עבודה זו נתמכה על ידי AHA פרס מס &#39;15BGIA23250030, המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של NIH תחת מספר הפרס 8P20 GM103432-12 ואת האוניברסיטה של ​​ויומינג סגל גרנט בסיוע BT.

כל הפרוטוקולים עוקבים אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ויומינג. 1. בעלי חיים דיור האכלה הערה: עכברים סוג בר המין הזכר (C57BL / 6) (בגיל 12 עד 24 שבועות) היו bred במתקן החיות מחקר לפי הפרוטוקול מאושרים טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משבוע 6 של גיל, עכברי הבית בקבוצות של ארבעה בכלובים נפרדים באופן אקראי להקצות אותם לקבוצות האכלה של NCD או HFD (± 0.01% CAP) עד שבוע 38 של גיל. הערה: CAP הוא אגוניסט של חלבון ערוץ TRPV1 לידי ביטוי ברקמות השומן 11 , 17 . מערבבים CAP עם HFD בבלנדר בתוך מכסה המנוע ומעבירים את התערובת המעורבת למגש המכיל 1 מתוך 2 מחיצות. שמור את המגש בתוך מקפיא -20 ° C. הסר את המגש המכיל את הדיאטה HFD + CAP מן המקפיא לאחר 24 שעות ו לאחסן במיכל ב -20 &amp;# 176; מקפיא C עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי הבית בסביבה מבוקרת אקלים (22.8 ± 2.0 ° C, לחות של 45% -50%) עם מחזור של 12/12-Light / Dark עם גישה לתזונה ייעודית וליביטום למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף 38 שבועות, לנתח רקמות השומן המפשעה ולהשתמש עבור ניסויים lipolysis (סעיפים 2-7). </li></ol> 2. הכנת עכברים עבור הניסויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי הזרקת תערובת קטמין ו xylazine (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג ו 80 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל גוף, בהתאמה). להזריק 0.01 מ&quot;ל של תערובת / 10 גרם משקל הגוף של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור הרדמה עמוקה על ידי קמצוץ הבוהן המשרד. אם יש רפלקס פדלים, לבדוק את העכבר שוב לאחר לפחות 30 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משחה עין וטרינר כדי למנוע יובש בעיניים במהלך הרדמה. אין להשאיר עכברים ללא השגחה במהלך כל ההליכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי הזרקת מנה גבוהה של קטמין ו xylazine הזרקה תערובת (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג ו 80 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל הגוף, בהתאמה) mixturE (0.01 מ&quot;ל / 10 גרם משקל גוף) ואחריו נקע צוואר הרחם. הערה: שיטה זו של המתת חסד מאושרת על ידי IACUC של אוניברסיטת ויומינג. </li></ol> 3. בידוד של שומן שומנים שומן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר (fed עם NCD או HFD (± CAP) במשך 32 שבועות) שוכב על שמאל עבור ההליך. הערה: על ידי הנחת העכבר בצד שמאל, שמאל forelimb ו hindlimb שמאל יהיה על פלטפורמת לנתיחה, בעוד forelimb הנכון hindlimb הנכון יהיה פונה מן הפלטפורמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את פני העור עם 2 אינץ &#39; 2 כרית גזה ספוגה ב 2.5 מ&quot;ל של 70% אתנול. לעשות חתך לרוחב 2 - 3 מ&quot;מ דרך העור באמצעות איזמל לחשוף את שכבת השומן הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך 1 ס&quot;מ (בהתאם לגודל של העכבר) דרך העור באמצעות אזמל ממש מתחת לכלוב הצלעות על פני השטח הגבי שהצטרף שתי חתכים לרוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף את דש העור על ידי גרירתו בזהירותבאמצעות מלקחיים סטרילית ולהשאיר את כרית תת עורית שלם על ידי לא לחתוך את רפידות שומן. זהו משטח השומן המוטל מתחת לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את פנקס השומן בזהירות מן השריר הבסיסי ו fascia באמצעות זוג מספריים. משוך את משטח השומן כפי שהוא חתך מן השריר הבסיסית. הערה: המשקל והגודל של רפידות השומן תלוי בסוג העכברים (NCD או HFD (± CAP) - fed). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פינצטה להעביר אותו צלחת פטרי המכיל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עד הניסויים lipolysis, בטמפרטורת החדר (~ 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את רפידות שומן מהצד הימני של העכבר כמתואר בשלבים 3.2-3.6. </li></ol> 4. בסל גליצרול שחרור מן השומן pads <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים חדים לחתוך על 20 מ&quot;ג של רקמת שומן ל 5 עד 8 חתיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חתיכות לחתוך של כריות שומן במפשעה μL 200 של המדיום דגירה (Dulbecco השתנה Eagel של בינונית (DMEM) המכיל 2% חומצת שומןללא תשלום אלבומין בסרום (BSA)) ב 37 ° C, 5% CO 2 ו לחות 95% עבור 60 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את המדיום דגירה להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס עבור assay lipolysis. הערה: חתיכות לחתוך משמשים לקביעת ריכוז חלבון לאחר מיצוי השומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חתיכות שומן לחתוך בעזרת מלקחיים לתוך 1 מ&quot;ל של תמיסת מיצוי (כלורופורם: מתנול (2: 1, V / V) ו 1% חומצה אצטית קרחוני) ו דגירה של 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס תחת רועד נמרץ ב 100 סל&quot;ד. מחק את פתרון מיצוי השומן. הערה: שלב זה יהיה לחלץ שומן מן חתיכות לחתוך. מחק את פתרון מיצוי השומן כפי שהוא יפריע לקביעת חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמה (משלב 4.2.2) באמצעות פינצטה לתוך צינור microfuge סטרילי המכיל 500 μL של פתרון תמוגה (0.3 N NaOH המכיל 0.1% נתרן dodecyl סולפט, SDS) ו דגירה לילה (12 שעות) ב 55 מעלות צלזיוס תחת רעידה נמרצת ב 100 סל&quot;ד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון של הרקמה (שלב 4.2.3) באמצעות bicinchoninic חומצה (BCA) מגיב BSA כסטנדרט 18 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את המדיום קפוא (שלב 4.2.1) על הקרח ולקבוע את התוכן גליצרול של המדיום באמצעות מגיב גליצרול חינם כמתואר בסעיפים פרוטוקול 6 ו 7 6 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקסטרפולציה של ריכוז גליצרול בדגימות מן עקומת תקן זממו באמצעות תקנים גליצרול 19 וליפוליזה מפורשת כמו nlyomoles גליצרול לכל חלבון מ&quot;ג לכל ח 20 . </li></ol></li></ol> 5. FSK מגורה lipolysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Preincubate על 20 מ&quot;ג של כרית שומן השומן (5 עד 8 חתיכות) המתקבל NCD או HFD (± CAP) - עכבר סוג בר fed ב 200 DML μL המכיל 2% חומצת שומן BSA חינם BSA, FSM 10 מיקרומטר ו 5 מיקרומטר Triacsin C ב 37 ° C ב 5% CO 2 ו לחות 95% עבור 60 דקות. </strOng&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חתיכות רקמות באמצעות פינצטה בינוני זהה דגירה של 60 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו לחות 95%. איסוף בינוני הדגירה ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד assay lipolysis. הערה: גירוי של ליפוליזה גורם לשחרור מהיר של חומצות שומן וגליצרול בתוך 15 דקות, שהוא ליניארי במהלך השעה הראשונה, ו plateaus לאחר מכן. מאז שיעור lipolysis מגורה הוא גבוה ויציב בין השעה הראשונה והשנייה של גירוי FSK, פרוטוקול זה נמדד lipolysis במצב מגורה לאחר תקופת הדגירה השני כמתואר קודם לכן 1 . לכן, שני הצעדים הניסיוניים (5.1 ו 5.1.1) נחוצים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחלץ את השומן משכבות השומן המפשעות, מעבירים את החלקים החתוכים של כריות השומן במפרק (המתקבלים מ- NCD או HFD (± CAP) בעכברים ממקור 5) בעזרת שלב פינצטה, בעזרת מלקחיים לתוך 1 מ&quot;ל של תמיסת מיצוי (כלורופורם: מתנול (2) : 1. v /V) ו 1% חומצה אצטית קרחוני) ו דגירה של 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס תחת רועד נמרץ ב -100 סל&quot;ד. מחק את השומן החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה (משלב 5.2) באמצעות פינצטה לתוך צינור microfuge סטרילי המכיל 500 μL של פתרון תמוגה (0.3 N NaOH המכיל 0.1% SDS) ו דגירה לילה (12 שעות) ב 55 מעלות צלזיוס תחת רועד נמרץ ב -100 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון תוכן גליצרול של הרקמה כמתואר בשלבים 4.3 ו -4.4, בהתאמה. </li></ol> 6. הכנת מגיב גליצרול חינם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את מגיב גליצרול 19 ב 40 מ&quot;ל של מים deionized ב בקבוק זכוכית בצבע ענבר, במקום פקק על הבקבוקון ומערבבים היטב על ידי היפוך 10 פעמים. אין לערבב על ידי רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות בקבוקון ב 4 ° C בתוך מקרר מוגן מפני האור על ידי כיסוי הבקבוקון לחלוטין עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להכנת הכנת גליצרול (סעיף 7). </Li&gt; </ol> 7. הכנת גליצרול תקן וקביעת תוכן גליצרול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מלאי של 1 מ&quot;מ על ידי דילול 35 μL של מלאי שסופק עם 65 μL של מים deionized. הערה: היצרן סיפק מלאי גליצרול רגיל הוא 2.8 מ&quot;מ גליצרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 5 אורך 1 ס&quot;מ אורך cuvettes methacrylate חד פעמיות. תווית cuvettes באמצעות סמן כמו 0, 1.25, 2.5, 5 ו 10 תקן nmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0, 1.25, 2.5, 5 ו 10 μL של תקן 1 מ&quot;מ גליצרול את cuvettes שכותרתו. להמציא את עוצמת הקול של כל קובט 10 μL עם מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 1 עד 10 דילול של כל הדגימות (משלב 4.4 או 5.1.1) על ידי הוספת 10 μL של המדגם ל 90 μL של מים deionized לתוך צנטריפוגות טריים צנטריפוגות טריים 500 μL טרי. הוסף 10 μL של דגימות מדולל לתוך cuvettes שכותרתו עם מספר זיהוי מדגם בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ספקטרופוטומטר UV-VIS ולהגדיר את הגלאורך ל 540 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם מגיב גליצרול חינם לטמפרטורת החדר על ידי שמירה על בקבוקון (שלב 6.2) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר סדרה של cuvettes שכותרתו כמו ריק &quot;0&quot; תקן nmol (שלב 7.3), סטנדרטים (שלב 7.3) ודגימות (שלב 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של כל אחד מדגם רגיל לתוך קובט שכותרתו בהתאמה. השתמש &quot;0&quot; תקן nmol כמו ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.8 מ&quot;ל של מגיב גליצרול חינם לתוך כל קובט, המכיל את הסטנדרטים גליצרול באמצעות פיפטה 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את קובט עם 1.5 ס&quot;מ מרובע הסרט פלסטיק פרפין לערבב את התוכן על ידי הפיכת קובט במשך 3 פעמים ולהניח בצד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קובט ב ספקטרופוטומטר UV-VIS ו להקליט את ספיגת (540 ננומטר גל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את עקומת תקן באמצעות ריכוזים של סטנדרטים (nmol) ב X- ציר ואת absorbance נרשם על ציר Y. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הריכוז של גליסרול בדגימות (nmol) על ידי אקסטרפולציה באמצעות עקומת סטנדרטי מנוסח בשלב 7.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את ריכוז הדגימות (nmol / cuvette) עם גורם הדילול 10 (עיין בשלב 7.4) ו -20 (נפח כולל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את הריכוז של גליצרול בכל מדגם (שלב 7.13) על ידי מ&quot;ג של חלבון מחושב על ידי שיטת BCA. הערה: מאז הדגימה משטח השומן בדגימה מודגרת במשך 60 דקות, מייצגים את התוצאות כמו nmol של גליצרול / מ&quot;ג חלבון / ח. </li></ol>

