Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio AHA nº 15BGIA23250030, o Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH sob o número de prêmio 8P20 GM103432-12 e o Subsídio de Faculdade da Universidade de Wyoming em Aid to BT.

Todos os protocolos seguem as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Wyoming. 1. Alojamento e alimentação de animais NOTA: Os ratos adultos de tipo selvagem masculino (C57BL / 6) (idade 12 a 24 semanas) foram criados na unidade animal de pesquisa de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados Institucionais (IACUC). <ol><li> A partir da semana 6 da idade, os ratos domésticos em grupos de quatro em gaiolas separadas e atribuí-los aleatoriamente em grupos de alimentação de NCD ou HFD (± 0,01% CAP) até a semana 38 de idade. NOTA: CAP é um agonista da proteína do canal TRPV1 expresso em tecidos adiposos 11 , 17 . Misture o PAC com HFD em um liquidificador dentro do capô e transfira a mistura misturada para uma bandeja contendo pequenas unidades de 1 em 2 . Mantenha a bandeja dentro de um congelador de -20 ° C. Remova a bandeja contendo a dieta HFD + CAP do congelador após 24 h e guarde em um recipiente a -20 &amp;# 176; congelador C até o uso. </li><li> Ratinhos de casa em um ambiente controlado pelo clima (22,8 ± 2,0 ° C, 45 - 50% de umidade) com um ciclo de 12/12 luz / escuridão com acesso a dieta designada e água ad libitum . </li><li> No final de 38 semanas, dissecar tecidos adiposos inguinais e usar para experiências de lipólise (seções 2-7). </li></ol> 2. Preparando ratos para as experiências <ol><li> Anestesiar ratinhos injetando mistura de ketamina e xilazina (10 mg / kg e 80 mg / kg de peso corporal, respectivamente). Injetar 0,01 mL da mistura / 10 g de peso corporal do mouse. </li><li> Confirme a anestesia profunda por uma prega firme. Se houver um reflexo do pedal, teste o mouse novamente após pelo menos 30 s. </li><li> Use uma pomada de olho veterinário para evitar a secura dos olhos durante a anestesia. Não deixe ratos sem vigilância durante nenhum dos procedimentos. </li><li> Eutanizar camundongos injetando uma dose elevada de mistura de ketamina e mistura de xilazina (10 mg / kg e 80 mg / kg de peso corporal, respectivamente)E (0,01 ml / 10 g de peso corporal) seguido de deslocamento cervical. NOTA: Este método de eutanásia é aprovado pela IACUC da Universidade de Wyoming. </li></ol> 3. Isolamento de almofadas de gordura adiposa inguinal <ol><li> Coloque o mouse (alimentado com NCD ou HFD (± CAP) por 32 semanas) deitado à esquerda para o procedimento. NOTA: Ao colocar o mouse no lado esquerdo, o membro anterior esquerdo e o membro traseiro esquerdo estarão na plataforma de dissecação, enquanto o membro dianteiro direito e o membro traseiro direito ficarão afastados da plataforma. </li><li> Esterilizar a superfície da pele com uma almofada de 2 polegadas de 2 gazes embebidas em cerca de 2,5 mL de etanol a 70%. Faça um corte lateral de 2 a 3 mm através da pele usando um bisturi para revelar a camada gordurosa subjacente. </li><li> Faça um corte de 1 cm (dependendo do tamanho do mouse) através da pele usando um bisturi logo abaixo da caixa torácica através da superfície dorsal juntando as duas incisões laterais. </li><li> Retire a aba da pele arrastando-a cuidadosamenteUsando fórceps estéril e deixa a almofada subcutânea intacta ao não cortar as almofadas de gordura. Esta é a almofada gorda situada debaixo da pele. </li><li> Disseca cuidadosamente a almofada de gordura do músculo subjacente e da fáscia usando um par de tesouras. Puxe a almofada gorda à medida que é cortada do músculo subjacente. NOTA: O peso e o tamanho das almofadas de gordura dependem do tipo de camundongos (NCD ou HFD (± CAP) -fed). </li><li> Use pinças para transferi-lo para uma placa de Petri contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) até a experiência de lipólise, à temperatura ambiente (~ 15 min). </li><li> Aqueça as almofadas de gordura do lado direito do mouse conforme descrito nos passos 3.2-3.6. </li></ol> 4. Liberação basal de glicerol das almofadas de gordura inguinal <ol><li> Use tesoura afiada para cortar cerca de 20 mg de tecido adiposo em 5 a 8 peças. </li><li> Incubar as peças cortadas de almofadas de gordura inguinal em 200 μL de meio de incubação (Dulbecco&#39;s Model Eagel&#39;s Medium (DMEM) contendo 2% de ácido gordoAlbumina de soro bovino livre (BSA)) a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade durante 60 min. <ol><li> Recolher o meio de incubação e congelar a -80 ° C para ensaio de lipólise. NOTA: As peças cortadas são usadas para a determinação da concentração de proteína após a extração de lipídios. </li><li> Transfira as peças de gordura cortada com a ajuda de pinças para 1 mL de solução de extração (clorofórmio: metanol (2: 1, v / v) e 1% de ácido acético glacial) e incubar durante 60 minutos a 37 ° C sob agitação vigorosa a 100 Rpm. Descarte a solução de extração de gordura. NOTA: Esta etapa extrairá gordura das peças cortadas. Descarte a solução de extração de gordura, pois interferirá com a determinação da proteína. </li><li> Transferir o tecido (a partir do passo 4.2.2) usando uma pinça num tubo de microcentrífuga estéril contendo 500 μL de solução de lise (0,3 N de NaOH contendo 0,1% de dodecilsulfato de sódio SDS) e incubar durante a noite (12 h) a 55 ° C sob agitação vigorosa A 100 rpm. </li></ol></li><li> Determine