עבודה זו נתמכה על ידי AHA פרס מס &#39;15BGIA23250030, המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של NIH תחת מספר הפרס 8P20 GM103432-12 ואת האוניברסיטה של ​​ויומינג סגל גרנט בסיוע BT.

כל הפרוטוקולים עוקבים אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ויומינג. 1. בעלי חיים דיור האכלה הערה: עכברים סוג בר המין הזכר (C57BL / 6) (בגיל 12 עד 24 שבועות) היו bred במתקן החיות מחקר לפי הפרוטוקול מאושרים טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משבוע 6 של גיל, עכברי הבית בקבוצות של ארבעה בכלובים נפרדים באופן אקראי להקצות אותם לקבוצות האכלה של NCD או HFD (± 0.01% CAP) עד שבוע 38 של גיל. הערה: CAP הוא אגוניסט של חלבון ערוץ TRPV1 לידי ביטוי ברקמות השומן 11 , 17 . מערבבים CAP עם HFD בבלנדר בתוך מכסה המנוע ומעבירים את התערובת המעורבת למגש המכיל 1 מתוך 2 מחיצות. שמור את המגש בתוך מקפיא -20 ° C. הסר את המגש המכיל את הדיאטה HFD + CAP מן המקפיא לאחר 24 שעות ו לאחסן במיכל ב -20 &amp;# 176; מקפיא C עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי הבית בסביבה מבוקרת אקלים (22.8 ± 2.0 ° C, לחות של 45% -50%) עם מחזור של 12/12-Light / Dark עם גישה לתזונה ייעודית וליביטום למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף 38 שבועות, לנתח רקמות השומן המפשעה ולהשתמש עבור ניסויים lipolysis (סעיפים 2-7). </li></ol> 2. הכנת עכברים עבור הניסויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי הזרקת תערובת קטמין ו xylazine (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג ו 80 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל גוף, בהתאמה). להזריק 0.01 מ&quot;ל של תערובת / 10 גרם משקל הגוף של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור הרדמה עמוקה על ידי קמצוץ הבוהן המשרד. אם יש רפלקס פדלים, לבדוק את העכבר שוב לאחר לפחות 30 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משחה עין וטרינר כדי למנוע יובש בעיניים במהלך הרדמה. אין להשאיר עכברים ללא השגחה במהלך כל ההליכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי הזרקת מנה גבוהה של קטמין ו xylazine הזרקה תערובת (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג ו 80 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל הגוף, בהתאמה) mixturE (0.01 מ&quot;ל / 10 גרם משקל גוף) ואחריו נקע צוואר הרחם. הערה: שיטה זו של המתת חסד מאושרת על ידי IACUC של אוניברסיטת ויומינג. </li></ol> 3. בידוד של שומן שומנים שומן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר (fed עם NCD או HFD (± CAP) במשך 32 שבועות) שוכב על שמאל עבור ההליך. הערה: על ידי הנחת העכבר בצד שמאל, שמאל forelimb ו hindlimb שמאל יהיה על פלטפורמת לנתיחה, בעוד forelimb הנכון hindlimb הנכון יהיה פונה מן הפלטפורמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את פני העור עם 2 אינץ &#39; 2 כרית גזה ספוגה ב 2.5 מ&quot;ל של 70% אתנול. לעשות חתך לרוחב 2 - 3 מ&quot;מ דרך העור באמצעות איזמל לחשוף את שכבת השומן הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך 1 ס&quot;מ (בהתאם לגודל של העכבר) דרך העור באמצעות אזמל ממש מתחת לכלוב הצלעות על פני השטח הגבי שהצטרף שתי חתכים לרוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף את דש העור על ידי גרירתו בזהירותבאמצעות מלקחיים סטרילית ולהשאיר את כרית תת עורית שלם על ידי לא לחתוך את רפידות שומן. זהו משטח השומן המוטל מתחת לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את פנקס השומן בזהירות מן השריר הבסיסי ו fascia באמצעות זוג מספריים. משוך את משטח השומן כפי שהוא חתך מן השריר הבסיסית. הערה: המשקל והגודל של רפידות השומן תלוי בסוג העכברים (NCD או HFD (± CAP) - fed). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פינצטה להעביר אותו צלחת פטרי המכיל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עד הניסויים lipolysis, בטמפרטורת החדר (~ 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את רפידות שומן מהצד הימני של העכבר כמתואר בשלבים 3.2-3.6. </li></ol> 4. בסל גליצרול שחרור מן השומן pads <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים חדים לחתוך על 20 מ&quot;ג של רקמת שומן ל 5 עד 8 חתיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חתיכות לחתוך של כריות שומן במפשעה μL 200 של המדיום דגירה (Dulbecco השתנה Eagel של בינונית (DMEM) המכיל 2% חומצת שומןללא תשלום אלבומין בסרום (BSA)) ב 37 ° C, 5% CO 2 ו לחות 95% עבור 60 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את המדיום דגירה להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס עבור assay lipolysis. הערה: חתיכות לחתוך משמשים לקביעת ריכוז חלבון לאחר מיצוי השומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חתיכות שומן לחתוך בעזרת מלקחיים לתוך 1 מ&quot;ל של תמיסת מיצוי (כלורופורם: מתנול (2: 1, V / V) ו 1% חומצה אצטית קרחוני) ו דגירה של 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס תחת רועד נמרץ ב 100 סל&quot;ד. מחק את פתרון מיצוי השומן. הערה: שלב זה יהיה לחלץ שומן מן חתיכות לחתוך. מחק את פתרון מיצוי השומן כפי שהוא יפריע לקביעת חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמה (משלב 4.2.2) באמצעות פינצטה לתוך צינור microfuge סטרילי המכיל 500 μL של פתרון תמוגה (0.3 N NaOH המכיל 0.1% נתרן dodecyl סולפט, SDS) ו דגירה לילה (12 שעות) ב 55 מעלות צלזיוס תחת רעידה נמרצת ב 100 סל&quot;ד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון של הרקמה (שלב 4.2.3) באמצעות bicinchoninic חומצה (BCA) מגיב BSA כסטנדרט 18 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את המדיום קפוא (שלב 4.2.1) על הקרח ולקבוע את התוכן גליצרול של המדיום באמצעות מגיב גליצרול חינם כמתואר בסעיפים פרוטוקול 6 ו 7 6 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקסטרפולציה של ריכוז גליצרול בדגימות מן עקומת תקן זממו באמצעות תקנים גליצרול 19 וליפוליזה מפורשת כמו nlyomoles גליצרול לכל חלבון מ&quot;ג לכל ח 20 . </li></ol></li></ol> 5. FSK מגורה lipolysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Preincubate על 20 מ&quot;ג של כרית שומן השומן (5 עד 8 חתיכות) המתקבל NCD או HFD (± CAP) - עכבר סוג בר fed ב 200 DML μL המכיל 2% חומצת שומן BSA חינם BSA, FSM 10 מיקרומטר ו 5 מיקרומטר Triacsin C ב 37 ° C ב 5% CO 2 ו לחות 95% עבור 60 דקות. </strOng&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חתיכות רקמות באמצעות פינצטה בינוני זהה דגירה של 60 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו לחות 95%. איסוף בינוני הדגירה ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד assay lipolysis. הערה: גירוי של ליפוליזה גורם לשחרור מהיר של חומצות שומן וגליצרול בתוך 15 דקות, שהוא ליניארי במהלך השעה הראשונה, ו plateaus לאחר מכן. מאז שיעור lipolysis מגורה הוא גבוה ויציב בין השעה הראשונה והשנייה של גירוי FSK, פרוטוקול זה נמדד lipolysis במצב מגורה לאחר תקופת הדגירה השני כמתואר קודם לכן 1 . לכן, שני הצעדים הניסיוניים (5.1 ו 5.1.1) נחוצים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחלץ את השומן משכבות השומן המפשעות, מעבירים את החלקים החתוכים של כריות השומן במפרק (המתקבלים מ- NCD או HFD (± CAP) בעכברים ממקור 5) בעזרת שלב פינצטה, בעזרת מלקחיים לתוך 1 מ&quot;ל של תמיסת מיצוי (כלורופורם: מתנול (2) : 1. v /V) ו 1% חומצה אצטית קרחוני) ו דגירה של 