この研究は、AH賞第15BGIA23250030号、国立医学総合研究所NIHの受賞番号8P20 GM103432-12およびワイオミング大学助成金助成金BTの支援を受けて行われました。

すべてのプロトコルは、ワイオミング大学の動物保護指針に従っています。 1.動物の住宅と給餌注：成体雄性野生型マウス（C57BL / 6）（12〜24週齢）は、施設動物実験および使用委員会（IACUC）承認プロトコルに従って研究動物施設で飼育した。 <ol><li> 6週目から開始して、4匹のグループのマウスを別々のケージに収容し、38才までNCDまたはHFDの摂食群（±0.01％CAP）にランダムに割り当てる。 注：CAPは、脂肪組織11、17で表さTRPV1チャネルタンパク質のアゴニストです。フード内部ブレンダーにHFDを有するキャップを混合し、2つのパーティションに小さい1を含有するトレイにブレンドした混合物を移します。トレイを-20℃の冷凍庫の中に保管してください。 24時間後にHFD + CAP飼料を入れたトレイを冷凍庫から取り出し、-20＆＃176;冷凍庫を使用するまで。 </li><li> （22.8±2.0℃、湿度45〜50％）、12/12ライト/ダークサイクルで、指定食および水を自由に使用できるハウスマウス。 </li><li> 38週の終わりに、鼠径脂肪組織を切開し、脂肪分解実験に使用する（セクション2-7）。 </li></ol> 2.実験のためのマウスの準備<ol><li>ケタミンとキシラジンの混合物（それぞれ10mg / kgおよび80mg / kg体重）を注射することによってマウスを麻酔する。混合物0.01mL /マウス体重10gを注射する。 </li><li>徹底的なつま先で深い麻酔を確認する。ペダル・リフレックスがある場合は、少なくとも30秒後に再度マウスをテストしてください。 </li><li>麻酔中の眼の乾燥を防ぐために、獣眼軟膏を使用する。いずれの処置中もマウスを放置しないでください。 </li><li>高用量のケタミンおよびキシラジン混合物注射（それぞれ10mg / kgおよび80mg / kg体重）の混合物を注射することによってマウスを安楽死させるe（0.01ml / 10g体重）、続いて頚部脱臼。 注：安楽死のこの方法は、ワイオミング大学のIACUCによって承認されています。 </li></ol> 3.腹腔脂肪脂肪パッドの分離<ol><li>手順のために左に横たわるマウス（NCDまたはHFD（±CAP）を32週間与えた）を置く。 注：マウスを左に置くことによって、左前肢および左後肢は解剖用プラットフォーム上にあり、右前肢および右後肢はプラットフォームから離れている。 </li><li> 70％エタノール約2.5mLのに浸し2インチ2ガーゼパッドで皮膚表面を殺菌。下にある脂肪層を明らかにするために、メスを使用して皮膚を通して2〜3mmの側方切開を行う。 </li><li> 2つの外側の切開を結合する背側表面を横切って胸郭の真下にある外科用メスを使用して、皮膚を通して1cmの切断（マウスのサイズに依存する）を行う。 </li><li>慎重にドラッグして皮弁を剥がす滅菌鉗子を使用し、脂肪パッドを切断しないことによって皮下パッドをそのまま残す。これは、皮膚の下に横たわっている太ったパッドです。 </li><li>脂肪のパッドを下の筋肉と筋膜から慎重に解剖し、はさみを使用してください。下の筋肉からカットされて脂肪パッドを引き出します。 注：脂肪パッドの重量とサイズは、マウスの種類（NCDまたはHFD（±CAP）が授与された）に依存します。 </li><li>室温（〜15分）で脂肪分解実験までリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含むペトリ皿にピンセットを移す。 </li><li>ステップ3.2-3.6で説明したように、脂肪パッドをマウスの右側から分離します。 </li></ol> 4.鼠径脂肪パッドからの基礎グリセロール放出<ol><li>シャープなはさみを使用して約20 mgの脂肪組織を5〜8個に切断します。 </li><li> 鼠径脂肪パッドのカットピースを200μLのインキュベーション培地（2％脂肪酸を含むダルベッコ変法イーゲル培地（DMEM））にインキュベートする。37℃、5％CO 2および95％湿度で60分間、無血清ウシ血清アルブミン（BSA）中で培養した。 <ol><li>インキュベーション培地を回収し、脂肪分解アッセイのために-80℃で凍結する。 注：切片は、脂質抽出後のタンパク質濃度の測定に使用されます。 </li><li>切断された脂肪片をピンセットを用いて1 mLの抽出溶液（クロロホルム：メタノール（2：1、v / v）および1％氷酢酸）に移し、100℃で激しく振盪しながら37℃で60分間インキュベートするrpm。脂肪抽出溶液を捨てる。 注：この手順は、カットピースから脂肪を抽出します。脂肪抽出溶液はタンパク質の測定を妨げるため、廃棄してください。 </li><li> 500μLの溶解液（0.1％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する0.3N NaOH; SDS）を含有する滅菌した微量遠心管にピンセットを用いて組織を移し（4.2.2）、激しく振盪しながら55℃で一晩インキュベートする100rpmで測定した。 </li></ol></li><li>標準18としてビシンコニン酸（BCA）試薬及びBSAを用いて組織のタンパク質濃度（ステップ4.2.3）を決定します。 </li><li> 氷上で凍結媒体（ステップ4.2.1）を解凍し、プロトコルセクション6及び7 6に記載したように遊離グリセロール試薬を用いて培地のグリセロール含量を決定します。 <ol><li>標準曲線から試料中のグリセロールの濃度を外挿するグリセロール標準19およびh 20当たりナノモルグリセロール当たりmgタンパク質として明示脂肪分解を使用してプロットしました。 </li></ol></li></ol> FSK刺激脂肪分解<ol><li> 2％の脂肪酸を含まないBSA、10μMのFSKおよび5μMのトライアクシンCを含有する200μLのDMEM中、NCDまたはHFD（±CAP）を与えた野生型マウスから得られた約20mgの鼠径脂肪パッド（5〜8切片）を、 5％CO 2および湿度95％で37℃で60分間インキュベートした。 </strong&gt; <ol><li>同じ培地にピンセットを使用して組織片を移し、37℃、5％CO 2および95％湿度でさらに60分間インキュベートする。インキュベーション培地を回収し、脂肪分解アッセイまで-80℃で保存する。 注：脂肪分解の刺激は、脂肪酸およびグリセロールの急速な放出を15分以内に引き起こし、これは最初の1時間の間は直線的であり、その後は平坦化する。誘導脂肪分解の速度はFSK刺激の第一及び第二の時間の間に高く、安定しているので、このプロトコルは、以前に1記載したように第2のインキュベーション期間後、刺激状態における脂肪分解を測定しました。したがって、実験ステップ（5.1および5.1.1）の両方が必要である。 </li></ol></li><li>鼠径脂肪パッドから脂肪を抽出するには、抽出溶液（クロロホルム：メタノール（2））1mLにピンセットを用いてステップ5.1の鼠径脂肪パッド（NCDまたはHFD（±CAP） ：1。v /v）および1％氷酢酸）で洗浄し、100rpmで激しく振盪しながら37℃で60分間インキュベートする。抽出脂肪を捨てる。 </li><li> 500μLの溶解液（0.1％SDSを含む0.3N NaOH）を含む滅菌微量遠心チューブにピンセットを用いて組織を移し（55℃、100rpmで激しく振盪しながら）、一晩（12時間）インキュベートする。 </li><li>ステップ4.3および4.4にそれぞれ記載されているように、組織のタンパク質濃度およびグリセロール含量を決定する。 </li></ol> 6.遊離グリセロール試薬の調製<ol><li>琥珀色のガラスバイアル中で40mLの脱イオン水中にグリセロール試薬19を再構成し、バイアルにストッパーを置き、10回反転させてよく混合する。振り混ぜはしないでください。 </li><li>バイアル瓶をアルミホイルで完全に覆うことによって、光から保護された冷蔵庫の中に4℃で保存します。 </li><li>グリセロール標準液の調製（セクション7）に進んでください。 </&gt; </ol> 7.グリセロール標準の調製およびグリセロール含有量の測定<ol><li> 35μLの供給ストックを65μLの脱イオン水で希釈して1mMのストックを調製する。 注：製造業者が供給するグリセロール標準品は2.8mMグリセロールです。 </li><li> 1cmの経路長の使い捨てメタクリレートキュベットを5本取る。マーカーを0,1.25,2.5,5,10 nmolの標準としてキュベットに標識する。 </li><li> 0mM、1.25mM、2.5mM、5μLおよび10μLの1mMグリセロール標準液をそれぞれの標識化キュベットに加える。脱イオン水で各キュベットの容量を10μLにします。 </li><li> 10μLのサンプルを90μLの脱イオン水に新鮮な500μLの前標識遠心チューブに加えることにより、すべてのサンプル（ステップ4.4または5.1.1）の1〜10倍希釈を行います。各サンプル識別番号でラベルされたキュベットに10μLの希釈サンプルを加えます。 </li><li> UV-VIS分光光度計のスイッチを入れ、波を設定します長さ〜540nm。 </li><li>バイアル（ステップ6.2）を室温で15分間保持することにより遊離グリセロール試薬を室温に温める。 </li><li>ブランク「0」nmol標準（ステップ7.3）、標準（ステップ7.3）およびサンプル（ステップ7.4）として一連の標識キュベットを設定する。 </li><li>スタンダードとサンプルのそれぞれ10μLをそれぞれの標識キュベットに加えます。ブランクとして &quot;0&quot; nmolスタンダードを使用してください。 </li><li> 1mLのピペットを用いてグリセロール標準を含有する各キュベットに0.8mLの遊離グリセロール試薬を加える。 </li><li>キュベットを1.5cm角のプラスチックパラフィンフィルムで覆い、キュベットを3回反転させて内容物を混合し、室温で10分間放置する。 </li><li>キュベットをUV-VIS分光光度計に置き、吸光度（波長540 nm）を記録する。 </li><li> X軸の標準濃度（nmol）およびY軸の記録吸光度を用いて標準曲線をプロットします。 </li><li> glの濃度を計算する（7.12）でプロットされた検量線を用いて外挿により試料中のγ-イセノールを定量する（nmol）。 </li><li>希釈倍率10（ステップ7.4参照）および20（全容積）でサンプルの濃度（nmol /キュベット）を掛け、 </li><li> BCA法で計算したタンパク質mgで、各サンプルのグリセロール濃度を除算する（ステップ7.13）。 注：鼠径脂肪パッドのサンプルは60分間インキュベートされているので、nmolのグリセロール/ mg蛋白質/ hとして結果を表します。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

グリセロールと脂肪酸にTGLの破壊プロセスは、基礎脂肪分解中ATGL 9によって触媒および誘導脂肪分解21、22、23間にアデニリルシクラーゼ/ PKA依存性経路の活性化を含むタンパク質のアレイによって調整されます。脂肪分解の強化は、輸送およびエネルギー使用のための血漿中の血漿レベルを増加させる<sup...

fat 2及び脂肪酸酸化が熱発生3,4のために必要とされるような脂肪組織は、エネルギーを蓄えます。ダイエットによって摂取された脂肪酸は、アポ蛋白質と共にキロミクロンにパッケージングされ、血液循環によって身体の異なる組織に送達される。本体ストアにおけるほとんどの細胞fat 5、6、エネルギーの予備、脂肪組織を格納する余分なエネルギーありません。脂肪組織における脂質分解は複雑なプロセスによって調節され、脂肪分解の分子的詳細はまだ曖昧なままである7 。 脂肪分解は、脂肪組織に貯蔵されたトリグリセリド（TGL）を加水分解して、酵素脂肪トリグリセリドリパーゼ（ATGL） 8によってグリセロールおよび脂肪酸（FA）を生成するプロセスである。基礎および刺激脂肪分解における変化は、肥満の特徴である。 The basal脂肪分解は、TGLをジアシルグリセロール（DAG）に変換し、続いてモノアシルグリセロール（MAG）に加水分解するATGL活性化9によって調節される。アデニリルシクラーゼを介して、ホルモン感受性リパーゼ（HSL）の活性化は、環状アデノシン一リン酸（cAMP）依存性プロテインキナーゼA（PKA）の刺激を活性化し、脂肪分解を引き起こします。従って、このプロセスに関与するタンパク質の活性を分析するためには、脂肪分解、基礎および刺激の測定が重要である。また、脂肪分解の分子調節を解明することは、肥満に対する新規な治療戦略を開発するために有益であり得る10 。脂肪分解および脂肪酸酸化を刺激する分子は、貯蔵所に貯蔵される脂肪を減少させる潜在的な候補であるので、再現性のために頑強なアッセイを用いることが重要である。 以前に公開されたデータは、CAPによる白色脂肪組織で発現されるTRPV1タンパク質の活性化が、および鼠径脂肪パッドにおけるFSK（アデニリルシクラーゼ活性化剤）刺激脂肪分解11 。前の研究はまた、CAPによるTRPV1の長期的な活性化はPKA 12を活性化させることを示唆しています。 PKAの活性化は、TRPV1の役割を検証するNCDまたは（CAP±）HFDそれぞれの食餌を給餌の32週間後-fedマウスから単離した鼠径脂肪パッドにおける基礎とPKA依存性刺激脂肪分解の両方を測定する脂肪分解13,14を刺激するので脂肪分解における活性化。 この記事では、基礎脂質分解および刺激脂肪分解を効率的に測定する方法について説明します。測定15のためのグリセロールおよび退屈な高速液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィー/質量分析法の放射性同位体を使用する他の方法が、16が利用可能であり、この方法は、より直接的簡単かつコスト効率を提供します脂肪組織における脂肪分解を決定する技術。

<table><tbody><tr><td>Capsaicin</td><td>Sigma, USA</td><td>M2028</td><td>TRPV1 agonist</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma, USA</td><td>F6886</td><td>Adenylyl cyclase activator</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE healthcare and life sciences, UT, USA</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>High fat diet</td><td>Research diets, New Brunswick, USA</td><td>D12492</td><td>Abbreviated as HFD</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, USA</td><td>O497</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma, USA</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, USA</td><td>D9163</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma, USA</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma, USA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol reagent</td><td>Sigma USA</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma, USA</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Triacsin C</td><td>Sigma, USA</td><td>T4540</td><td>Acyl CoA transferase inhibitor</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma, USA</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31998-8</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermofisher Scientific, USA</td><td>A412-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Amresco, USA</td><td>O583</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma, USA</td><td>L3371</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid reagent</td><td>Sigma, USA</td><td>BCA1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spectrophotometer</td><td>Pharmacia Biotech, NJ, USA</td><td>Ultrospec 2000</td><td></td></tr><tr><td>Normal chow diet</td><td>Labdiet.com</td><td>500I</td><td>abreviated as NCD</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Jackson Laboratory, CT, USA</td><td>Stock number000664</td><td>wild type mice</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Heathrow Scientific, USA</td><td>HS 234526A</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol standard</td><td>Sigma, USA</td><td>G7793</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads

脂肪分解は、脂肪組織中にトリグリセリドとして貯蔵された脂質を加水分解してグリセロールおよび脂肪酸にするプロセスである。この記事では、正常食餌（NCD）、高脂肪食（HFD）または0.01を含む高脂肪食餌を与えた野生型マウスから単離した鼠蹊脂肪パッドにおける基礎およびフォルスコリン（FSK）刺激脂肪分解の測定方法を記載するカプサイシン（CAP;一過性受容体ポテンシャルバニロイドサブファミリー1（TRPV1）アゴニスト）を32週間投与した。 生体外脂肪分解を実施するために本明細書に記載される方法は、Schweiger et al。 1 UV-Visible（UV / Vis）分光光度法によりグリセロールレベルを測定するための詳細なプロトコールを提示します。本明細書に記載の方法は、脂肪分解測定のための鼠径脂肪パッドを首尾よく分離して、一貫した結果を得るために使用することができる。鼠径脂肪パッドについて記載されたプロトコルは、他の組織における脂肪分解を測定するために容易に拡張することができる。

基礎および刺激脂肪分解に対するCAPの効果を評価するために、本研究では、NCDまたはHFD（±CAP）飼育野生型マウスから単離された鼠蹊脂肪細胞の脂質分解を測定した。鼠径脂肪パッドの基礎およびFSK刺激脂肪分解の代表的な結果を表Iに示す 。アシルcoAシンテターゼを阻害し、TGLの再生を妨げるトリアクシンCの存在下での基礎およびFSK刺激グ?...

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Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

このプロトコールは、正常飼料（NCD）または高脂肪食（HFD）+カプサイシン摂食野生型マウスから得られた鼠径脂肪パッドにおける基礎およびフォルスコリン刺激脂肪分解を決定する方法を記載する。脂肪分解の指標として、鼠径脂肪パッドからグリセロール放出を測定した。

腹腔脂肪脂肪パッドにおける基礎およびフォルスコリン刺激脂質測定の測定

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

measurement-basal-forskolin-stimulated-lipolysis-inguinal-adipose-fat

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K ビュー.  University of Wyoming. このプロトコールは、正常飼料（NCD）または高脂肪食（HFD）+カプサイシン摂食野生型マウスから得られた鼠径脂肪パッドにおける基礎およびフォルスコリン刺激脂肪分解を決定する方法を記載する。脂肪分解の指標として、鼠径脂肪パッドからグリセロール放出を測定した。 

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Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1&#945; protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

分化およびアポトーシス恒常性を通じアダルト生物における脂肪細胞の数の調節のメカニズム

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

発生生物学

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health. Still, there are significant limitations to available primary culture models, all of which have failed to faithfully recapitulate the adipose microenvironment or extend WAT viability beyond two weeks. The lack of a reliable primary culture model severely impedes research in WAT metabolism and drug development. To this end we have utilized NIH's standards of a microphysiologic system to develop a novel platform for WAT primary culture called 'SWAT' (sandwiched white adipose tissue). We overcome the natural buoyancy of adipocytes by sandwiching minced WAT clusters between sheets of adipose-derived stromal cells. In this construct, WAT samples are viable over eight weeks in culture. SWAT maintains the intact ECM, cell-to-cell contacts, and physical pressures of in vivo WAT conditions; additionally, SWAT maintains a robust transcriptional profile, sensitivity to exogenous chemical signaling, and whole tissue function. SWAT represents a simple, reproducible, and effective method of primary adipose culture. Potentially, it is a broadly applicable platform for research in WAT physiology, pathophysiology, metabolism, and pharmaceutical development.

White adipose tissue (WAT) has critical deficiencies in its current primary culture models, hindering pharmacological development and metabolic studies. Here, we present a protocol to produce an adipose microphysiological system by sandwiching WAT between sheets of stromal cells. This construct provides a stable and adaptable platform for primary WAT culture.

人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

行動学

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

マウス脂肪デポのローカライズ、識別、および切除

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

医学

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

免疫・感染学

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

生物工学

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

マウスにおける全身脂質処理能力の評価

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with multiple lipid droplets, a central nucleus, a high mitochondrial content, and the expression of uncoupling protein 1 (UCP1). BAT has been proposed as a potential therapeutic target for obesity and its associated metabolic disorders due to its ability to dissipate metabolic energy as heat. To investigate BAT function and regulation, brown adipocyte culturing is indispensable. The present protocol optimizes tissue processing and cell differentiation for culturing brown adipocytes from newborn mice. Additionally, procedures for the imaging of differentiated adipocytes with both confocal immunofluorescence and transmission electron microscopy are shown. In the brown adipocytes differentiated with the techniques described herein, the major defining features of classical BAT are preserved, including high UCP1 levels, increased mitochondrial mass, and very close physical contact between the lipid droplets and mitochondria, making this method a valuable tool for BAT studies.

Preadipocytes are isolated from the stromal vascular fraction of interscapular brown adipose tissue from newborn mice and differentiated into cells that accumulate lipid droplets, express molecular markers, and show the mitochondrial morphology of mature brown adipocytes. These cells are further analyzed by immunofluorescence and transmission electron microscopy.

新生仔マウスの肩甲間脂肪組織の間質血管画分からの褐色脂肪細胞の分化とイメージング

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

生物学

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are sequentially cleaved from the glycerol backbone, resulting in the release of free fatty acids and glycerol. Due to the low expression of glycerol kinase in white adipocytes, glycerol re-uptake rates are negligible, while fatty acid re-uptake is dictated by the fatty acid binding capacity of media components such as albumin. Both glycerol and fatty acid release into media can be quantified by colorimetric assays to determine the lipolytic rate. By measuring these factors at multiple time points, one can determine the linear rate of lipolysis with high confidence. Here, we provide a detailed protocol for the measurement of lipolysis in in vitro differentiated adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice. This protocol may also be optimized for other preadipocyte cell lines or adipose tissue from other organisms; considerations and optimization parameters are discussed. This protocol is designed to be useful in determining and comparing the rate of adipocyte lipolysis between mouse models and treatments.

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Triglyceride lipolysis in adipocytes is an important metabolic process resulting in the liberation of free fatty acids and glycerol. Here, we provide a detailed protocol to measure basal and stimulated lipolysis in adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice.

in vitroで分化したマウス脂肪組織および初代前駆脂肪細胞における脂肪分解の速度の測定

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

マウス白脂肪組織の半自動単離

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

著者スポットライト:組織解離器を使用したマウス白脂肪組織からの間質血管画分の半自動分離  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

腹腔脂肪脂肪パッドにおける基礎およびフォルスコリン刺激脂質測定の測定

要約

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分化およびアポトーシス恒常性を通じアダルト生物における脂肪細胞の数の調節のメカニズム

人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた

マウス脂肪デポのローカライズ、識別、および切除

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養

マウスにおける全身脂質処理能力の評価

新生仔マウスの肩甲間脂肪組織の間質血管画分からの褐色脂肪細胞の分化とイメージング

in vitroで分化したマウス脂肪組織および初代前駆脂肪細胞における脂肪分解の速度の測定

組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)

組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)