a concentração de proteína do tecido (passo 4.2.3) usando o reagente do ácido bicinconinico (BCA) e BSA como padrão 18 . </li><li> Descongelar o meio congelado (passo 4.2.1) no gelo e determinar o teor de glicerol do meio utilizando um reagente de glicerol livre conforme descrito nas secções de protocolo 6 e 7 6 . <ol><li> Extrapolar a concentração de glicerol em amostras da curva padrão plotada usando padrões de glicerol 19 e lipólise expressa como nanomoles de glicerol por mg de proteína por h 20 . </li></ol></li></ol> 5. Lipólise estimulada por FSK <ol><li> Pré-incuba cerca de 20 mg de almofada de gordura inguinal (5 a 8 partes cortadas) obtidas a partir de NCD ou HFD (± CAP) - rato selvagem de tipo selvagem em 200 μL de DMEM contendo 2% de BSA livre de ácidos graxos, 10 μM de FSK e 5 μM de Triacsina C em 37 ° C em 5% de CO 2 e 95% de umidade durante 60 min. </strOng&gt; <ol><li> Transfira as peças de tecido usando pinças para um meio idêntico e incube por mais 60 min a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de umidade. Recolher o meio de incubação e armazenar a -80 ° C até o ensaio de lipólise. NOTA: A estimulação da lipólise provoca a liberação rápida de ácidos gordurosos e glicerol dentro de 15 minutos, que é linear durante a primeira hora, e planaltos a partir daí. Uma vez que a taxa de lipólise estimulada é maior e estável entre a primeira e segunda horas de estimulação com FSK, este protocolo mediu a lipólise no estado estimulado após o segundo período de incubação como descrito anteriormente 1 . Então, as etapas experimentais (5.1 e 5.1.1) são necessárias. </li></ol></li><li> Para extrair a gordura das almofadas de gordura inguinal, transfira as peças cortadas de almofadas de gordura inguinal (obtidas a partir de ratos NCD ou HFD (± CAP) do passo 5.1 com a ajuda de pinças em 1 mL de solução de extração (clorofórmio: metanol (2 : 1. v /V) e 1% de ácido acético glacial) e incubar durante 60 min a 37 ° C sob agitação vigorosa a 100 rpm. Descarte a gordura extraída. </li><li> Transfira o tecido (do passo 5.2) usando pinças para um tubo de microcentrífuga estéril contendo 500 μL de solução de lise (0,3N de NaOH contendo 0,1% de SDS) e incube durante a noite (12 h) a 55 ° C sob agitação vigorosa a 100 rpm. </li><li> Determine a concentração de proteína e o teor de glicerol do tecido como descrito nos passos 4.3 e 4.4, respectivamente. </li></ol> 6. Preparação do Reagente Gratuito de Glicerol <ol><li> Reconstitua o reagente de glicerol 19 em 40 mL de água desionizada em um frasco de vidro colorido âmbar, coloque uma rolha no frasco e misture bem invadindo 10 vezes. Não misture agitando. </li><li> Armazene o frasco para injectáveis ​​a 4 ° C dentro de um frigorífico protegido da luz, cobrindo o frasco completamente com papel alumínio. </li><li> Proceda à preparação do padrão de glicerol (seção 7). </Li&gt; </ol> 7. Preparação do padrão de glicerol e determinação do teor de glicerol <ol><li> Faça um estoque de 1 mM diluindo 35 μL do estoque fornecido com 65 μL de água desionizada. NOTA: O estoque padrão de glicerina fornecido pelo fabricante é 2,8 mM de glicerol. </li><li> Pegue cinco cubetas descartáveis ​​de metacrilato de 1 cm de comprimento de caminho. Rotule as cuvetes usando um marcador como padrão 0, 1.25, 2.5, 5 e 10 nmol. </li><li> Adicione 0, 1,25, 2,5, 5 e 10 μL de padrão de glicerol 1 mM às respectivas cuvetes rotuladas. Faça o volume de cada cuvete para 10 μL com água desionizada. </li><li> Faça uma diluição de 1 a 10 de todas as amostras (do passo 4.4 ou 5.1.1), adicionando 10 μL da amostra a 90 μL de água desionizada em tubos de centrífuga pré -tiquetados frescos de 500 μL. Adicione 10 μL das amostras diluídas nas cubetas rotuladas com o respectivo número de identificação da amostra. </li><li> Ligar o espectrofotômetro UV-VIS e ajustar a ondaComprimento até 540 nm. </li><li> Aquecer o reagente de glicerol livre até à temperatura ambiente, mantendo o frasco (passo 6.2) à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Configure uma série de cuvetes rotulados como padrão de nmol &quot;0&quot; em branco (passo 7.3), padrões (etapa 7.3) e amostras (passo 7.4). </li><li> Adicione 10 μL de cada padrão e amostra na respectiva cuvete rotulada. Use &quot;0&quot; nmol padrão como em branco. </li><li> Adicione 0,8 mL de reagente de glicerol livre em cada cuvete, contendo os padrões de glicerol usando uma pipeta de 1 mL. </li><li> Cubra a cuvete com uma película de parafina de plástico quadrada de 1,5 cm e misture o conteúdo invadindo a cuvete por 3 vezes e reserve à temperatura ambiente por 10 min. </li><li> Coloque a cuvete no espectrofotômetro UV-VIS e grave a absorvância (comprimento de onda de 540 nm). </li><li> Trace a curva padrão usando as concentrações dos padrões (nmol) no eixo X e a absorvância registrada no eixo Y. </li><li> Calcule a concentração de glYcerol nas amostras (nmol) por extrapolação usando a curva padrão plotada no passo 7.12. </li><li> Multiplique a concentração de amostras (nmol / cuvete) com o fator de diluição 10 (consulte o passo 7.4) e 20 (volume total) </li><li> Divida a concentração de glicerol em cada amostra (passo 7.13) pelo mg de proteína calculado pelo método BCA. NOTA: Uma vez que as amostras da almofada de gordura inguinal são incubadas durante 60 min, representam os resultados como nmol de glicerol / mg de proteína / h. </li></ol>