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס תחת רועד נמרץ ב -100 סל&quot;ד. מחק את השומן החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה (משלב 5.2) באמצעות פינצטה לתוך צינור microfuge סטרילי המכיל 500 μL של פתרון תמוגה (0.3 N NaOH המכיל 0.1% SDS) ו דגירה לילה (12 שעות) ב 55 מעלות צלזיוס תחת רועד נמרץ ב -100 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון תוכן גליצרול של הרקמה כמתואר בשלבים 4.3 ו -4.4, בהתאמה. </li></ol> 6. הכנת מגיב גליצרול חינם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את מגיב גליצרול 19 ב 40 מ&quot;ל של מים deionized ב בקבוק זכוכית בצבע ענבר, במקום פקק על הבקבוקון ומערבבים היטב על ידי היפוך 10 פעמים. אין לערבב על ידי רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות בקבוקון ב 4 ° C בתוך מקרר מוגן מפני האור על ידי כיסוי הבקבוקון לחלוטין עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להכנת הכנת גליצרול (סעיף 7). </Li&gt; </ol> 7. הכנת גליצרול תקן וקביעת תוכן גליצרול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מלאי של 1 מ&quot;מ על ידי דילול 35 μL של מלאי שסופק עם 65 μL של מים deionized. הערה: היצרן סיפק מלאי גליצרול רגיל הוא 2.8 מ&quot;מ גליצרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 5 אורך 1 ס&quot;מ אורך cuvettes methacrylate חד פעמיות. תווית cuvettes באמצעות סמן כמו 0, 1.25, 2.5, 5 ו 10 תקן nmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0, 1.25, 2.5, 5 ו 10 μL של תקן 1 מ&quot;מ גליצרול את cuvettes שכותרתו. להמציא את עוצמת הקול של כל קובט 10 μL עם מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 1 עד 10 דילול של כל הדגימות (משלב 4.4 או 5.1.1) על ידי הוספת 10 μL של המדגם ל 90 μL של מים deionized לתוך צנטריפוגות טריים צנטריפוגות טריים 500 μL טרי. הוסף 10 μL של דגימות מדולל לתוך cuvettes שכותרתו עם מספר זיהוי מדגם בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ספקטרופוטומטר UV-VIS ולהגדיר את הגלאורך ל 540 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם מגיב גליצרול חינם לטמפרטורת החדר על ידי שמירה על בקבוקון (שלב 6.2) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר סדרה של cuvettes שכותרתו כמו ריק &quot;0&quot; תקן nmol (שלב 7.3), סטנדרטים (שלב 7.3) ודגימות (שלב 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של כל אחד מדגם רגיל לתוך קובט שכותרתו בהתאמה. השתמש &quot;0&quot; תקן nmol כמו ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.8 מ&quot;ל של מגיב גליצרול חינם לתוך כל קובט, המכיל את הסטנדרטים גליצרול באמצעות פיפטה 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את קובט עם 1.5 ס&quot;מ מרובע הסרט פלסטיק פרפין לערבב את התוכן על ידי הפיכת קובט במשך 3 פעמים ולהניח בצד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קובט ב ספקטרופוטומטר UV-VIS ו להקליט את ספיגת (540 ננומטר גל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את עקומת תקן באמצעות ריכוזים של סטנדרטים (nmol) ב X- ציר ואת absorbance נרשם על ציר Y. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הריכוז של גליסרול בדגימות (nmol) על ידי אקסטרפולציה באמצעות עקומת סטנדרטי מנוסח בשלב 7.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את ריכוז הדגימות (nmol / cuvette) עם גורם הדילול 10 (עיין בשלב 7.4) ו -20 (נפח כולל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את הריכוז של גליצרול בכל מדגם (שלב 7.13) על ידי מ&quot;ג של חלבון מחושב על ידי שיטת BCA. הערה: מאז הדגימה משטח השומן בדגימה מודגרת במשך 60 דקות, מייצגים את התוצאות כמו nmol של גליצרול / מ&quot;ג חלבון / ח. </li></ol>

<ol>
	<li>Schweiger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+lipolysis.">Measurement of lipolysis.</a> Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).</li><li>Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+adipose+tissue:+an+endocrine+organ.">Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ.</a> Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).</li><li>Richard, D., Picard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+biology+and+thermogenesis.">Brown fat biology and thermogenesis.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).</li><li>Barquissau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White-to-brite+conversion+in+human+adipocytes+promotes+metabolic+reprogramming+towards+fatty+acid+anabolic+and+catabolic+pathways.">White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways.</a> Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+adipocyte:+a+model+for+integration+of+cytokine+signaling+in+the+regulation+of+energy+metabolism.">Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).</li><li>Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown+and+pink+adipocytes:+the+extraordinary+plasticity+of+the+adipose+organ.">White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ.</a> Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).</li><li>Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+lipolysis+as+a+metabolic+pathway+to+define+pharmacological+strategies+against+obesity+and+the+metabolic+syndrome.">Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome.</a> Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).</li><li>Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+fat:+the+role+of+adipose+triglyceride+lipase+in+lipolysis.">Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis.</a> Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).</li><li>Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+triglyceride+lipase+regulates+basal+lipolysis+and+lipid+droplet+size+in+adipocytes.">Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes.</a> J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).</li><li>Kolditz, C. I., Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+lipolysis.">Adipose tissue lipolysis.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).</li><li>Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsaicin+induces+browning+of+white+adipose+tissue+and+counters+obesity+by+activating+TRPV1+channel-dependent+mechanisms.">Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPV1+by+dietary+capsaicin+improves+endothelium-dependent+vasorelaxation+and+prevents+hypertension.">Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension.</a> Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+lipolysis+response+to+adipose+afferent+reflex+involved+in+impaired+activation+of+adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone+sensitive+lipase+pathway+in+obesity.">Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity.</a> Sci Rep. 6, 34374 (2016).</li><li>Ohyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+exercise+and+capsinoid+supplementation+additively+suppresses+diet-induced+obesity+by+increasing+energy+expenditure+in+mice.">A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).</li><li>Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+steady+state+and+nonsteady-state+glycerol+kinetics+in+humans+using+deuterium-labeled+tracer.">Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer.</a> J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).</li><li>Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometric+method+for+measuring+glycerol+levels+and+enrichments+in+plasma+using+13C+and+2H+stable+isotopic+tracers.">A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers.</a> Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).</li><li>Baskaran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1+activation+counters+diet-induced+obesity+through+sirtuin-1+activation+and+PRDM-16+deacetylation+in+brown+adipose+tissue.">TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue.</a> Int J Obes (Lond). , (2017).</li><li>Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+upregulation+of+CD24+in+pre-adipocytes+promotes+adipogenesis.">Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis.</a> Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).</li><li>Schweiger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+lipolysis.">Measurement of lipolysis.</a> Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).</li><li>Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipolysis+in+adipocytes.">Regulation of lipolysis in adipocytes.</a> Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).</li><li>Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skinny+on+fat:+lipolysis+and+fatty+acid+utilization+in+adipocytes.">The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes.</a> Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).</li><li>Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+triglyceride+metabolism.+IV.+Hormonal+regulation+of+lipolysis+in+adipose+tissue.">Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).</li><li>Jeppesen, J., Kiens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+limitations+to+fatty+acid+oxidation+during+exercise.">Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise.</a> J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).</li><li>Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+energy+metabolism+by+long-chain+fatty+acids.">Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids.</a> Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).</li><li>Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+free+fatty+acids+and+peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+in+the+control+of+myocardial+uncoupling+protein+levels.">Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels.</a> Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).</li><li>Barbera, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+activates+transcription+of+the+brown+fat+uncoupling+protein-1+gene.+A+link+between+regulation+of+the+thermogenic+and+lipid+oxidation+pathways+in+the+brown+fat+cell.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell.</a> J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).</li><li>Leung, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsaicin+as+an+anti-obesity+drug.">Capsaicin as an anti-obesity drug.</a> Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).</li><li>Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermogenic+ingredients+and+body+weight+regulation.">Thermogenic ingredients and body weight regulation.</a> Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).</li><li>Kang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+capsaicin+reduces+obesity-induced+insulin+resistance+and+hepatic+steatosis+in+obese+mice+fed+a+high-fat+diet.">Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).</li><li>Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+glycerol+uptake+to+plasma+glycerol+concentration+in+the+normal+dog.">Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog.</a> Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).</li><li>Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+microfluidic+enzyme+assays+for+simultaneous+detection+of+lipolysis+products+from+adipocytes.">Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes.</a> Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

