Ringraziamo il Prof. Geoffrey Wasteneys, Università della Columbia Britannica, per il RFP-TUB6 che esprime il seme e un revisore anonimo per utili correzioni. Siamo grati al professor Hugh Dickinson per avvisarci dell&#39;uso della pellicola di cellulosa come supporto meccanico e a John Baker per la fotografia. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio BBSRC BB / G013993 / 1 e BB / D004055 / 1 a IM, e un premio BBSRC Doctoral Training e Clarendon Scholarship a CK

1. Creazione della Camera <ol><li> Utilizzando una taglierina di vetro tagliare strisce di larghezza da 3 mm dalla fine di uno scivolo a microscopio spessore di 1 mm. Utilizzando una super-colla cianoacrilata o un nastro a doppio lato, incollare queste strisce di vetro circa 45 mm di larghezza per tutta la larghezza di una seconda scivolo a microscopio ( figura 1A ). È necessaria una diapositiva per camera, più slitte aggiuntive per versare lastre agar (una diapositiva produrrà 2-3 lastre agar). Le diapositive possono essere riutilizzate. </li><li> Tra le strisce di vetro, modella una guarnizione di altezza identica a quella di poli (dimetilsilossano) gas permeante. Posizionare una sfera di gomma di poli (dimetilsilossano) sullo scivolo ( figura 1B ), bagnare una seconda slitta con una piccola quantità di etanolo assoluto al 100% e appiattire la palla di gomma poli (dimetilsilossano) con la seconda slitta fino a raggiungere l&#39;altezza Delle strisce di vetro ( figura 1C ). <ol><li> Se necessario, tagliare l&#39;eccesso di poli (dimeThylsiloxane) con una lama di rasoio e ripetere appiattimento. </li></ol></li><li> Utilizzando una lama adatta o una lama di rasoio bagnata in etanolo assoluto, rimuovere la parte interna della gomma di poli (dimetilsilossano) per creare la cavità che più tardi avrà la piastra e la lastra di agar ( figura 1D ). </li><li> Tagliare con cura il gel con una lama di rasoio per creare una guarnizione con uno spessore finale di parete di circa 2 mm ( figura 1E ). La permeabilità dei gas attraverso una barriera di poli (dimetilsilassano) è indipendente da spessori superiori a 50 μm 11 . </li></ol> 2. Creazione della lastra agar-solidificata del medium di crescita <ol><li> Su uno scivolo a microscopia con due strisce di vetro, posizionare una copertura (22 mm x 50 mm) in modo che poggi su entrambe le strisce di vetro. </li><li> Pipettare mezzo mezzo di resistenza Murashige e Skoog contenente 1% w / v saccarosio e 1,5% w / v agar (½ MS) nello spazio risultanteSotto il coperchio fino a quando quest&#39;ultimo è completamente riempito (circa 1 mL di volume totale) e lasciare fino a quando l&#39;agar è impostato (circa 5 minuti). Nota: i composti farmacologici possono essere somministrati attraverso la lastra di agar aggiungendo opportune concentrazioni al mezzo liquido prima che venga versata la lastra. Questo è stato testato con successo per il dexametasone 12 , isoxaben, 2,6-diclorobenzonitrile (DCB), orisalin e latrunculin B. </li></ol> 3 . Terminare l&#39;impostazione della camera <ol><li> L&#39;aria equilibrata PFD agitando un piccolo volume di PFD in un tubo 7 . Aggiungere una piccola quantità (circa 200 μL) di PFD equilibrata in aria al pozzo della guarnizione del gel, ma non riempire completamente la camera. Questo PFD contribuirà ad evitare la cattura di bolle d&#39;aria sotto la lastra di agar quando viene inserita nella camera. </li><li> Rimuovere la copertura dalla lastra di agar (al punto 2.2 sopra) e utilizzare una lama di rasoio per tagliare una parte delLa dimensione e la forma del sired. Quindi posizionarlo nel pozzetto della guarnizione gel ( Figura 1F ). Dovrebbe esserci una distanza di 2-4 mm dalla guarnizione. </li><li> Riempire completamente la camera con il PFD equilibrato in aria. </li><li> Posizionare uno o più piantine di A. thaliana (fino a 3 piantine per immagini in 2-3 giorni) sulla lastra di agar con i cotiledoni e l&#39;ipocotile appesa al bordo, galleggiante in PFD ( Figura 1G ). </li><li> Per ottenere piantine, sterilizzare i semi con etanolo al 70%, impianto in mezzo ½ MS aggiunto con 1% di saccarosio e 0,8% di agar, stratificare per 2-4 giorni a 4 ° C e crescere su piastre orientate verticalmente a 22 ° C in 16 H luce / 8 h regime scuro. Per l&#39;imaging delle radici laterali, coltivare le piante per 7-10 giorni prima di trasferire alle camere di imaging. </li><li> Per chiudere la camera, applicare una copertura coprente all&#39;ottica dell&#39;obiettivo, premendola delicatamente con il bordo di una scivolata di microscopio di vetro fino a quando la coperturaPoggia su entrambe le strisce di vetro ( figura 1H ). </li><li> Se necessario, fissare la copertura con strisce di nastro chirurgico micropore largo 1,25 cm, a metà lunghezza ( Figura 1I ). Lasciare che il campione si stabilizzi per circa 30 minuti prima dell&#39;immagine. Ciò minimizza il movimento dei campioni durante l&#39;imaging. </li><li> Eseguire l&#39;imaging con un microscopio verticale per mantenere un substrato controllato per la crescita. Utilizza obiettivi 20X / 0.7NA o 63X / 1.2NA CS2. </li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Il metodo qui presentato è una semplice strategia per l&#39;imaging confocale ad alta risoluzione di sviluppo delle radici laterali per due e tre giorni. Per periodi fino a 48 h, non sono stati osservati effetti negativi del sistema di imaging sullo sviluppo della radice laterale. Dopo 48 ore la crescita media radicale laterale ha cominciato a rallentare, anche se un substrato sostanziale delle radici (37%) ha continuato a crescere a tassi paragonabili alla crescita media delle radici sulle piastre. Pertanto, attraverso la rappresentazione di un numero sufficiente di radici, le radici la cui crescita rallenta dopo 48 h può essere esclusa. Le prove sistematiche delle camere di imaging non sono state eseguite per periodi superiori a 72 h, ma si suggeriscono strategie alternative se si desidera un periodo di imaging esteso. Le camere di imaging possono essere lasciate continuamente sullo stadio del microscopio, se vengono fornite condizioni ambientali adatte o rimosse in un impianto di crescita e restituite periodicamente al microscopio. Ciò consente di immaginare in parallelo numerose camere. &lt;/ P&gt; Un vantaggio delle camere qui descritte è che le radici laterali sono fisse nella loro posizione e possono essere riprese utilizzando lenti ad alta risoluzione di immersione ad acqua. La stabilità spaziale dipende in modo critico dalla concentrazione di agar utilizzata nella lastra di supporto agar. Inizialmente sono state testate una gamma di concentrazioni diverse da 0,8% agar al 2% agar, rivelando che elevate concentrazioni in questo intervallo hanno radici stabilmente stabilite nello spazio, ma la crescita delle radici ha rallentato più velocemente e alcune radici hanno mostrato segni di stress meccanico, incluso l&#39;allungamento cellulare ridotto. Al contrario, le basse concentrazioni di agar non hanno fornito il supporto richiesto e le radici sono scivolate in x, y e z durante l&#39;imaging. La lastra ottimale dell&#39;agar 1,5% consente di fissare la posizione del campione senza effetti meccanici negativi. In queste condizioni, dopo che si stabiliscono nei primi 30 minuti circa, le radici sono stabili per molte ore, consentendo l&#39;acquisizione di dati durante la notte. Durante l&#39;acquisizione di dati 4D, le serie di z-stack erano tipicamente bRaccolti da un ulteriore 5-10 μm ma questo era principalmente per ospitare la crescita fuori-piano di radici laterali piuttosto che z-drift o wobble. Anche se la concentrazione standard di agar fornisce una certa resistenza alla penetrazione, le radici gravitograficamente in crescita infine penetreranno nell&#39;agar. Tuttavia, con una modifica minore della camera di imaging, la crescita delle radici potrebbe essere mantenuta parallela alla copertura, permettendo di immaginare le più vecchie radici laterali e le radici primarie. Inoltre, la camera di base di imaging potrebbe essere facilmente personalizzata per ipocotili. I hypocotyls sono più liberamente galleggianti in questo sistema quindi la staffa di asse z per l&#39;acquisizione di immagini è stata aumentata di solito a circa 20 μm. In questo studio è stato utilizzato un microscopio verticale, che ha permesso di controllare le proprietà del substrato. La camera di imaging può essere adattabile a configurazioni di microscopio invertito, ma deve essere valutata l&#39;influenza dipendente dal tempo della copertura di copertura rigida sugli organi intercettatori. </p&gt; Littlejohn e colleghi hanno fatto notare che la PFD stessa non scioglie facilmente le molecole biologiche, il che significa che non può essere usato direttamente per la consegna di composti farmacologici 7 . Questo problema è stato superato fornendo tali composti attraverso la lastra di mezzo di crescita solidificato su cui poggia la lastra di agar. Mentre i sistemi di perfusione rimarranno il metodo di scelta per gli esperimenti di lavaggio, la camera di imaging è stata usata con successo per la somministrazione di dexametasone 12 e di altri composti. Una nota, mentre questo articolo era in preparazione von Wagenheim e colleghi 18 hanno descritto una camera per l&#39;imaging dello sviluppo laterale della radice utilizzando la microscopia a foglio leggero.

Per studiare processi cellulari e subcellulari che sono alla base dello sviluppo delle piante, esiste una crescente domanda di strategie a lungo termine ad alta risoluzione a lungo termine. Una sfida fondamentale in questi esperimenti di imaging è il mantenimento delle condizioni fisiologiche, incluso lo scambio di gas sufficiente, più una fornitura di acqua e sostanze nutritive 1 , 2 , 3 . Per utilizzare obiettivi con alte aperture numeriche per una risoluzione ottica ottimale, i campioni devono essere posizionati in prossimità e orientati in parallelo alla copertina. Il movimento in x, y e z dovrebbe essere idealmente minimo durante l&#39;imaging. Mentre le piantine sono spesso montate in acqua o soluzione acquosa per imaging a breve termine, l&#39;acqua ha una bassa capacità di dissoluzione di CO 2 e O 2 (1,54 mg / ml e 0,04 mg / ml rispettivamente a 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , che rendeÈ inadatto per esperimenti di time-lapse prolungati. I sistemi di perfusione che mantengono livelli costanti di ossigeno e sostanze nutrienti sono una soluzione a questo problema e sono state sviluppate per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM) 1 , 2 , 3 e la microscopia a foglio leggero (LSM) 5 . Sistemi come il RootChip 2 e il RootArray 3 sono stati progettati appositamente per l&#39;imaging di tempi di sviluppo delle radici e coinvolgono germinazione dei semi in un dispositivo multi-specimen su misura. Questi accordi assicurano una minima perturbazione meccanica e sono progettati per l&#39;analisi parallela di piantine multiple, ma non ottimizzate per l&#39;imaging di strutture subcellulari. Calder e colleghi hanno progettato una camera di imaging più complessa a base di perfusione ottimizzata per l&#39;imaging di strutture subcellulari in cui il campione è tenuto in posizione da una magliaPer consentire l&#39;utilizzo di lenti ad alta immersione di ingrandimento 1 . Presentata qui è una soluzione alternativa e semplice a questo problema che non si basa sui sistemi di perfusione, ma utilizza perfluorodecalina (PFD), un perfluorocarbon che ha recentemente guadagnato la popolarità come mezzo di montaggio per l&#39; imaging Arabidopsis 6 , 7 , 8 . In tali applicazioni, l&#39;elevata capacità di PFD per la dissoluzione di CO 2 e O 2 (1,9 g / mL per O 2 in PFD rispetto a 0,04 mg / ml in acqua) 9 , consente lo scambio gassoso dal tessuto immerso. Inoltre, il PFD non è fluorescente e il suo indice di rifrazione (1.313) è paragonabile a quello dell&#39;acqua (1.333) ed è più vicino a quello del citosolo (~ 1.4) rispetto all&#39;aria (1.000) 6 . Perfluorocarburi sono stati riportati di avere un effetto fisiologico minimo su una varietà di piante e piante tI numeri 6 , con i semi di ravanello che germogliano prontamente quando immersi in PFD e che presentano una normale crescita e sviluppo per almeno due giorni interi quando sono forniti con acqua 10 . Sono state fatte osservazioni analoghe per germinare i semi di Arabidopsis 6 . Sulla base dello spargimento Raman stimolato per rappresentare direttamente la distribuzione di PFD nei tessuti delle foglie di Arabidopsis dopo l&#39;infiltrazione, Littlejohn e colleghi concludono che la PFD non è probabilmente occupata dalle cellule vive 8 . PFD è stato precedentemente utilizzato principalmente per i tessuti aerei di immagine, dove aumenta notevolmente la profondità dell&#39;immagine poiché infiltra facilmente gli spazi aerei a causa della bassa tensione superficiale 6 . Qui, PFD è adottato per l&#39;imaging confocale a lungo termine di sviluppare radici laterali. In questa configurazione, una o più piantine sono disposte su una lastra di terreno di crescita solidificata con agar e immersa in PFD. Il PFD consente gScambio armonioso nella camera di imaging, impedendo l&#39;anossia. PFD è altamente volatile e viene mantenuto da una guarnizione di gomma poli (dimetilsilossano) che ha anche un&#39;elevata permeabilità del gas (1,5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 per CO 2 ) 11 . I nutrienti e l&#39;acqua vengono forniti dalla lastra di media solidificata con agar. Allo stesso tempo, questa lastra di agar preme dolcemente la radice contro la copertura, fissando così la relativa posizione nella camera di imaging e consentendo l&#39;utilizzo di lenti ad immersione ad alta risoluzione ad acqua. Inoltre, la lastra di agar può essere usata per somministrare una gamma di trattamenti farmacologici, compresi deksametasone, orizalin e isoxabene. Le camere di imaging possono essere assemblate in grandi numeri da diapositive standard di microscopia utilizzando attrezzature minime. Le camere di imaging sono state sviluppate e caratterizzate per studiare lo sviluppo laterale della radice, ma sono adattabili all&#39;imaging di altri organi di piantina come i suggerimenti primari della radice eipocotili.

<table><tbody><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) gum&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td><td>Item # 132700</td><td>Carolina Observation Gel</td></tr><tr><td>Cavity Microscope Slides</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth,&amp;nbsp;UK</td><td>10118-600</td><td>Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>Any &#039;super-glue&#039; suitable for glass will probably suffice</td></tr><tr><td>Cellulosic cellophane membrane</td><td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td><td></td><td>325P cellulose film; 80 mm disc</td></tr></tbody></table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

Diversi aspetti dello sviluppo delle piante, come la morfogenesi laterale della radice, si verificano in termini di tempo di diversi giorni. Per studiare i sottostanti processi cellulari e subcellulari, sono necessarie strategie di microscopia ad alta risoluzione che conservano condizioni fisiologiche. I tessuti vegetali devono avere adeguata nutrizione e approvvigionamento idrico con uno scambio gassoso sostenuto, ma, sommersi e immobilizzati sotto una copertura, sono particolarmente suscettibili all&#39;anossia. Una strategia che è stata impiegata con successo è l&#39;utilizzo di un sistema di perfusione per mantenere un&#39;offerta costante di ossigeno e sostanze nutritive. Tuttavia, tali disposizioni possono essere complicate, ingombranti e richiedono attrezzature specializzate. Presentata qui è una strategia alternativa per un semplice sistema di imaging utilizzando perfluorodecalin come mezzo di immersione. Questo sistema è facile da installare, richiede un&#39;attrezzatura minima ed è facilmente montato su uno stadio microscopico, permettendo di impostare e produrre diverse telecamere in parAllel. In questo sistema, i tassi di crescita della radice laterale sono indistinguibili dai tassi di crescita in condizioni standard sulle piastre agariche per i primi due giorni e la crescita laterale della radice continua a tassi ridotti per almeno un altro giorno. I tessuti vegetali vengono forniti con sostanze nutritive attraverso una lastra di agar che può essere utilizzata anche per somministrare una gamma di composti farmacologici. Il sistema è stato stabilito per monitorare lo sviluppo laterale della radice, ma è facilmente adattabile all&#39;immagine di altri organi vegetali come ipocotili e radici primarie.

Le radici laterali crescono a tassi fisiologici nelle camere di imaging. Le lunghezze di radice laterale delle piante nelle camere di imaging sono state misurate ad intervalli orari ( figura 2A , sinistra, film 1, n = 23) e le percentuali di crescita sono state confrontate con quelle delle radici laterali coltivate su piastre standard Petri contenenti lo stesso agar-solidified medium 2A , a destra, Movie 2, n = 23). I tassi di crescita possono variare notevolmente tra le radici laterali, con la lunghezza della radice essere un fattore determinante per le zone sempre più lunghe di crescita e di proliferazione 13 . Pertanto, sono state selezionate serie di radici laterali per rappresentare radici di diverse lunghezze iniziali (da 50 μm a 1150 μm) sia nella camera di imaging che nella piastra agar. Media lunghezza laterale media all&#39;inizio dell&#39;esperimentoEra simile in ciascun set (439 e 442 μm rispettivamente per camere e lastre di imaging). Nell&#39;intervallo temporale analizzato di 27 h, la crescita laterale della radice era circa lineare sia nelle camere di imaging che nelle piastre, con un tasso medio di crescita di 52 μm / h (R2 = 0.997) sulle piastre e 51 μm / h nelle camere di imaging R 2 = 0,993) ( Figura 2B ). Le percentuali di crescita delle singole radici laterali dove sono molto variabili sia sulle piastre che nelle camere di imaging ( Figura 2C ), che vanno da 17 μm / h a 82 μm / h nelle camere di imaging e da 13 μm / h a 87 μm / h sulle piastre. Mentre i tassi di crescita generalmente aumentavano con la lunghezza della radice, i tassi di crescita continuavano tuttavia a variare sostanzialmente tra radici di lunghezza simile, ma la varianza era simile nelle camere di imaging e sulle lastre. Le radici laterali si proliferano nelle camere di imaging e possono essere riprese utilizzando hiGh obiettivi numerici. Le radici laterali che coesprendono il marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP 14 e il microtubulo marcatore UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 sono stati immagazzinati da CLSM 10 ad intervalli di 1h per documentare il comportamento del microtubulo durante la proliferazione cellulare nelle camere di imaging ( Figura 2D , film 3). In queste camere, le radici laterali erano altamente stabili nella loro posizione sugli assi x, y e z, consentendo l&#39;acquisizione di stack confocali continui di tempo per parecchie ore. Le cellule meristemiche continuano a proliferare, come risulta dalla formazione di bande preprofase ( figura 2D , frecce verdi), mandrini mitotici ( figura 2D , frecce bianche) e phragmoplasti ( figura 2D , frecce blu). Come per le piantine sui piatti di Petri,Le cellule di radice completamente allungate nelle camere di imaging hanno avviato i peli di radice ( figura 2A , figura 2D , teste di freccia), indicando inoltre che lo sviluppo ha proceduto come previsto nelle camere di imaging. Per fornire un ampio campo di vista, le immagini in Figura 2D sono state ottenute con un obiettivo 20x / 0.7 NA. E &#39;stato inoltre possibile ottenere immagini ad alta risoluzione delle radici laterali utilizzando un obiettivo di immersione ad acqua di 63x / 1,2 NA con elevata apertura numerica ( Figura 2E ). La crescita laterale laterale è sostenuta nelle camere di imaging fino a tre giorni. Per esaminare quanto tempo le camere di imaging avrebbero potuto sostenere la crescita laterale della radice a velocità fisiologiche, la lunghezza della radice laterale nelle camere di imaging (n = 27) e sulle piastre (n = 33) è stata quantificata a 0 h, 24 h, 48 h e 72 h. Le radici choSen erano inferiori a 200 μm a 0 h, con una lunghezza di radice laterale media di 117 μm nelle camere di imaging e 121 μm sulle piastre. Dal momento che le radici più corte crescono più lentamente in media ( Figura 2C ), sono cresciute più volte sul bordo della lastra di agar e sono state più facili da produrre. La crescita media di tutte le radici laterali non era significativamente diversa nelle camere di imaging rispetto alle piastre Petri nelle prime 48 ore ( Figura 3A ). Tuttavia, la crescita media è stata significativamente ridotta tra 48 h e 72 h ( figura 3A ). Mentre i tassi di crescita sembrano generalmente rallentare nelle camere di imaging dopo 48 h, i tassi di crescita tra gli individui restano molto variabili ( Figura 3B , 3C ), il che significa che esiste un consistente sottoinsieme di radici laterali che crescono a tassi paragonabili su lastre e camere Durante il completo periodo di crescita di 72 ore. 23 delle 33 radici laterali cresciuteSulle piastre (69,7%) raggiungono una lunghezza entro una deviazione standard della lunghezza media a 72 h (tra 927 e 3.163 μm, figura 3B , rosso). 10 di 27 (37,0%) le radici laterali nelle camere di imaging raggiungono una lunghezza entro questo intervallo ( figura 3B , rosso). Le camere di imaging possono essere facilmente adattate per le radici laterali più anziane, le radici primarie e le ipocotili . Una delle limitazioni del disegno originale della camera di imaging era che mentre la lastra di agar rigida forniva una certa resistenza meccanica, le radici gravitropicamente crescenti infine penetrarono nella lastra di agar, con conseguente perdita di qualità dell&#39;immagine ( Figura 4B ) e crescita oltre la distanza di lavoro di alto NA Lenti, anche l&#39;obiettivo di lunga distanza di lavoro (0,3 mm) 63X / 1,3 NA CS2. Le giovani radici laterali mancano del contenente statoliteCellule columella necessarie per gravitropismo 17 in modo da inizialmente crescere parallelo alla copertura in camera di imaging ( Figura 2E ). Mentre crescono più a lungo e columella e statoliti, le radici laterali mostrano un gravitropismo crescente positivo, mentre le radici primarie presentano una forte risposta gravitropica dalla germinazione in avanti. Ciò limita a poche ore il periodo in cui le radici primarie possono essere riprese e limita gravemente la lunghezza iniziale delle radici laterali che possono essere riprese in continuo per 48 ore o più. Per ovviare a questa limitazione, la camera è stata modificata in modo tale che la crescita sia mantenuta parallela alla copertura da una membrana di cellophane cellulosica che funge da barriera di penetrazione sulla superficie della lastra di agar ( figura 4A ). I tentativi iniziali usando una lastra di agar 1,5% hanno causato una crescita radicale ridotta entro i primi 24 h, dovuta forse allo stress meccanico. Le concentrazioni inferiori dell&#39;agar nella lastra sono state testateSi è trovato che nelle camere con una lastra contenente 0,8% agar e pellicola di cellulosa, i giovani tassi di crescita della radice laterale non differivano significativamente dai tassi di crescita nelle camere convenzionali per le prime 48 ore. Per 0-24 h la crescita media delle radici nelle camere di cellulosa e nelle camere convenzionali era rispettivamente di 242 μm e 262 μm (p = 0.78 Student&#39;s t-Test) e di 24-48 h rispettivamente pari a 330 μm e 355 μm (p = 0.67 Student&#39;s t-test); N = 12 e n = 11, rispettivamente. Questa disposizione impediva efficacemente le radici laterali a muoversi lontano dalla copertina, nell&#39;agar, e consentiva anche l&#39;imaging delle radici primarie fino a 48 ore ( figura 4C ). Per verificare se le camere di imaging potrebbero essere adattate per organi diversi dalle radici, sono stati scelti gli ipocotili Arabidopsis. Gli ipocotili sono sostanzialmente più spessi delle radici così nella camera convenzionale di imaging, la più alta cGli ells erano schiacciati contro la copertura, portando alla deformazione. Si è quindi sviluppato un disegno alternativo usando diapositive a cavità che contengono una depressione ovale nel loro centro ( figura 4D ). In questa configurazione è stata posizionata una lastra di spessore di 1 mm di agar (preparata come al precedente punto 2.2) con un&#39;estremità sporgente di pochi millimetri nella cavità di scorrimento ( figura 4D ). Gli ipocotili sono stati posizionati sopra la cavità nella diapositiva mentre la radice era posizionata sopra la parte orizzontale. Ciò ha assicurato che la piantina fosse fissata nello spazio dalla radice, ma l&#39;ipocotile non è stato schiacciato. Mentre i tassi di crescita nelle camere rispetto alle piastre non sono stati sistematicamente quantificati, ipocotili nelle camere di imaging hanno mostrato l&#39;onda ben descritta di crescita longitudinale che migra l&#39;ipocotile ( Figura 4E , 4F ) 16 . <img alt="Figura 1"Class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 : Assemblaggio di una camera di imaging. Tutti i dettagli sono descritti nel testo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig2.jpg" /> Figura 2 : Le radici laterali crescono in condizioni fisiologiche nelle camere di imaging. ( A ) sviluppo della radice laterale di Arabidopsis in una camera di imaging (sinistra) e su una piastra (destra) per 25 ore (luce costante, incubazione orizzontale, imaging simultaneo). Barre di scala = 200 μm. ( B ) Parete che presenta lunghezze di radice laterale superiore a 27 h (misurate in intervalli di 1 h), delle radici laterali come mostrato in ( A ). individLe radici ual grigie (n = 23 per le piastre e le camere di imaging), lunghezza media come cerchi rossi. Barre di errore = 1 SD. La linea rossa è misura lineare attraverso lunghezze medie. ( C ) Trama che mostra il tasso di crescita medio per tutte le radici laterali di cui alla ( B ) relative alla loro lunghezza iniziale. ( D ) Proiezioni di intensità massima di stack confocali 3D acquisite da radici laterali che esprimono NPSN12-YFP e RFP-TUB6 in punti di tempo consecutivi. Inset: Ingrandimento della regione boxed. Frecce verdi: bande preprofase; Frecce bianche: mandrini mitotici; Frecce blu: phragmoplasts; Punte di freccia: peli di radice. ( E ) Proiezioni di intensità massima di immagini ad alta risoluzione acquisite da una giovane radice laterale della linea transgenica mostrata in ( D ) utilizzando un obiettivo 63X / 1.2 NA e un campionamento di Nyquist (dimensioni di pixel 77 nm x 77 nm) a 0 h e 16 h; Gli asterischi individuano le cellule identiche ad ogni punto temporale; La freccia indica una cella che si divide tra 0h e 16h.Barre di scala = 50 μm (AC); 20 μm (E). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig3.jpg" /> Figura 3 : Lo sviluppo laterale a lungo termine delle camere di imaging. ( A ) Un diagramma che mostra la crescita media della radice assoluta in tre intervalli di 24 ore consecutive in camera di imaging rispetto alle piastre. Ns indica p&gt; 0,05; *** indica p &lt;0,001 (t-test dello studente). N = 33 (piastre) e n = 27 (camere di imaging). ( B ) Trama che mostra lunghezze di radice laterale a punti consecutivi su tutte le radici utilizzate in (A). Rosso: tutte le radici laterali con una lunghezza finale entro 1 SD della media di tutte le radici laterali coltivate su piastre (tra 927 e 3163 μm). ( C ) Massimo inProiezioni di densità di pile confocali rappresentative 3D del marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP in radici laterali, acquisite a punti consecutivi in ​​72 ore. Barre scala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig4.jpg" /> Figura 4 : Le camere di imaging possono essere adattate per altri organi vegetali. ( A - C ) Adattamento della camera di imaging per le radici primarie. ( A ) Schema della progettazione della camera di imaging. Questo è identico al disegno standard ( figura 1 ) a parte due modifiche: la lastra media di MS contiene 0,8% agar invece di 1,5% agar e un film di cellulosa (rosso) è posto tra agar e pianta per prevenire la crescitaNell&#39;agar. ( B ) XY (top) e XZ (in basso) proiezioni di intensità massima di stack confocali rappresentativi 3D del marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP nella radice primaria di un piantone di 7 giorni, imaged a 0 h e 48 h in un normale imaging Camera. Si noti che la radice cresce nell&#39;agar a causa della sua risposta gravitropica. ( C ) XY (top) e XZ (in basso) delle proiezioni di intensità massima di pili confocali rappresentativi 3D del marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP nella radice primaria di un piantone di sette giorni imaged a 0 h e 48 h nell&#39;immagine Camera con pellicola di cellulosa. Prima dell&#39;applicazione, la pellicola di cellulosa è stata sterilizzata in etanolo al 80% e imbevuta di liquido ½ mezzo MS. Si noti che la crescita gravitropica della radice nell&#39;agar è impedita. ( D - F ) Adattamento della camera di imaging per ipocotili. ( D ) Schema che mostra la progettazione della camera di imaging ipocotile. Una guarnizione di gomma (grigio) di poli (dimetilsilossano) è manufactuRosso su uno scivolo della cavità tra due strisce di vetro (giallo). Una lastra di 1,5% agar di spessore uniforme (beige) è posta sullo scivolo, parzialmente raggiunta nella cavità. La camera è riempita con PFD (blu). Le piante vengono poste sulla lastra di agar, in modo che l&#39;ipocotile occupa la regione inclinata verso il basso della lastra di agar nella cavità mentre la radice è posizionata la parte orizzontale dell&#39;agar. La camera è chiusa con una copertura. ( E ) Proiezioni di intensità massima di pile confocali rappresentative del marker NPSN12-YFP della membrana plasmatica in un ipocotile di un piantina di due giorni, immaginato per 48 ore in punti consecutivi. ( F ) Crescita longitudinale in due intervalli di tempo consecutivi di singole cellule lungo l&#39;asse da basale a quello apicale (posizioni relative a 0 h lungo l&#39;asse indicato in E) dell&#39;ipocotile mostrato in ( E ). Si noti l&#39;ondata di crescita descritta in precedenza che migra nell&#39;ipocotile 16 . Barre scala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie1.jpg" /> Movie 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_1.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo film.</a> <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie2.jpg" /> Movie 2: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_2.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo film.</a> <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie3.jpg" /> Movie 3: per <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_3.avi" target="_blank">favore c</a>Lick qui per scaricare questo film.

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A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Presentata qui è una tecnica semplice per l&#39;imaging rapido a tempo determinato di elevata risoluzione di sviluppo radicale e ipocotile per un massimo di 3 giorni utilizzando elevati obiettivi di apertura numerica e perfluorodecalin come mezzo di immersione.

Una Camera Semplice per l&#39;Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Views.  University of Oxford.  Presentata qui è una tecnica semplice per l'imaging rapido a tempo determinato di elevata risoluzione di sviluppo radicale e ipocotile per un massimo di 3 giorni utilizzando elevati obiettivi di apertura numerica e perfluorodecalin come mezzo di immersione. 

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Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

Time-lapse imaging di fluorescenza della crescita Root Arabidopsis con manipolazione accelerato dell&#39;ambiente root usando il RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Ricerca

Bioingegneria

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB e Imaging spettrale radice per pianta Phenotyping e ricerca fisiologica: messa a punto sperimentale e protocolli di Imaging

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Ambiente

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Biologia dello sviluppo

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Formazione immagine confocal Live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Neuroscienze

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

La morfologia dei capelli di radice di semenzali di Arabidopsis in una piattaforma di Microfluidic di due-strato di imaging

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Sviluppo di dispositivi microfluidici per studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in spazi estremamente ridotti

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Biologia

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Misurazione spaziale e temporale Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in Arabidopsis Piante

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Una Camera Semplice per l'Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

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Time-lapse imaging di fluorescenza della crescita Root Arabidopsis con manipolazione accelerato dell'ambiente root usando il RootChip