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	<li>Schweiger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+lipolysis.">Measurement of lipolysis.</a> Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).</li><li>Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+adipose+tissue:+an+endocrine+organ.">Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ.</a> Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).</li><li>Richard, D., Picard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+biology+and+thermogenesis.">Brown fat biology and thermogenesis.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).</li><li>Barquissau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White-to-brite+conversion+in+human+adipocytes+promotes+metabolic+reprogramming+towards+fatty+acid+anabolic+and+catabolic+pathways.">White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways.</a> Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+adipocyte:+a+model+for+integration+of+cytokine+signaling+in+the+regulation+of+energy+metabolism.">Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).</li><li>Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown+and+pink+adipocytes:+the+extraordinary+plasticity+of+the+adipose+organ.">White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ.</a> Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).</li><li>Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+lipolysis+as+a+metabolic+pathway+to+define+pharmacological+strategies+against+obesity+and+the+metabolic+syndrome.">Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome.</a> Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).</li><li>Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+fat:+the+role+of+adipose+triglyceride+lipase+in+lipolysis.">Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis.</a> Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).</li><li>Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+triglyceride+lipase+regulates+basal+lipolysis+and+lipid+droplet+size+in+adipocytes.">Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes.</a> J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).</li><li>Kolditz, C. I., Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+lipolysis.">Adipose tissue lipolysis.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).</li><li>Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsaicin+induces+browning+of+white+adipose+tissue+and+counters+obesity+by+activating+TRPV1+channel-dependent+mechanisms.">Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPV1+by+dietary+capsaicin+improves+endothelium-dependent+vasorelaxation+and+prevents+hypertension.">Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension.</a> Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+lipolysis+response+to+adipose+afferent+reflex+involved+in+impaired+activation+of+adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone+sensitive+lipase+pathway+in+obesity.">Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity.</a> Sci Rep. 6, 34374 (2016).</li><li>Ohyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+exercise+and+capsinoid+supplementation+additively+suppresses+diet-induced+obesity+by+increasing+energy+expenditure+in+mice.">A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).</li><li>Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+steady+state+and+nonsteady-state+glycerol+kinetics+in+humans+using+deuterium-labeled+tracer.">Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer.</a> J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).</li><li>Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometric+method+for+measuring+glycerol+levels+and+enrichments+in+plasma+using+13C+and+2H+stable+isotopic+tracers.">A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers.</a> Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).</li><li>Baskaran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1+activation+counters+diet-induced+obesity+through+sirtuin-1+activation+and+PRDM-16+deacetylation+in+brown+adipose+tissue.">TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue.</a> Int J Obes (Lond). , (2017).</li><li>Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+upregulation+of+CD24+in+pre-adipocytes+promotes+adipogenesis.">Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis.</a> Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).</li><li>Schweiger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+lipolysis.">Measurement of lipolysis.</a> Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).</li><li>Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipolysis+in+adipocytes.">Regulation of lipolysis in adipocytes.</a> Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).</li><li>Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skinny+on+fat:+lipolysis+and+fatty+acid+utilization+in+adipocytes.">The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes.</a> Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).</li><li>Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+triglyceride+metabolism.+IV.+Hormonal+regulation+of+lipolysis+in+adipose+tissue.">Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).</li><li>Jeppesen, J., Kiens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+limitations+to+fatty+acid+oxidation+during+exercise.">Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise.</a> J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).</li><li>Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+energy+metabolism+by+long-chain+fatty+acids.">Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids.</a> Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).</li><li>Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+free+fatty+acids+and+peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+in+the+control+of+myocardial+uncoupling+protein+levels.">Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels.</a> Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).</li><li>Barbera, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+activates+transcription+of+the+brown+fat+uncoupling+protein-1+gene.+A+link+between+regulation+of+the+thermogenic+and+lipid+oxidation+pathways+in+the+brown+fat+cell.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell.</a> J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).</li><li>Leung, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsaicin+as+an+anti-obesity+drug.">Capsaicin as an anti-obesity drug.</a> Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).</li><li>Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermogenic+ingredients+and+body+weight+regulation.">Thermogenic ingredients and body weight regulation.</a> Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).</li><li>Kang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+capsaicin+reduces+obesity-induced+insulin+resistance+and+hepatic+steatosis+in+obese+mice+fed+a+high-fat+diet.">Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).</li><li>Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+glycerol+uptake+to+plasma+glycerol+concentration+in+the+normal+dog.">Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog.</a> Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).</li><li>Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+microfluidic+enzyme+assays+for+simultaneous+detection+of+lipolysis+products+from+adipocytes.">Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes.</a> Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O processo de degradação de TGL em glicerol e ácidos graxos é catalisado por ATGL 9 durante a lipólise basal e orquestrado por uma série de proteínas, incluindo a ativação da via adenilil ciclase / dependente de PKA durante a lipólise estimulada 21 , 22 , 23 . O aprimoramento da lipólise aumenta os níveis plasmáticos de ácidos graxos para transporte e uso de energia 24</su...

Os tecidos adiposos armazenam a energia como gordura 2 e a oxidação de ácidos gordos é necessária para a termogênese 3 , 4 . Os ácidos gordurosos ingeridos através de dietas são embalados juntamente com as apoproteínas em quilomicrons e entregues a diferentes tecidos no corpo através da circulação sanguínea. Embora a maioria das células no corpo armazene uma reserva de energia, o tecido adiposo armazena o excesso de energia como gordura 5 , 6 . A lipólise no tecido adiposo é regulada por processos complexos e os detalhes moleculares da lipólise ainda permanecem vagos 7 . A lipólise é um processo pelo qual os triglicerídeos (TGL) armazenados em tecido adiposo são hidrolisados ​​para produzir glicerol e ácidos graxos (FA) pela enzima lipidélio triglicerídeo adiposo (ATGL) 8 . As alterações na lipólise basal e estimulada são características da obesidade. O bA lipólise de asal é regulada pela ativação ATGL 9 , que converte TGL em diacilglicerol (DAG), que posteriormente é hidrolisado em monoacil glicerol (MAG). A ativação da lipase sensível a hormonas (HSL) via adenilil ciclase ativa a estimulação da proteína quinase A (PKA) dependente da adenosina cíclica (cAMP) e causa lipólise. A medição da lipólise, basal e estimulada, é, portanto, importante analisar a atividade das proteínas envolvidas neste processo. Além disso, desvendar a regulação molecular da lipólise pode ser benéfica para desenvolver novas estratégias terapêuticas contra a obesidade 10 . Uma vez que, moléculas que estimulam lipólise e oxidação de ácidos gordos são potenciais candidatos para a diminuição de gorduras armazenadas em depósitos, é importante empregar um ensaio robusto para a reprodutibilidade. Dados anteriormente publicados sugerem que a ativação da proteína TRPV1 expressa em tecido adiposo branco por CAP reforçada basalE FSK (ativador de adenilil ciclase) - lipólise estimulada em almofadas de gordura inguinal 11 . Pesquisas anteriores também sugerem que a ativação a longo prazo de TRPV1 por CAP ativa a PKA 12 . Uma vez que a ativação da PKA estimula a lipólise 13 , 14 , a medição da lipólise estimulada basal e PKA estimulada nas almofadas de gordura inguinal isoladas de ratos NCD ou HFD (± CAP) após 32 semanas de alimentação, as dietas respectivas validarão o papel de TRPV1 Ativação na lipólise. Este artigo descreve um método eficiente de determinação de lipólise basal e estimulada. Embora outros métodos que empregem isótopos radioativos de glicerol e cromatografia líquida tediosa de alta performance ou cromatografia gasosa / espectrometria de massa para medições 15 , 16 estejam disponíveis, esse método oferece um método mais direto, simples e econômicoTécnica para determinar lipólise em tecidos adiposos.

<table><tbody><tr><td>Capsaicin</td><td>Sigma, USA</td><td>M2028</td><td>TRPV1 agonist</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma, USA</td><td>F6886</td><td>Adenylyl cyclase activator</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE healthcare and life sciences, UT, USA</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>High fat diet</td><td>Research diets, New Brunswick, USA</td><td>D12492</td><td>Abbreviated as HFD</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, USA</td><td>O497</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma, USA</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, USA</td><td>D9163</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma, USA</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma, USA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol reagent</td><td>Sigma USA</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma, USA</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Triacsin C</td><td>Sigma, USA</td><td>T4540</td><td>Acyl CoA transferase inhibitor</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma, USA</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31998-8</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermofisher Scientific, USA</td><td>A412-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Amresco, USA</td><td>O583</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma, USA</td><td>L3371</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid reagent</td><td>Sigma, USA</td><td>BCA1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spectrophotometer</td><td>Pharmacia Biotech, NJ, USA</td><td>Ultrospec 2000</td><td></td></tr><tr><td>Normal chow diet</td><td>Labdiet.com</td><td>500I</td><td>abreviated as NCD</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Jackson Laboratory, CT, USA</td><td>Stock number000664</td><td>wild type mice</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Heathrow Scientific, USA</td><td>HS 234526A</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol standard</td><td>Sigma, USA</td><td>G7793</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads

A lipólise é um processo pelo qual o lípido armazenado como triglicerídeos em tecidos adiposos é hidrolisado em glicerol e ácidos graxos. Este artigo descreve o método para a medição de lipólise estimulada basal e forscolina (FSK) nas almofadas de gordura inguinal isoladas de camundongos de tipo selvagem alimentados com dieta normal (NCD), dieta com alto teor de gordura (HFD) ou uma dieta rica em gordura contendo 0,01 % De capsaicina (CAP; agonista do subfamília Vanilloid do potencial de receptores transitórios 1 (TRPV1) durante 32 semanas. O método aqui descrito para a realização de lipólise ex vivo é adotado a partir de Schweiger et al. 1 Apresentamos um protocolo detalhado para medir os níveis de glicerol por espectrofotometria UV-Visível (UV / VIS). O método descrito aqui pode ser usado para isolar com sucesso as almofadas de gordura inguinal para medições de lipólise para obter resultados consistentes. O protocolo descrito para almofadas de gordura inguinal pode prontamente ser ampliado para medir a lipólise em outros tecidos.

Para avaliar o efeito da CAP sobre lipólise basal e estimulada, esta pesquisa mediu a lipólise em almofadas de gordura adiposa inguinal isoladas de camundongos selvagens de NCD ou HFD (± CAP). Os resultados representativos para a lipólise basal e estimulada por FSK para as almofadas de gordura inguinal são apresentados na Tabela I. Liberação de glicerol estimulada basal e FSK na presença de Triacsina C, que inibe a acil coA sintetase e evita a regeneração de TG...

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Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Este protocolo descreve o método de determinação da lipólise basal e estimulada com forscolina em almofadas de gordura inguinal obtidas a partir de dieta normal (NCD) ou dieta rica em gordura (HFD) ± capsaicina alimentada com camundongos de tipo selvagem. Como índice de lipólise, a libertação de glicerol foi medida a partir de almofadas de gordura adiposa inguinal.

Medição da lipólise basal e estimulada por Forskolin em almofadas de gordura adiposa inguinal

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

measurement-basal-forskolin-stimulated-lipolysis-inguinal-adipose-fat

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.6K visualizações.  University of Wyoming.  Este protocolo descreve o método de determinação da lipólise basal e estimulada com forscolina em almofadas de gordura inguinal obtidas a partir de dieta normal (NCD) ou dieta rica em gordura (HFD) ± capsaicina alimentada com camundongos de tipo selvagem. Como índice de lipólise, a libertação de glicerol foi medida a partir de almofadas de gordura adiposa inguinal. 

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Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1&#945; protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

Mecanismo do Regulamento de Números de adipócitos em adultos Organismos através da diferenciação e apoptose homeostase

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

Biologia do Desenvolvimento

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health. Still, there are significant limitations to available primary culture models, all of which have failed to faithfully recapitulate the adipose microenvironment or extend WAT viability beyond two weeks. The lack of a reliable primary culture model severely impedes research in WAT metabolism and drug development. To this end we have utilized NIH's standards of a microphysiologic system to develop a novel platform for WAT primary culture called 'SWAT' (sandwiched white adipose tissue). We overcome the natural buoyancy of adipocytes by sandwiching minced WAT clusters between sheets of adipose-derived stromal cells. In this construct, WAT samples are viable over eight weeks in culture. SWAT maintains the intact ECM, cell-to-cell contacts, and physical pressures of in vivo WAT conditions; additionally, SWAT maintains a robust transcriptional profile, sensitivity to exogenous chemical signaling, and whole tissue function. SWAT represents a simple, reproducible, and effective method of primary adipose culture. Potentially, it is a broadly applicable platform for research in WAT physiology, pathophysiology, metabolism, and pharmaceutical development.

White adipose tissue (WAT) has critical deficiencies in its current primary culture models, hindering pharmacological development and metabolic studies. Here, we present a protocol to produce an adipose microphysiological system by sandwiching WAT between sheets of stromal cells. This construct provides a stable and adaptable platform for primary WAT culture.

Uma plataforma de Microphysiologic para gordura humana: imprensado tecido adiposo branco

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

Comportamento

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

Medicina

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Biologia

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

Avaliando a capacidade de manuseio de lipídios em camundongos

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with multiple lipid droplets, a central nucleus, a high mitochondrial content, and the expression of uncoupling protein 1 (UCP1). BAT has been proposed as a potential therapeutic target for obesity and its associated metabolic disorders due to its ability to dissipate metabolic energy as heat. To investigate BAT function and regulation, brown adipocyte culturing is indispensable. The present protocol optimizes tissue processing and cell differentiation for culturing brown adipocytes from newborn mice. Additionally, procedures for the imaging of differentiated adipocytes with both confocal immunofluorescence and transmission electron microscopy are shown. In the brown adipocytes differentiated with the techniques described herein, the major defining features of classical BAT are preserved, including high UCP1 levels, increased mitochondrial mass, and very close physical contact between the lipid droplets and mitochondria, making this method a valuable tool for BAT studies.

Preadipocytes are isolated from the stromal vascular fraction of interscapular brown adipose tissue from newborn mice and differentiated into cells that accumulate lipid droplets, express molecular markers, and show the mitochondrial morphology of mature brown adipocytes. These cells are further analyzed by immunofluorescence and transmission electron microscopy.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are sequentially cleaved from the glycerol backbone, resulting in the release of free fatty acids and glycerol. Due to the low expression of glycerol kinase in white adipocytes, glycerol re-uptake rates are negligible, while fatty acid re-uptake is dictated by the fatty acid binding capacity of media components such as albumin. Both glycerol and fatty acid release into media can be quantified by colorimetric assays to determine the lipolytic rate. By measuring these factors at multiple time points, one can determine the linear rate of lipolysis with high confidence. Here, we provide a detailed protocol for the measurement of lipolysis in in vitro differentiated adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice. This protocol may also be optimized for other preadipocyte cell lines or adipose tissue from other organisms; considerations and optimization parameters are discussed. This protocol is designed to be useful in determining and comparing the rate of adipocyte lipolysis between mouse models and treatments.

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Triglyceride lipolysis in adipocytes is an important metabolic process resulting in the liberation of free fatty acids and glycerol. Here, we provide a detailed protocol to measure basal and stimulated lipolysis in adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice.

Mensuração da Taxa de Lipólise em Tecido Adiposo Murino Ex Vivo e Pré-adipócitos Primários Diferenciados In Vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

Isolamento Semi-Automatizado de Tecido Adiposo Branco Murino

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Autor em destaque: Isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal do tecido adiposo branco murino usando um dissociador de tecido  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Medição da lipólise basal e estimulada por Forskolin em almofadas de gordura adiposa inguinal

Resumo

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Mensuração da Taxa de Lipólise em Tecido Adiposo Murino Ex Vivo e Pré-adipócitos Primários Diferenciados In Vitro

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido