meslektaşları, sedimantasyondan sonra Arabidopsis yaprak dokularında PFD dağılımını doğrudan görüntüleyecek uyarılmış Raman saçılımına dayanarak, PFD&#39;nin canlı hücreler tarafından alınmayacağına karar verir. PFD daha önce, düşük yüzey gerilimi nedeniyle hava boşluklarına kolayca nüfuz ederek görüntü derinliğini önemli derecede arttıran görüntü anten dokuları için ağırlıklı olarak kullanılmıştır. Burada, PFD, lateral köklerin gelişiminin uzun vadeli konfokal görüntülemesi için benimsenmiştir. Bu konfigürasyonda, bir veya daha fazla fide agar ile katılaşmış ve PFD&#39;ye batırılmış bir büyüme ortamı plakası üzerine yerleştirilir. PFD, gGörüntüleme odasında aseöz değişim, anoksi önleme. PFD, yüksek gaz geçirgenliği olan poli (dimetilsiloksan) zamk contası (CO 2 için 1.5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 ) 11 ile tutulduğu için oldukça uçucudur. Besinler ve su, agar ile katılaşmış ortam plakasıyla sağlanır. Aynı zamanda, bu agar plakası nazikçe lamel karşı kök presler, böylece görüntüleme odasında göreli konumu sabitleme ve yüksek çözünürlüklü su daldırma lenslerin kullanımına izin veriyor. Ayrıca, agar kütüğü dexamethasone, oryzalin ve isoksaben dahil bir dizi farmakolojik tedavinin uygulanmasında kullanılabilir. Görüntüleme odaları, asgari ekipman kullanılarak standart mikroskopik slaytlardan çok sayıda monte edilebilir. Görüntüleme odaları, yanal kök gelişimini incelemek üzere geliştirildi ve karakterize edildi, ancak birincil kök ipuçları gibi diğer fide organlarını görüntülemeye vehipokotilleri.

<table><tbody><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) gum&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td><td>Item # 132700</td><td>Carolina Observation Gel</td></tr><tr><td>Cavity Microscope Slides</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth,&amp;nbsp;UK</td><td>10118-600</td><td>Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>Any &#039;super-glue&#039; suitable for glass will probably suffice</td></tr><tr><td>Cellulosic cellophane membrane</td><td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td><td></td><td>325P cellulose film; 80 mm disc</td></tr></tbody></table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

Yanal kök morfogenezisi gibi bitki gelişiminin birkaç yönü, birkaç günün zaman aralıklarında meydana gelir. Altta yatan hücresel ve subselüler süreçleri incelemek için, fizyolojik koşulları koruyan yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı mikroskopi stratejileri gereklidir. Bitki dokularında, sürekli gaz değişimi ile yeterli besin ve su temini olmalıdır; ancak lamel altına batırılmış ve hareketsiz hale getirildiğinde, anoksiye karşı özellikle hassastırlar. Başarılı bir şekilde uygulanan bir strateji, oksijen ve besin maddelerinin sürekli bir şekilde tedarik edilmesi için bir perfüzyon sisteminin kullanılmasıdır. Bununla birlikte, bu gibi düzenlemeler karmaşık, hantal olabilir ve özel ekipman gerektirir. Burada, daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılan basit bir görüntüleme sistemi için alternatif bir strateji sunulmuştur. Bu sistemin kurulumu kolaydır, minimum ekipman gerektirir ve birkaç görüntüleme haznesinin kurulmasına ve eşit olarak görüntülenmesine imkân tanıyan bir mikroskop sahnesine kolayca monte edilir.allel. Bu sistemde, yanal kök büyüme oranları ilk iki gün boyunca agar plakalarında standart koşullardaki büyüme hızlarından ayırt edilemez ve yanal kök büyümesi en az bir gün daha düşük oranlarda devam eder. Bitki dokuları, aynı zamanda bir dizi farmakolojik bileşimi uygulamak için kullanılabilen bir agar plakası yoluyla besinlerle birlikte verilir. Sistem yanal kök gelişimini izlemek için kurulmuştur ancak hipokotiller ve birincil kökler gibi diğer bitki organlarına kolayca uyarlanabilir.

Yanal kökler görüntüleme odalarında fizyolojik oranlarda büyür. Görüntüleme odalarındaki bitkilerin yanal kök uzunlukları, saatlik aralıklarla ( Şekil 2A , sol, Film 1, n = 23) ölçülmüş ve büyüme oranları, aynı agar-katılaştırılmış ortamı içeren standart Petri plakalarında yetiştirilen lateral köklerinkiyle karşılaştırılmıştır ( Şekil 2 2A , sağ, Film 2, n = 23). Büyüme oranları, artan oranda büyüme ve çoğalma bölgelerinden dolayı kökün bir belirleyici faktör olduğu uzunlamasına yan kökler arasında büyük farklılıklar gösterebilir. Bu nedenle, lateral kök setleri hem görüntüleme odasında hem de agar plakasında farklı başlangıç ​​uzunluklarının (50 um ila 1150 um aralığında) köklerini temsil edecek şekilde seçilmiştir. Deneyin başlangıcında ortalama yan kök uzunluğuHer sette (sırasıyla görüntüleme bölmeleri ve plakaları için 439 ve 442 μm) benzerdi. Analiz edilen 27 saatlik zaman aralığında yanal kök büyümesi hem görüntüleme odaları hem de plakalar üzerinde yaklaşık olarak lineerdi, plakalarda ortalama 52 um / saat (R2 = 0.997) ve görüntüleme odalarında 51 um / saat&#39;lik bir büyüme oranı vardı R2 = 0.993) ( Şekil 2B ). Hem levhalar üzerinde hem de görüntüleme bölmelerinde ( Şekil 2C ) oldukça değişken olan bireysel yanal köklerin büyüme oranları, görüntüleme odacıklarında 17 μm / saat ila 82 μm / saat arasında ve plakalarda 13 μm / saat ila 87 μm / sa arasındadır. Büyüme oranları genelde kök uzunluğu ile birlikte artarken, büyüme oranları halen benzer uzunlukta olan kökler arasında değişmekle birlikte, görüntüleme odaları ve plakalarda varyans benzerdir. Yanal kökler görüntüleme odalarında çoğalır ve hiGh sayısal diyafram hedefleri. Plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP 14 ve mikroplak işaretleyici UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15&#39;u birlikte ifade eden yanal kökler, görüntüleme bölmelerinde hücre proliferasyonu sırasında mikrotübül davranışını belgelemek için CLSM 10 ile 1 saat aralıklarla görüntülendi ( Şekil 2D , Film 3). Bu odacıklarda, yanal kökler, x, y ve z eksenlerindeki konumlarında son derece kararlıydı ve birkaç saat boyunca sürekli zaman atlamalı konfokal yığınların edinilmesine izin verdi. Önceden ortaya çıkan bantların ( Şekil 2D , yeşil oklar), mitotik iğlerin ( Şekil 2D , beyaz oklar) ve fragmoplastların ( Şekil 2D , mavi oklar) oluşumundan anlaşılacağı üzere, meristematik hücreler sürekli çoğalırlar. Petri tabaklarındaki fidanlarda olduğu gibi,Görüntüleme odacıklarında tamamen uzamış kök hücreler kök tüyleri başlattı ( Şekil 2A , Şekil 2D , ok başları), bu gelişmenin görüntüleme odalarında beklendiği gibi ilerlediğini gösteriyordu. Geniş bir görüş alanı sağlamak için Şekil 2D&#39;deki görüntüler 20x / 0.7 NA hedefiyle elde edilmiştir. Yüksek rakamsal açıklık 63x / 1.2 NA suya daldırma objektif kullanarak yüksek oranda yanal kök görüntüleri elde etmek de mümkün olmuştur ( Şekil 2E ). Yanal kök büyümesi görüntüleme odalarında üç güne kadar sürdürülür. Görüntüleme odalarının fizyolojik oranlarda yanal kök gelişimini ne kadar süreyle destekleyebileceğini araştırmak için görüntüleme odalarında (n = 27) ve plakalardaki (n = 33) yanal kök uzunluğu 0 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saatte ölçülmüştür. Kökler choSen 0 saatte 200 μm&#39;den daha kısa, ortalama yan kök uzunluğu 117 μm olan görüntüleme bölmelerinde ve 121 μm kalınlığında plakalardı. Daha kısa kökler ortalama olarak daha yavaş büyümesine karşın ( Şekil 2C ), agar levhanın kenarından daha az büyüdüler ve daha kolay görüntü çekiyordu. İlk 48 saatte tüm yanal köklerin ortalama büyümesi Petri plakalarına kıyasla görüntüleme odalarında anlamlı farklılık göstermedi ( Şekil 3A ). Bununla birlikte, ortalama büyüme 48 saat ile 72 saat arasında önemli ölçüde azaldı ( Şekil 3A ). Büyüme oranları genel olarak 48 saat sonra görüntüleme odalarını yavaşlatır gibi görünse de, bireyler arasındaki büyüme oranları oldukça değişkendir ( Şekil 3B , 3C ) ve bu da plakalarda ve odalarda kıyaslanabilir oranlarda büyüyen yanal köklerin önemli bir alt kümesi olduğu anlamına gelmektedir 72 saatlik büyüme dönemi boyunca. Yetiştirilen 33 yan kökün 23&#39;ü(% 69.7) 72 saatte ortalama uzunluğun bir standart sapması (927 ila 3.116 μm, Şekil 3B , kırmızı) arasında bir uzunluğa ulaşmaktadır. Görüntüleme odacıklarının 10&#39;unda (% 37.0) yanal kökler bu aralıkta bir uzunluğa ulaşmaktadır ( Şekil 3B , kırmızı). Görüntüleme odaları daha yaşlı yanal kökler, birincil kökler ve hipokotiller için kolayca adapte edilebilir . Orijinal görüntüleme odacığının tasarımının sınırlamalardan biri, sert agar plakası bazı mekanik direnç sağlamasına rağmen gravitropik olarak büyüyen kökler sonunda agar plakasına nüfuz ederek görüntü kalitesinde kayba ( Şekil 4B ) ve yüksek NA&#39;nın çalışma mesafesinin ötesinde büyümesine neden oldu Lensler, nispeten uzun çalışma mesafesi (0.3 mm) 63X / 1.3 NA CS2 hedefi. Genç lateral kökler, statolit içerenGravitropizm için gerekli olan kolumnella hücreleri 17 olduğundan başlangıçta görüntüleme odacıklarındaki lamellerle paraleldirler ( Şekil 2E ). Daha uzun süre büyüdükçe ve kolumnella ve statolitler oluştuğunda, yan kökler artan pozitif yerçekimi etkileri gösterirken, birincil kökler çimlenmeden sonra güçlü bir yerçekimi tepkisi göstermektedir. Bu, birincil köklerin görüntüleneceği birkaç saati sınırlar ve 48 saat veya daha fazla süreyle sürekli olarak görüntülenecek olan yanal köklerin başlangıç ​​uzunluğunu ciddi ölçüde sınırlar. Bu kısıtlamanın üstesinden gelmek için, bölme, büyüme, agar levhanın yüzeyinde bir penetrasyon bariyeri olarak işlev gören bir selülozik selofan zar tarafından lamel paralel tutulacak şekilde değiştirildi ( Şekil 4A ). % 1.5 agar kütüğünü kullanan ilk denemeler, belki de mekanik strese bağlı olarak, ilk 24 saat içinde azalmış kök gelişimine neden oldu. Döşeme altındaki agar konsantrasyonları,D% 0.8 agar ve selüloz film içeren bir levhalı odacıklarda, genç yanal kök büyüme oranları, ilk 48 saat boyunca geleneksel odacıklardaki büyüme hızlarından belirgin olarak farklı olmadığı bulunmuştur. 0-24 saat boyunca, selüloz odaları ve konvansiyonel odacıklardaki ortalama kök büyümesi sırasıyla 242 μm ve 262 μm idi (p = 0.78 Student&#39;s t-Testi) ve 24-48 saat boyunca sırasıyla 330 μm ve 355 μm 1 idi (p = 0.67 Student&#39;s t-testi); Sırasıyla n = 12 ve n = 11&#39;dir. Bu düzenleme, yanal köklerin lamelden agar içine uzamasını ve ayrıca 48 saat boyunca primer köklerin görüntülenmesine izin vermesini etkili bir şekilde önledi ( Şekil 4C ). Görüntüleme odalarının kök dışında organlar için uyarlanıp ayarlanamayacağını test etmek için Arabidopsis hipokotilleri seçildi. Hipokotiller, köklerden esas olarak daha kalıntır, bu nedenle, geleneksel görüntüleme odasında en üstteki cEller lameste karşı sıkıştı ve deformasyona neden oldu. Bu nedenle merkezlerinde oval bir depresyon içeren boşluklu slaytlar kullanılarak alternatif bir tasarım geliştirildi ( Şekil 4D ). Bu konfigürasyonda, 1 mm kalınlığında bir agar plakası (yukarıdaki 2.2&#39;de olduğu gibi hazırlanmıştır) bir ucu slayt boşluğuna birkaç mm çıkıntı yapacak şekilde konumlandırılmıştır ( Şekil 4D ). Kök, yatay bölümün üstünde konumlandırılırken, hipokotiller slayttaki oyuğun üzerine yerleştirildi. Bu, fidenin uzayda kök tarafından sabitlenmesini sağlamıştır, ancak hipokotil sıkıştırılmamıştır. Odalardaki büyüme oranları plakalara kıyasla sistematik olarak ölçülmemiş iken, görüntüleme odalardaki hipokotiller, hipokotil ( Şekil 4E , 4F ) 16&#39;ya göçen iyi tanımlanmış uzunlamasına büyüme dalgası sergilemiştir. <img alt="Şekil 1"Class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ dosyalar / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1 : Görüntüleme haznesi montajı. Tüm ayrıntılar metinde açıklanmaktadır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig2.jpg" /> Şekil 2 : Yanal kökler görüntüleme odalarında fizyolojik koşullar altında büyür. ( A ) Görüntüleme odasında (solda) ve plakada (sağda) Arabidopsis lateral kök gelişimi (sabit ışık, yatay inkübasyon, eşzamanlı görüntüleme) 25 saat boyunca. Ölçek çubukları = 200 μm. ( B ) ( A ) &#39;da gösterildiği gibi lateral kök uzunluklarını 27 saat boyunca (1 saat aralıklarla ölçülmüştür) gösteren yanal kökler. ! TekErgin kökler gri renkte (plakalar ve görüntüleme odaları için n = 23), ortalama uzunluk kırmızı dairesel olarak çizilmiştir. Hata çubukları = 1 SD. Kırmızı çizgi, ortalama uzunluklar boyunca doğrusal olarak uymaktadır. ( C ) ( B ) &#39;de gösterilen tüm yanal köklerin başlangıç ​​uzunluğuna göre ortalama büyüme oranını gösteren çizim. ( D ) Ardışık zaman noktalarında NPSN12-YFP ve RFP-TUB6&#39;yı ifade eden yanal köklerden elde edilen 3D konfokal yığınların maksimum yoğunluk projeksiyonları. Başlangıç: Kutulu bölgenin büyütülmesi. Yeşil oklar: ön-faz bantları; Beyaz oklar: mitotik iğler; Mavi oklar: phragmoplastlar; Ok uçları: kök tüyleri. ( E ) ( D ) &#39;de gösterilen transjenik çizginin genç bir yanal kökünden, yüksek çözünürlüklü görüntülerin maksimum yoğunluk projeksiyonları, 63X / 1.2 NA hedefi ve 0 saat ve 16&#39;da Nyquist örneklemesi (77 nm x 77 nm piksel boyutu) kullanılarak elde edildi. h; Yıldız işaretleri her zaman noktasında aynı hücreleri bulur; Ok, 0 saat ila 16 saat arasında bölünen bir hücreyi gösterir.Ölçek çubukları = 50 μm (AC); 20 um (E). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig3.jpg" /> Şekil 3 : Görüntüleme odalarında uzunlamasına yanal kök gelişimi. ( A ) Plaklara kıyasla, görüntüleme odalarındaki ardışık 24 saatlik aralıklarla ortalama mutlak kök büyümesini gösteren çizelge. Ns, p&gt; 0.05&#39;i; ***, p &lt;0.001 (öğrenci t testi) olduğunu gösterir. N = 33 (plakalar) ve n = 27 (görüntüleme odaları). ( B ) (A) &#39;da kullanılan tüm köklerde ardışık zaman noktalarında yanal kök uzunluklarını gösteren çizim. Kırmızı: Tabakta yetiştirilen tüm yanal köklerin ortalamasının 1 SD&#39;sinde (927 ve 3163 μm arasında) son uzunluğu olan tüm yanal kökler. ( C ) Maksimum72 saatin üzerindeki ardışık zaman noktalarında elde edilen, yanal köklerde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP&#39;yi temsilen 3D konfokal yığınlarının parlaklık projeksiyonları. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig4.jpg" /> Şekil 4 : Görüntüleme bölmeleri, diğer bitki organları için uyarlanabilir. ( A - C ) Birincil kökler için görüntüleme odacığı uyarlaması. ( A ) Görüntüleme odası tasarımı şeması. Bu, iki değişikliğin yanı sıra standart tasarımla aynıdır ( Şekil 1 ): MS orta tabaka,% 1.5 agar yerine% 0.8 agar ve agar ile bitki arasında bir selüloz film (kırmızı) içerilmesini önlemek için yerleştirirAğ içine. ( B ) 7 günlük fidenin birincil kökünde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP&#39;nin temsili 3D konfokal yığınlarının ( B ) XY (üst) ve XZ (alt) maksimum yoğunluk projeksiyonları, konvansiyonel bir görüntülemede 0 saat ve 48 saatte görüntülendi bölme. Kök, gravitropik tepki nedeniyle agara büyür. 0 saat ve 48 saatte görüntüleme yapılan yedi günlük fidenin birincil kökünde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP&#39;nin temsilci 3D konfokal yığınlarının ( C ) XY (üst) ve XZ (alt) maksimum yoğunluk projeksiyonları Selüloz filmli oda. Uygulamadan önce, selüloz filmi% 80 etanol içinde sterilize edildi ve sıvı ½ MS ortamında ıslatıldı. Kökün ağara gravitropik büyümesinin önlendiğini unutmayın. ( D - F ) Hipokotiller için görüntüleme odası uyarlaması. ( D ) Hipokotil görüntüleme odası tasarımını gösteren şematik. Bir poli (dimetilsiloksan) sakız contası (gri) üreticidirİki cam şerit arasındaki boşluk slaytında kırmızı (sarı). Eşit kalınlığa (bej) sahip% 1.5 agarlık bir kütük, kısmen boşluğa ulaşan slayt üzerine yerleştirilir. Oda PFD (mavi) ile doludur. Fideler ağar kütüğün üzerine yerleştirilir, böylece hipokotil agar kütüğünün ağzın aşağı doğru eğimli bölgesini kaplar ve kök agarın yatay bölümüne yerleştirilir. Oda lamel ile kapatılmıştır. ( E ) İki gün süren bir fidenin bir hipokotilinde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP&#39;yi temsilen 3D konfokal yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyonları, ardışık zaman noktalarında 48 saat boyunca imgelemiştir. ( F ) ( E ) &#39;de gösterilen hipokotilin bazal-apikal ekseni boyunca (E&#39;de gösterilen eksende 0 saatlik göreceli pozisyonlar) bireysel hücrelerin iki ardışık zaman aralığında boyuna büyüme. Daha önce açıklanan hipokotil 16&#39;ya göç eden büyüme dalgasına dikkat edin. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie1.jpg" /> Film 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_1.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen tıklayın.</a> <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie2.jpg" /> Film 2: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_2.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie3.jpg" /> Film 3: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_3.avi" target="_blank">Lütfen c</a>Bu filmi indirmek için yalamak.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development at JoVE.com

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Burada, yüksek numerik diyafram açıklığı hedefleri ve daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılarak 3 güne kadar kök ve hipokotil gelişiminin yüksek çözünürlüklü konfokal zaman atlamalı görüntülemesi için basit bir teknik sunulmuştur.

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Görüntüleme.  University of Oxford.  Burada, yüksek numerik diyafram açıklığı hedefleri ve daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılarak 3 güne kadar kök ve hipokotil gelişiminin yüksek çözünürlüklü konfokal zaman atlamalı görüntülemesi için basit bir teknik sunulmuştur. 

Video: A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Gelişim Biyolojisi

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Biyomühendislik

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Nörobilim

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

İpucu büyüyen bitki hücreleri son derece küçük alanlarda uzama yeteneğini çalışmaya mikrosıvısal cihazların geliştirme

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Biyoloji

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca<sup&gt; 2+</supArabidopsis Bitkilerde&gt; Sinyalleri

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Bir Gel Yüzeyinde Büyüyen Bitki kökleri Işık Sac Flüoresan Mikroskopi

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Analiz