<ol>
	<li>Schweiger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+lipolysis.">Measurement of lipolysis.</a> Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).</li><li>Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+adipose+tissue:+an+endocrine+organ.">Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ.</a> Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).</li><li>Richard, D., Picard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+biology+and+thermogenesis.">Brown fat biology and thermogenesis.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).</li><li>Barquissau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White-to-brite+conversion+in+human+adipocytes+promotes+metabolic+reprogramming+towards+fatty+acid+anabolic+and+catabolic+pathways.">White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways.</a> Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+adipocyte:+a+model+for+integration+of+cytokine+signaling+in+the+regulation+of+energy+metabolism.">Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).</li><li>Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown+and+pink+adipocytes:+the+extraordinary+plasticity+of+the+adipose+organ.">White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ.</a> Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).</li><li>Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+lipolysis+as+a+metabolic+pathway+to+define+pharmacological+strategies+against+obesity+and+the+metabolic+syndrome.">Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome.</a> Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).</li><li>Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+fat:+the+role+of+adipose+triglyceride+lipase+in+lipolysis.">Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis.</a> Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).</li><li>Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+triglyceride+lipase+regulates+basal+lipolysis+and+lipid+droplet+size+in+adipocytes.">Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes.</a> J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).</li><li>Kolditz, C. I., Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+lipolysis.">Adipose tissue lipolysis.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).</li><li>Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsaicin+induces+browning+of+white+adipose+tissue+and+counters+obesity+by+activating+TRPV1+channel-dependent+mechanisms.">Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPV1+by+dietary+capsaicin+improves+endothelium-dependent+vasorelaxation+and+prevents+hypertension.">Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension.</a> Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+lipolysis+response+to+adipose+afferent+reflex+involved+in+impaired+activation+of+adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone+sensitive+lipase+pathway+in+obesity.">Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity.</a> Sci Rep. 6, 34374 (2016).</li><li>Ohyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+exercise+and+capsinoid+supplementation+additively+suppresses+diet-induced+obesity+by+increasing+energy+expenditure+in+mice.">A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).</li><li>Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+steady+state+and+nonsteady-state+glycerol+kinetics+in+humans+using+deuterium-labeled+tracer.">Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer.</a> J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).</li><li>Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometric+method+for+measuring+glycerol+levels+and+enrichments+in+plasma+using+13C+and+2H+stable+isotopic+tracers.">A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers.</a> Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).</li><li>Baskaran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1+activation+counters+diet-induced+obesity+through+sirtuin-1+activation+and+PRDM-16+deacetylation+in+brown+adipose+tissue.">TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue.</a> Int J Obes (Lond). , (2017).</li><li>Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+upregulation+of+CD24+in+pre-adipocytes+promotes+adipogenesis.">Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis.</a> Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).</li><li>Schweiger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+lipolysis.">Measurement of lipolysis.</a> Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).</li><li>Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipolysis+in+adipocytes.">Regulation of lipolysis in adipocytes.</a> Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).</li><li>Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skinny+on+fat:+lipolysis+and+fatty+acid+utilization+in+adipocytes.">The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes.</a> Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).</li><li>Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+triglyceride+metabolism.+IV.+Hormonal+regulation+of+lipolysis+in+adipose+tissue.">Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).</li><li>Jeppesen, J., Kiens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+limitations+to+fatty+acid+oxidation+during+exercise.">Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise.</a> J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).</li><li>Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+energy+metabolism+by+long-chain+fatty+acids.">Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids.</a> Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).</li><li>Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+free+fatty+acids+and+peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+in+the+control+of+myocardial+uncoupling+protein+levels.">Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels.</a> Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).</li><li>Barbera, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+activates+transcription+of+the+brown+fat+uncoupling+protein-1+gene.+A+link+between+regulation+of+the+thermogenic+and+lipid+oxidation+pathways+in+the+brown+fat+cell.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell.</a> J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).</li><li>Leung, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsaicin+as+an+anti-obesity+drug.">Capsaicin as an anti-obesity drug.</a> Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).</li><li>Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermogenic+ingredients+and+body+weight+regulation.">Thermogenic ingredients and body weight regulation.</a> Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).</li><li>Kang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+capsaicin+reduces+obesity-induced+insulin+resistance+and+hepatic+steatosis+in+obese+mice+fed+a+high-fat+diet.">Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).</li><li>Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+glycerol+uptake+to+plasma+glycerol+concentration+in+the+normal+dog.">Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog.</a> Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).</li><li>Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+microfluidic+enzyme+assays+for+simultaneous+detection+of+lipolysis+products+from+adipocytes.">Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes.</a> Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

תהליך התמוטטות של TGL לתוך גליצרול וחומצות שומן הוא מזרז על ידי ATGL 9 במהלך ליפוליזה בסיסית מתוזמר על ידי מערך של חלבונים כולל הפעלת adenylyl cyclase / PKA תלוי מסלול במהלך ליפוליזה מגורה 21 , 22 , 23 . שיפור הליפוליזה מג?...

רקמות שומן שומרות אנרגיה כמו שומן 2 וחומצת שומן חומצה נדרשת עבור thermogenesis 3 , 4 . חומצות שומן שמקורן בדיאטות הן ארוזות יחד עם אפופרוטאינים לתוך chylomicrons ונמסר לרקמות שונות בגוף באמצעות זרימת הדם. למרות שרוב התאים בגוף לאחסן עתודה של אנרגיה, רקמת שומן שומרת עודף אנרגיה כמו שומן 5 , 6 . ליפוליזה ברקמת השומן מוסדר על ידי תהליכים מורכבים הפרטים המולקולריים של ליפוליזה עדיין להישאר מעורפל 7 . ליפוליזה היא תהליך שבו טריגליצרידים (TGL) מאוחסנים ברקמת השומן הם הידרוליזה לייצר גליצרול וחומצות שומן (FA) על ידי אנזים טריפליצרידים ליפאז (ATGL) 8 . שינויים ב ליפוליזה בסיסית ומעוררת היא תכונה אופיינית להשמנה. בAsal lipolysis הוא מוסדר על ידי הפעלת ATGL 9 , אשר ממיר TGL כדי diacylglycerol (DAG), כי הוא hydrolyzed לאחר מכן כדי monoacyl גליצרול (MAG). הפעלה של ליפז רגיש להורמון (HSL) באמצעות cyclase adenylyl מפעיל מחזורית אדנוזין monophosphate (cAMP) חלבון תלוי קינאז A (PKA) גירוי גורם ליפוליזה. מדידה של ליפוליזה, בסיס ומעוררת, היא, אם כן, חשוב לנתח את הפעילות של חלבונים המעורבים בתהליך זה. כמו כן, unraveling את הרגולציה המולקולרית של lipolysis עשוי להיות מועיל לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות נגד השמנה 10 . מאז, מולקולות המעוררות lipolysis וחומצת שומן חומצה הם מועמדים פוטנציאליים עבור שומנים מופחת המאוחסן במחסנים, חשוב להעסיק assay חסון לשחזור. נתונים שפורסמו בעבר מציעים כי הפעלה של חלבון TRPV1 לידי ביטוי ברקמת השומן הלבנה על ידי CAP משופר הבסיסו FSK (adenylyl cyclase activator) limolysis- מגרה של רפידות שומן המפשעה 11 . מחקרים קודמים גם מציעים כי הפעלה ארוכת טווח של TRPV1 על ידי CAP מפעילה PKA 12 . מאחר והפעלת ה- PKA מגרה ליפוליזה 13 , 14 , מדידת ליפוליזה מגורמת בסיסית ו- PKA תלויות בשומנים שומניים המבודדים מבדיקות NCD או HFD (± CAP) בעכברים לאחר 32 שבועות של הזנת הדיאטות המתאימות יאמת את תפקיד TRPV1 הפעלה בליפוליזה. מאמר זה מתאר שיטה יעילה לקביעת ליפוליזה בסיסית ומעוררת. למרות שיטות אחרות המעסיקות איזוטופים רדיואקטיביים של גליצרול ומייגע ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית או כרומטוגרפיה גז / ספקטרומטריית מסה עבור מדידות 15 , 16 זמינים, שיטה זו מציעה יותר ישיר, פשוט וחסכוניטכניקה כדי לקבוע lipolysis ברקמות השומן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Capsaicin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">M2028</td>
			<td style="width:189px;">TRPV1 agonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forskolin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td>Adenylyl cyclase activator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:171px;">GE healthcare and life sciences, UT, USA</td>
			<td style="width:119px;">SH30081.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">High fat diet</td>
			<td style="width:171px;">Research diets, New Brunswick, USA</td>
			<td style="width:119px;">D12492</td>
			<td>Abbreviated as HFD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:171px;">Amresco, USA</td>
			<td style="width:119px;">O497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">D9163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Free Glycerol reagent</td>
			<td style="width:171px;">Sigma USA</td>
			<td style="width:119px;">F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">D8779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triacsin C</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">T4540</td>
			<td>Acyl CoA transferase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31998-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:171px;">Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">A412-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Amresco, USA</td>
			<td style="width:119px;">O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">L3371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bicinchoninic acid reagent</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">BCA1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td style="width:171px;">Pharmacia Biotech, NJ, USA</td>
			<td style="width:119px;">Ultrospec 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal chow diet</td>
			<td style="width:171px;">Labdiet.com</td>
			<td style="width:119px;">500I</td>
			<td>abreviated as NCD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:171px;">Jackson Laboratory, CT, USA</td>
			<td style="width:119px;">Stock number000664</td>
			<td>wild type mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:171px;">Heathrow Scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">HS 234526A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol standard</td>
			<td style="width:171px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">G7793</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads

Lipolysis הוא תהליך שבו שומנים שומנים כמו טריגליצרידים ברקמות השומן הם hydrolyzed לתוך גליצרול וחומצות שומן. מאמר זה מתאר את השיטה למדידת ליפוליזה מבושלת בסיסית ו- forskolin (FSK) בשומן השומן המבודד המבודד מעכברים מסוג בר, שאוכלו גם דיאטה רגילה של צ&#39;או (NCD), דיאטה עשירה בשומן (HFD) או דיאטה דלת שומן המכילה 0.01 % Capsaicin (CAP; קולטן חולף פוטנציאלי וניליל תת-קרקע 1 (TRPV1) אגוניסט) במשך 32 שבועות. השיטה המתוארת כאן לביצוע lipolysis vivo לשעבר מאומצת Schweiger et al. 1 אנו מציגים פרוטוקול מפורט למדידת רמות גליצרול על ידי UV-Visible (UV / VIS) spectrophotometry. השיטה המתוארת כאן ניתן להשתמש בהצלחה לבודד רפידות שומן השמנה עבור מדידות lipolysis להשיג תוצאות עקביות. פרוטוקול המתואר עבור רפידות שומן השד יכול בקלות להיות מורחבת למדוד ליפוליזה ברקמות אחרות.

כדי להעריך את ההשפעה של CAP על ליפוליזה בסיסית ומעוררת, מחקר זה נמדד lipolysis בשומנים שומן השומן המבודד מבודדים NCD או HFD (± CAP) - עכברים מסוג בר פראי. התוצאות המייצגות עבור הליפוליזה הבסיסית ו- FSK מגורה עבור כריתות השומן במעי הגס ניתנות בטבלה I. Basal ו F...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads at JoVE.com

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

פרוטוקול זה מתאר את השיטה של ​​קביעת lipolysis basal ו-forskolin מגורה ב pads שמנים השתן המתקבל דיאטה chow נורמלי (NCD) או דיאטה שומן גבוהה (HFD) ± capesicin מזין עכברים סוג בר. כמדד לליפוליזה, שחרור גליצרול נמדד מתוך רפידות שומן שומניות.

מדידה של ליפוליזה מגורה של Basal ו- Forskolin במרפאות שומן אדיפוז

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

measurement-basal-forskolin-stimulated-lipolysis-inguinal-adipose-fat

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Views.  University of Wyoming.  פרוטוקול זה מתאר את השיטה של ​​קביעת lipolysis basal ו-forskolin מגורה ב pads שמנים השתן המתקבל דיאטה chow נורמלי (NCD) או דיאטה שומן גבוהה (HFD) ± capesicin מזין עכברים סוג בר. כמדד לליפוליזה, שחרור גליצרול נמדד מתוך רפידות שומן שומניות. 

Video: Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for skin-care cosmetics. The goals of the protocol are: (1) to process chicken feathers into KH by alkaline-enzymatic hydrolysis and purify it by dialysis, and (2) to test if adding KH into an ointment base (OB) increases hydration of the skin and improves skin barrier function by diminishing transepidermal water loss (TEWL). During alkaline-enzymatic hydrolysis feathers are first incubated at a higher temperature in an alkaline environment and then, under mild conditions, hydrolyzed with proteolytic enzyme. The solution of KH is dialyzed, vacuum dried, and milled to a fine powder. Cosmetic formulations comprising from oil in water emulsion (O/W) containing 2, 4, and 6 weight% of KH (based on the weight of the OB) are prepared. Testing the moisturizing properties of KH is carried out on 10 men and 10 women at time intervals of 1, 2, 3, 4, 24, and 48 h. Tested formulations are spread at degreased volar forearm sites. The skin hydration of stratum corneum (SC) is assessed by measuring capacitance of the skin, which is one of the most world-wide used and simple methods. TEWL is based on measuring the quantity of water transported per a defined area and period of time from the skin. Both methods are fully non-invasive. KH makes for an excellent occlusive; depending on the addition of KH into OB, it brings about a 30% reduction in TEWL after application. KH also functions as a humectant, as it binds water from the lower layers of the epidermis to the SC; at the optimum KH addition in the OB, up to 19% rise in hydration in men and 22% rise in women occurs.

The goal of the protocol is to prepare keratin hydrolysate from chicken feathers by alkaline-enzymatic hydrolysis and to test whether adding keratin hydrolysate into a cosmetics ointment base improves skin barrier function (heightening hydration and diminishing transepidermal water loss). Tests are conducted on men and woman volunteers.

הכנת קרטין Hydrolysate של נוצות העוף ויישומו בתחום הקוסמטיקה

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

מדידה סימולטני של סופראוקסיד/מימן על-חמצני ו- NADH הייצור על ידי המכילות פלווין Dehydrogenases מיטוכונדריאלי

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and Western Blot, since it mostly contains lipids. RNA isolation from adipose tissue samples is also challenging as extra steps are required to avoid these lipids. Here, we present a procedure to collect three anatomically different white adipose tissues from mice, to process these samples and perform RNA isolation. We further describe the synthesis of cDNA and gene expression experiments using real-time PCR. The hereby described protocol allows the reduction of contamination from the animal's hair and blood on fat pads as well as cross-contamination between different fat pads during tissue collection. It has also been optimized to ensure adequate quantity and quality of the RNA extracted. This protocol can be widely applied to any mouse model where adipose tissue samples are required for routine experiments such as real-time PCR but is not intended for isolation from primary adipocytes cell culture.

The purpose of this paper is to present a step-by-step procedure to collect different white adipose tissues from mice, process the fat samples and extract RNA.

העכבר רקמת שומן איסוף ועיבוד לניתוח RNA

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite this similarity, these bacteria show extreme variations in characteristics like growth behavior, intensity of light emission or regulation of bioluminescence. The method presented here is a newly developed assay that combines recording of cell growth and bioluminescent light emission intensity over time utilizing a plate reader. The resulting growth and light emission characteristics can be linked to important features of the respective bacterial strain, such as quorum sensing regulation. The cultivation of a range of bioluminescent bacteria requires a specific medium (e.g., artificial sea water medium) and defined temperatures. The easy to handle, non-bioluminescent standard-research bacterium Escherichia coli (E. coli), on the other hand, can be cultivated inexpensively in high quantities in laboratory scale. Exploiting E. coli by introducing a plasmid containing the whole lux operon can simplify experimental conditions and additionally opens up many possibilities for future applications. The expression of all lux genes utilizing an E. coli expression strain was achieved by construction of an expression plasmid via Gibson cloning and insertion of four fragments containing seven lux genes and three rib genes of the lux-rib operon into a pET28a vector. E. coli based lux gene expression can be induced and controlled via Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG) addition resulting in bioluminescent E. coli cells. The advantages of this system are to avoid quorum sensing regulation restrictions and complex medium compositions along with non-standard growth conditions, such as defined temperatures. This system enables analysis of lux genes and their interplay, by the exclusion of the respective gene from the lux operon, or even addition of novel genes, exchanging the luxAB genes from one bacterial strain by another, or analyzing protein complexes, such as luxCDE.

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent bacteria regulate light production through a variety of mechanisms, such as quorum sensing. This novel method allows the in situ investigation of bioluminescence and the correlation of light emission to cell density. An artificial bioluminescent Escherichia coli system allows the characterization of lux operons, Lux proteins, and their interplay.

בחיי עיר ובחינת המתאם של צפיפות התאים ואת פליטת אור של חיידקים זוהרים

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial species, the koala (Phascolarctos cinereus), faces prolonged exposure to anthropogenic-induced stressors and assessment of chronic stress in wild populations is urgently warranted. One of the most effective ways to measure chronic stress is through analyzing the glucocorticoid hormone cortisol in hair or fur, as it supports physiological and behavioral responses. This laboratory validation study aims to test current techniques to validate an optimal hormone extraction method to be used as a non-invasive measure of cortisol in koala fur. It is recognized that using non-invasive techniques to measure stress hormones is preferred over traditional, invasive techniques due to their ideal practical and ethical standpoints. Additionally, it is comparatively easier to acquire fur from koalas than it is to acquire samples of their blood. This study used samples of koala fur acquired from the Adelaide Koala and Wildlife Hospital to run a number of hormone extraction techniques in an attempt to validate an optimal cortisol extraction method. Results showed that 100% methanol provided the most optimal solvent extraction compared to 100% ethanol or 100% isopropanol based on parallelism results. In conclusion, this method of cortisol extraction from koala fur provided a reliable non-invasive assay that could be used to study chronic stress in koalas.

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

We present a protocol to determine the optimal extraction solvent to measure cortisol from koala fur. The solvents used in this protocol are methanol, ethanol and isopropanol. Determining an optimal extraction solvent will aid in reliably measuring fur to determine the impact of chronic stress on koalas.

הקורטיזול מדידה קואלה (פאיסקולארקטוס cinereus) פרווה

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the interpretation of the biological activity of any compound in drug development or in basic research projects. In epigenetics, target engagement is most often assessed by the analysis of proxy markers instead of measuring the union of the compound to the target. Downstream biological readouts that have been analyzed include the histone mark modulation or gene expression changes. KDM1A is a lysine demethylase that removes methyl groups from mono- and dimethylated H3K4, a modification associated with the silencing of gene expression. Modulation of the proxy markers is dependent on the cell type and function of the genetic make-up of the cells investigated, which can make interpretation and cross-case comparison quite difficult. To circumvent these problems, a versatile protocol is presented to assess the dose effects and dynamics of the direct KDM1A target engagement. The assay described makes use of a KDM1A chemoprobe to capture and quantify uninhibited enzyme, can be broadly applied to cells or tissue samples without the need for genetic modification, has an excellent window of detection, and can be used both for basic research and analysis of clinical samples.

Here, we present a protocol to measure KDM1A target engagement in a human or animal cell, tissue or blood samples treated with KDM1A inhibitors. The protocol employs chemoprobe tagging of the free KDM1A enzyme and direct quantification of the target occupation using chemoprobe-based immunoassays and can be used in preclinical and clinical studies.

מדידה ישירה של התחייבות KDM1A יעד באמצעות החיסונית מבוססי כימוציל

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective denaturation of proteins from RNA, 3) ribonuclease inactivation, and 4) removal of contamination from DNA, proteins, and carbohydrates. However, it is very laborious to maintain the integrity of RNA when there are high levels of RNase in the tissue. Spontaneous autolysis makes it very difficult to extract RNA from pancreatic tissue without damaging it. Thus, a practical RNA extraction method is needed to maintain the integrity of pancreatic tissues during the extraction process. An experimental and comparative study of existing protocols was carried out by obtaining 20-30 mg of rat pancreatic tissues in less than 2 minutes and extracting the RNA. The results were assessed by electrophoresis. The experiments were carried out three times for generalization of the results. Immersing pancreatic tissue in RNA stabilization reagent at -80 &#176;C for 24 h yielded high integrity RNA, when the RNA extraction reagent was used as the reagent. The results obtained were comparable to the results obtained from commercial kits with spin column bindings.

The purity and integrity of the isolated RNA is a vital step in RNA dependent assays. Here, we present a practical, rapid, and inexpensive method to extract RNA from a small quantity of undamaged pancreatic tissue.

מיצוי RNA מהיר וחסכוני של רקמת הלבלב חולדה

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...