תהליך התמוטטות של TGL לתוך גליצרול וחומצות שומן הוא מזרז על ידי ATGL 9 במהלך ליפוליזה בסיסית מתוזמר על ידי מערך של חלבונים כולל הפעלת adenylyl cyclase / PKA תלוי מסלול במהלך ליפוליזה מגורה 21 , 22 , 23 . שיפור הליפוליזה מג?...

רקמות שומן שומרות אנרגיה כמו שומן 2 וחומצת שומן חומצה נדרשת עבור thermogenesis 3 , 4 . חומצות שומן שמקורן בדיאטות הן ארוזות יחד עם אפופרוטאינים לתוך chylomicrons ונמסר לרקמות שונות בגוף באמצעות זרימת הדם. למרות שרוב התאים בגוף לאחסן עתודה של אנרגיה, רקמת שומן שומרת עודף אנרגיה כמו שומן 5 , 6 . ליפוליזה ברקמת השומן מוסדר על ידי תהליכים מורכבים הפרטים המולקולריים של ליפוליזה עדיין להישאר מעורפל 7 . ליפוליזה היא תהליך שבו טריגליצרידים (TGL) מאוחסנים ברקמת השומן הם הידרוליזה לייצר גליצרול וחומצות שומן (FA) על ידי אנזים טריפליצרידים ליפאז (ATGL) 8 . שינויים ב ליפוליזה בסיסית ומעוררת היא תכונה אופיינית להשמנה. בAsal lipolysis הוא מוסדר על ידי הפעלת ATGL 9 , אשר ממיר TGL כדי diacylglycerol (DAG), כי הוא hydrolyzed לאחר מכן כדי monoacyl גליצרול (MAG). הפעלה של ליפז רגיש להורמון (HSL) באמצעות cyclase adenylyl מפעיל מחזורית אדנוזין monophosphate (cAMP) חלבון תלוי קינאז A (PKA) גירוי גורם ליפוליזה. מדידה של ליפוליזה, בסיס ומעוררת, היא, אם כן, חשוב לנתח את הפעילות של חלבונים המעורבים בתהליך זה. כמו כן, unraveling את הרגולציה המולקולרית של lipolysis עשוי להיות מועיל לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות נגד השמנה 10 . מאז, מולקולות המעוררות lipolysis וחומצת שומן חומצה הם מועמדים פוטנציאליים עבור שומנים מופחת המאוחסן במחסנים, חשוב להעסיק assay חסון לשחזור. נתונים שפורסמו בעבר מציעים כי הפעלה של חלבון TRPV1 לידי ביטוי ברקמת השומן הלבנה על ידי CAP משופר הבסיסו FSK (adenylyl cyclase activator) limolysis- מגרה של רפידות שומן המפשעה 11 . מחקרים קודמים גם מציעים כי הפעלה ארוכת טווח של TRPV1 על ידי CAP מפעילה PKA 12 . מאחר והפעלת ה- PKA מגרה ליפוליזה 13 , 14 , מדידת ליפוליזה מגורמת בסיסית ו- PKA תלויות בשומנים שומניים המבודדים מבדיקות NCD או HFD (± CAP) בעכברים לאחר 32 שבועות של הזנת הדיאטות המתאימות יאמת את תפקיד TRPV1 הפעלה בליפוליזה. מאמר זה מתאר שיטה יעילה לקביעת ליפוליזה בסיסית ומעוררת. למרות שיטות אחרות המעסיקות איזוטופים רדיואקטיביים של גליצרול ומייגע ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית או כרומטוגרפיה גז / ספקטרומטריית מסה עבור מדידות 15 , 16 זמינים, שיטה זו מציעה יותר ישיר, פשוט וחסכוניטכניקה כדי לקבוע lipolysis ברקמות השומן.

<table><tbody><tr><td>Capsaicin</td><td>Sigma, USA</td><td>M2028</td><td>TRPV1 agonist</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma, USA</td><td>F6886</td><td>Adenylyl cyclase activator</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE healthcare and life sciences, UT, USA</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>High fat diet</td><td>Research diets, New Brunswick, USA</td><td>D12492</td><td>Abbreviated as HFD</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, USA</td><td>O497</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma, USA</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, USA</td><td>D9163</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma, USA</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma, USA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol reagent</td><td>Sigma USA</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma, USA</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Triacsin C</td><td>Sigma, USA</td><td>T4540</td><td>Acyl CoA transferase inhibitor</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma, USA</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31998-8</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermofisher Scientific, USA</td><td>A412-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Amresco, USA</td><td>O583</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma, USA</td><td>L3371</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid reagent</td><td>Sigma, USA</td><td>BCA1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spectrophotometer</td><td>Pharmacia Biotech, NJ, USA</td><td>Ultrospec 2000</td><td></td></tr><tr><td>Normal chow diet</td><td>Labdiet.com</td><td>500I</td><td>abreviated as NCD</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Jackson Laboratory, CT, USA</td><td>Stock number000664</td><td>wild type mice</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Heathrow Scientific, USA</td><td>HS 234526A</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol standard</td><td>Sigma, USA</td><td>G7793</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads

Lipolysis הוא תהליך שבו שומנים שומנים כמו טריגליצרידים ברקמות השומן הם hydrolyzed לתוך גליצרול וחומצות שומן. מאמר זה מתאר את השיטה למדידת ליפוליזה מבושלת בסיסית ו- forskolin (FSK) בשומן השומן המבודד המבודד מעכברים מסוג בר, שאוכלו גם דיאטה רגילה של צ&#39;או (NCD), דיאטה עשירה בשומן (HFD) או דיאטה דלת שומן המכילה 0.01 % Capsaicin (CAP; קולטן חולף פוטנציאלי וניליל תת-קרקע 1 (TRPV1) אגוניסט) במשך 32 שבועות. השיטה המתוארת כאן לביצוע lipolysis vivo לשעבר מאומצת Schweiger et al. 1 אנו מציגים פרוטוקול מפורט למדידת רמות גליצרול על ידי UV-Visible (UV / VIS) spectrophotometry. השיטה המתוארת כאן ניתן להשתמש בהצלחה לבודד רפידות שומן השמנה עבור מדידות lipolysis להשיג תוצאות עקביות. פרוטוקול המתואר עבור רפידות שומן השד יכול בקלות להיות מורחבת למדוד ליפוליזה ברקמות אחרות.

כדי להעריך את ההשפעה של CAP על ליפוליזה בסיסית ומעוררת, מחקר זה נמדד lipolysis בשומנים שומן השומן המבודד מבודדים NCD או HFD (± CAP) - עכברים מסוג בר פראי. התוצאות המייצגות עבור הליפוליזה הבסיסית ו- FSK מגורה עבור כריתות השומן במעי הגס ניתנות בטבלה I. Basal ו F...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads at JoVE.com

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

פרוטוקול זה מתאר את השיטה של ​​קביעת lipolysis basal ו-forskolin מגורה ב pads שמנים השתן המתקבל דיאטה chow נורמלי (NCD) או דיאטה שומן גבוהה (HFD) ± capesicin מזין עכברים סוג בר. כמדד לליפוליזה, שחרור גליצרול נמדד מתוך רפידות שומן שומניות.

מדידה של ליפוליזה מגורה של Basal ו- Forskolin במרפאות שומן אדיפוז

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

measurement-basal-forskolin-stimulated-lipolysis-inguinal-adipose-fat

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Views.  University of Wyoming.  פרוטוקול זה מתאר את השיטה של ​​קביעת lipolysis basal ו-forskolin מגורה ב pads שמנים השתן המתקבל דיאטה chow נורמלי (NCD) או דיאטה שומן גבוהה (HFD) ± capesicin מזין עכברים סוג בר. כמדד לליפוליזה, שחרור גליצרול נמדד מתוך רפידות שומן שומניות. 

Video: Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1&#945; protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

מנגנון הוויסות של מספרי adipocyte למבוגרים אורגניזמים באמצעות בידול הומאוסטזיס אפופטוזיס

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

Developmental Biology

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health. Still, there are significant limitations to available primary culture models, all of which have failed to faithfully recapitulate the adipose microenvironment or extend WAT viability beyond two weeks. The lack of a reliable primary culture model severely impedes research in WAT metabolism and drug development. To this end we have utilized NIH's standards of a microphysiologic system to develop a novel platform for WAT primary culture called 'SWAT' (sandwiched white adipose tissue). We overcome the natural buoyancy of adipocytes by sandwiching minced WAT clusters between sheets of adipose-derived stromal cells. In this construct, WAT samples are viable over eight weeks in culture. SWAT maintains the intact ECM, cell-to-cell contacts, and physical pressures of in vivo WAT conditions; additionally, SWAT maintains a robust transcriptional profile, sensitivity to exogenous chemical signaling, and whole tissue function. SWAT represents a simple, reproducible, and effective method of primary adipose culture. Potentially, it is a broadly applicable platform for research in WAT physiology, pathophysiology, metabolism, and pharmaceutical development.

White adipose tissue (WAT) has critical deficiencies in its current primary culture models, hindering pharmacological development and metabolic studies. Here, we present a protocol to produce an adipose microphysiological system by sandwiching WAT between sheets of stromal cells. This construct provides a stable and adaptable platform for primary WAT culture.

פלטפורמה Microphysiologic שומן אנושי: דחוקה שומן לבן

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

Behavior

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

לוקליזציה, זיהוי, וכריתה של בסיס מיון Murine שומן

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

Medicine

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Immunology and Infection

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

תרבית תלת מימדית של רקמת שומן תרמוגנית וסקולרית מקטעים מיקרו-וסקולריים

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Bioengineering

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with multiple lipid droplets, a central nucleus, a high mitochondrial content, and the expression of uncoupling protein 1 (UCP1). BAT has been proposed as a potential therapeutic target for obesity and its associated metabolic disorders due to its ability to dissipate metabolic energy as heat. To investigate BAT function and regulation, brown adipocyte culturing is indispensable. The present protocol optimizes tissue processing and cell differentiation for culturing brown adipocytes from newborn mice. Additionally, procedures for the imaging of differentiated adipocytes with both confocal immunofluorescence and transmission electron microscopy are shown. In the brown adipocytes differentiated with the techniques described herein, the major defining features of classical BAT are preserved, including high UCP1 levels, increased mitochondrial mass, and very close physical contact between the lipid droplets and mitochondria, making this method a valuable tool for BAT studies.

Preadipocytes are isolated from the stromal vascular fraction of interscapular brown adipose tissue from newborn mice and differentiated into cells that accumulate lipid droplets, express molecular markers, and show the mitochondrial morphology of mature brown adipocytes. These cells are further analyzed by immunofluorescence and transmission electron microscopy.

התמיינות והדמיה של אדיפוציטים חומים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן הבין-סקפולרית מעכברים שזה עתה נולדו

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Biology

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are sequentially cleaved from the glycerol backbone, resulting in the release of free fatty acids and glycerol. Due to the low expression of glycerol kinase in white adipocytes, glycerol re-uptake rates are negligible, while fatty acid re-uptake is dictated by the fatty acid binding capacity of media components such as albumin. Both glycerol and fatty acid release into media can be quantified by colorimetric assays to determine the lipolytic rate. By measuring these factors at multiple time points, one can determine the linear rate of lipolysis with high confidence. Here, we provide a detailed protocol for the measurement of lipolysis in in vitro differentiated adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice. This protocol may also be optimized for other preadipocyte cell lines or adipose tissue from other organisms; considerations and optimization parameters are discussed. This protocol is designed to be useful in determining and comparing the rate of adipocyte lipolysis between mouse models and treatments.

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Triglyceride lipolysis in adipocytes is an important metabolic process resulting in the liberation of free fatty acids and glycerol. Here, we provide a detailed protocol to measure basal and stimulated lipolysis in adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice.

מדידת שיעור הליפוליזה ברקמת השומן Ex Vivo Murine ובפראדיפוציטים ראשוניים מובחנים במבחנה

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

בידוד חצי אוטומטי של רקמת שומן לבנה מורין

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

מחבר זרקור: בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה מרקמת שומן לבן מורין באמצעות דיסוציאטור רקמות  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

מדידה של ליפוליזה מגורה של Basal ו- Forskolin במרפאות שומן אדיפוז

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מנגנון הוויסות של מספרי adipocyte למבוגרים אורגניזמים באמצעות בידול הומאוסטזיס אפופטוזיס

פלטפורמה Microphysiologic שומן אנושי: דחוקה שומן לבן

לוקליזציה, זיהוי, וכריתה של בסיס מיון Murine שומן

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

תרבית תלת מימדית של רקמת שומן תרמוגנית וסקולרית מקטעים מיקרו-וסקולריים

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

התמיינות והדמיה של אדיפוציטים חומים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן הבין-סקפולרית מעכברים שזה עתה נולדו

מדידת שיעור הליפוליזה ברקמת השומן Ex Vivo Murine ובפראדיפוציטים ראשוניים מובחנים במבחנה

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות