אנו מודים ל' ד נגוין להגהת כתב היד ועל דיונים פוריים. יתר על כן, אנו מודים Dernedde ג' וה' ג' נגוין שעזרת לנו להכין את. הצילומים. רוב סצנות של הווידאו נורו במעבדות ר טאובר. אנו מודים גם מכון מקס פלנק קולואידים ואמולסיות, ממשקים, ואשר נתן לנו גישה חופשית למתקן ספקטרומטר מסה שלהם. RH נתמכה על ידי DFG (ProMoAge).

המחברים אין לחשוף.

אם נגזרות מסונתז כימית ManNAc, ManNProp ו- ManNBut הם ניתחו באמצעות ספקטרומטר מסה, צריך להיות מזוהה רק הפסגה המוני הנכון עבור שתי דגימות. לכן, ניתן להניח את המוצרים יש טוהר של מעל 99%. כמויות קטנות של Neu5Gc, אשר בדרך כלל לא נמצא תאים אנושיים29, מזוהים בחלקים הממברנה של התאים lysed. זה קרוב לוודאי מ?...

חומצה sialic היא חד-סוכר כי בדרך כלל ניתן למצוא בתחנת טרמיני ללא הפחתת של glycoconjugates, כגון N-, O- glycans או glycolipids. בין כל monosaccharides, חומצה sialic יש כמה מאפיינים כימיים ייחודיים. יש שדרה 9 C-אטום, קבוצה קרבוקסילית במיקום C-1, deprotonated, טעונים שלילית ובכך תחת התנאים הפיזיולוגיים, ותפקוד אמינו במצב C-5. למרות מעל 50 באופן טבעי וריאציות של חומצה sialic מאפינים תאריך1, הצורה הדומיננטית של חומצה sialic נמצאו אצל בני אדם הוא N- acetylneuraminic חומצה (Neu5Ac). יונקים אחרים מבטאים גם את כמויות גבוהות יותר של N- glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc)2,3.
בשל מעמדה חשוף glycoconjugates, חומצה sialic מעורב שפע של אינטראקציות קולטן-ליגנד, למשל, הכריכה תלויים hemagglutinin של נגיף שפעת מארח תאים4. Epitope sialic חומצה עם תפקודים ביולוגיים חשובים, במיוחד במהלך מופרה, במערכת העצבים, היא חומצה polysialic. חומצה Polysialic הוא פולימר של עד 200 חומצות sialic אלפא מקושרים-2,8. החלבון העיקרי המוביל של חומצה polysialic היא מולקולת אדהזיה תא עצבי (NCAM). הביטוי חומצה Polysialic שמחליש את המאפיין דבק של NCAM בכך ביטוי חומצה polysialic מקטין את הידבקות ומגביר את הפלסטיות עם מערכת העצבים5.
שינויים בביטוי של חומצה sialic (פולי) בסופו של דבר משפיעים שפע של אינטראקציות ביולוגיים שונים. זה יכול לשמש כדי לחקור תהליכים התלויים חומצה sialic ידועים ברמה המולקולרית, לחשוף את הרומן glycoconjugate אינטראקציות, או לחקור גישות טיפוליות אפשריות. ישנן שיטות שונות זמינים שלפיו הביטוי של חומצה sialic על פני התא יכול להיות מאופנן, למשל טיפול עם חומצה sialic glycosidases ספציפיים (sialidases), עיכוב של אנזימים המעורבים ביוסינטזה חומצה sialic6 7, ,8, או הורסים או שינוי הביטוי של האנזים מפתח של חומצה sialic ביוסינטזה9.
שיטה נוספת תכליתי כדי לווסת את הביטוי חומצה sialic היא MGE (הנדסה מטבולית הידוע גם פחמימה # מיון הפחמימות, מו). במסמך זה, תאים, רקמות או אפילו חיות מטופלים עם נגזרות הלא טבעי של ManNAc אשר C2-אמינו שינויים. להיות קודמן מולקולות של חומצה sialic, לאחר ספיגת תאית, תחליפי ManNAc אלה הן חומצות חד כיווני sialic אל הלא טבעי מטבוליזם, יכול לבוא לידי ביטוי sialylated glycoconjugates. תאים שטופלו ManNAc נגזרים נושאת אליפטיות C2-שינויים, כגון ManNProp או ManNBut, לשלב N- propionylneuraminic חומצה (Neu5Prop) או חומצה - butanoylneuraminic N(Neu5But) שלהם glycoconjugates10 , 11. באמצעות קבוצות פונקציונליות הציג C2-העמדה של ManNAc, חומצות sialic המתרחשים את הלא טבעי יכול להיות יחד, למשל, דרך מצדו Staudinger או את cycloaddition alkine של אזיד, עם צבעי פלורסנט, ולכן דמיינו על פני שטח התא12.
הביטוי של חומצות אלה sialic הלא טבעי יש השפעות מסקרן על תהליכים ביולוגיים רבים, כולל זיהומים הפתוגן, אדהזיה נדידה של תאים סרטניים, אדהזיה תא הכללית, כמו גם vascularization, בידול (לסקירה ראה:. Wratil et al. 13). מעניין, MGE עם N-acyl השומן שונה mannosamines יכול לשמש גם כדי להפריע הביטוי של חומצה polysialic. חומצה Polysialic נוצר על ידי שני polysialyltransferases שונים (ST8SiaII, ST8SiaIV). זה הוכח, כי polysialyltransferase ST8SiaII מעוכבת על ידי סימנים מקדימים חומצה sialic לא טבעי, כגון ManNProp או ManNBut14,15. בנוסף, זה הוכח בתאים אנושיים נוירובלסטומה ManNProp או ManNBut יישום גם מפחית sialylation הכולל15.
MGE עם N-acyl השומן שונה mannosamines הוא קל ליישם את השיטה כבר בהצלחה בשימוש, לא רק מידע יונקים והתרבות תאי חיידקים אלא גם אצל בעלי חיים שלם של מינים שונים, כגון Caenorhabditis elegans16, דג זברה17, או עכברים18,19,20,21. במיוחד ManNAc נגזרים הנושאת שינויים אליפטיות, כולל ManNProp ו- ManNBut, הם החזרה ציטוטוקסיות, אפילו בריכוזים millimolar תא תרבות בינוני או פלזמה. יתר על כן, הם יחסית קל לסנתז.
כאן, אנו מספקים פרטים על אופן השימוש MGE עם N-acetyl שונה mannosamines. קודם כל, הסינתזה של שני נגזרות ManNAc הנפוצה ביותר בתחום זה, ManNProp, ManNBut, הוא הסביר. בשלב הבא, אנו מראים כיצד ניתן ליישם MGE ניסוי ויוו . כדוגמה, שורת התאים נוירובלסטומה קלי נבחר כדי להדגים ירידה בביטוי של epitope polysialic על ידי המערבי כתם לאחר הטיפול עם נגזרות ManNAc. חומצות sialic את הלא טבעי על פני התא לכמת על ידי HPLC, בהמשך נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92110411</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>75 ml tissue culture flasks</td><td>Greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>X986.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Serva</td><td>37190.03</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td><td>VWR</td><td>SDS Gel/Blot</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Roth</td><td>3019.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein ladder</td><td>Fisher Scientific</td><td>267620</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau red</td><td>Roth</td><td>5938.2</td><td></td></tr><tr><td>Milk powder</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBLUF 0500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4784-50MG</td><td></td></tr><tr><td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS3548-100EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-10MG</td><td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td></tr><tr><td>Butyryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109614-250G</td><td></td></tr><tr><td>C18 RP column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4435-E0</td><td>110 &amp;Aring;, 3 &amp;micro;m particle size, 4.6 x 150 mm</td></tr><tr><td>D-Mannosamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4670-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56302-50ML-GL</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>36.5-38.0%, in water</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl-Roth</td><td>T169.2</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>N-Acetyl-D-mannosamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8176-250MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0812-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Glycolylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9793-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Propionyl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P51559-500G</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td><td>Eppendorf</td><td>30120191</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bisulfite solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13438-1L-R-D</td><td>40%, in water</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319511-500ML</td><td>1.0 M, in water</td></tr><tr><td>Sodium methoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164992-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-100ML-D</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-019100</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Carl-Roth</td><td>T905.1</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Silica Gel 60</td><td>Carl-Roth</td><td>9779.1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSD-System</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

חומצה sialic (Sia) הוא נתין מאוד חשוב glycoconjugates, כגון N-, O- glycans או glycolipids. בשל מיקומו בתחנת טרמיני ללא צמצום של oligo - סוכרים, וכן כימי מאפייניו הייחודיים, חומצה sialic מעורב שפע של קולטן שונים-ליגנד אינטראקציות. על-ידי שינוי הביטוי של חומצה sialic על פני התא, כתוצאה מכך מימוש אינטראקציות תלויי-חומצה sialic. זה יכול להיות מועיל לחקור אינטראקציות תלויי-חומצה sialic, יש פוטנציאל להשפיע על מחלות מסוימות בצורה מועילה. Via glycoengineering מטבולית (MGE), הביטוי של חומצה sialic על פני התא יכול להיות מאופנן. במסמך זה, תאים, רקמות או אפילו כל בעלי החיים מטופלים עם C2-השתנה נגזרות של N- acetylmannosamine (ManNAc). אלה סוכרים אמינו לשמש sialic חומצה קודמן מולקולות, ולכן מטבוליזם המינים חומצה sialic המתאימים, הביע על glycoconjugates. יישום שיטה זו יוצרת אפקטים מסקרן על תהליכים ביולוגיים שונים. לדוגמה, הוא יכול להפחית באופן דרסטי את הביטוי של חומצה polysialic (polySia) התייחס תאים עצביים, ובכך משפיע על גדילה עצביים ובידול. . הנה, אנחנו מראים את הסינתזה של שני נגזרות - acylmannosamine הנפוץ ביותר C2-השתנה N, N- propionylmannosamine (ManNProp) כמו גם N- butanoylmannosamine (ManNBut), בהמשך להראות כיצד אלה הלא טבעי ניתן להחיל אמינו סוכרים בניסויים התרבות תאים. הביטוי של חומצה sialic ששונה מינים לכמת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC), בהמשך נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה. ההשפעות על הביטוי חומצה polysialic הם הובהר באמצעות תספיג באמצעות נוגדן חומצה polysialic זמינים מסחרית.

Chromatograms HPLC של פלורסנט תווית Neu5Ac ואת הסטנדרטים Neu5Gc מתוארת באיור2. באמצעות השיטה המתוארת במסמך זה, התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות Neu5Gc בדרך כלל elutes בין 7-9 דקות • תנאי הזמן, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Ac בין 10-12 דקות. מספר פסגות ההרים קטנים יותר chromatogram מופיעים ...

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

חומצה sialic היא אופיינית חד-סוכר-יחידה נמצאו ב- glycoconjugates. זה מעורב שפע של אינטראקציות מולקולרית, תאית. כאן אנו מציגים שיטה כדי לשנות את תא השטח חומצה sialic הביטוי תוך שימוש glycoengineering מטבולית עם N- acetylmannosamine נגזרים.

Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות N-acyl השומן-שונה Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

metabolic-glycoengineering-sialic-acid-using-n-acyl-modified

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

12.6K Views.  LMU München. חומצה sialic היא אופיינית חד-סוכר-יחידה נמצאו ב- glycoconjugates. זה מעורב שפע של אינטראקציות מולקולרית, תאית. כאן אנו מציגים שיטה כדי לשנות את תא השטח חומצה sialic הביטוי תוך שימוש glycoengineering מטבולית עם N- acetylmannosamine נגזרים.

Video: Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) expression. These are acidic sugars that have a 9-carbon backbone and that cap vertebrate glycans on cell surfaces. Two of the major Sia forms in mammals are N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) and its hydroxylated form, N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc). Humans cannot produce endogenous Neu5Gc due to the inactivation of the gene encoding cytidine 5&#39;monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Foreign Neu5Gc is acquired by human cells through the dietary consumption of red meat and dairy and subsequently appears on diverse glycans on the cell surface, accumulating mostly on carcinomas. Consequently, humans have circulating anti-Neu5Gc antibodies that play diverse roles in cancer and other chronic inflammation-mediated diseases and that are becoming potential diagnostic and therapeutic targets. Here, we describe a high-throughput sialoglycan microarray assay to assess such anti-Neu5Gc antibodies in the human sera. Neu5Gc-containing glycans and their matched pairs of controls (Neu5Ac-containing glycans), each with a core primary amine, are covalently linked to epoxy-coated glass slides. We exemplify the printing of 56 slides in a 16-well format using a specific nano-printer capable of generating up to 896 arrays per print. Each slide can be used to screen 16 different human sera samples for the evaluation of anti-Neu5Gc antibody specificity, intensity, and diversity. The protocol describes the complexity of this robust tool and provides a basic guideline for those aiming to investigate the response to Neu5Gc dietary carbohydrate antigen in diverse clinical samples in an array format.

A sialoglycan microarray assay can be used to evaluate anti-Neu5Gc antibodies in human sera, making it a potential high-throughput diagnostic assay for cancer and other chronic inflammation-mediated human diseases.

פרופילינג נגד Neu5Gc IgG ב Sera האדם עם Assay Microarray Sialoglycan

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

Behavior

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Chemistry

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having multifarious bioactivities. Although chemical O-glycosylation is a commonly beneficial strategy to synthesize disaccharide nucleosides, the preparation of substrates such as glycosyl donors and acceptors requires&#160;tedious protecting&#160;group manipulations and a purification at each synthetic step. Meanwhile, several research groups have reported that boronic and borinic esters serve as a protecting or activating group of carbohydrate derivatives to achieve the regio- and/or stereoselective acylation, alkylation, silylation, and glycosylation. In this article, we demonstrate the procedure for the regioselective O-glycosylation of unprotected ribonucleosides utilizing boronic acid. The esterification of 2&#39;,3&#39;-diol of ribonucleosides with boronic acid makes the temporary protection of diol, and, following O-glycosylation with a glycosyl donor in the presence of p-toluenesulfenyl chloride and silver triflate, permits the regioselective reaction of the 5&#39;-hydroxyl group to afford the disaccharide nucleosides. This method could be applied to various nucleosides, such as guanosine, adenosine, cytidine, uridine, 5-metyluridine, and 5-fluorouridine. This article and the accompanying video represent&#160;useful (visual) information for the O-glycosylation of unprotected nucleosides and their analogs for the synthesis of not only disaccharide nucleosides, but also a variety of biologically relevant derivatives.

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Here, we present protocols for the synthesis of disaccharide nucleosides by the regioselective O-glycosylation of ribonucleosides via a temporary protection of their 2&#39;,3&#39;-diol moieties utilizing a cyclic boronic ester. This method applies to several unprotected nucleosides such as adenosine, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine, and 5-fluorouridine to give corresponding disaccharide nucleosides.

Regioselective O- גליקוזילציה של נוקלאוזידים via זמני 2', 3'-Diol הגנה על ידי אסתר Boronic לסינתזה של דו-סוכר נוקלאוזידים

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

<meta charset="utf8"></head><body>אסטרטגיית גליקומיקס לא ספציפית מבוססת פרוטאוליזה עבור גליקופרוטאינים חיידקיים

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

אסטרטגיית גליקומיקס לא ספציפית מבוססת פרוטאוליזה עבור גליקופרוטאינים חיידקיים

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

Biochemistry

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Immunology and Infection

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. However, monoclonal antibody functionality and half-life may be reduced by the type and distribution of host-specific glycosylation. Attempts to produce superior antibodies have inspired the development of genetically modified producer cells that synthesize glyco-optimized antibodies. Glycoengineering typically requires the generation of a stable knockout or knockin cell line using methods such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9. Monoclonal antibodies produced by engineered cells are then characterized using mass spectrometric methods to determine if the desired glycoprofile has been obtained. This strategy is time-consuming, technically challenging, and requires specialists. Therefore, an alternative strategy that utilizes streamlined protocols for genetic glycoengineering and glycan detection may assist endeavors toward optimal antibodies. In this proof-of-concept study, an IgG-producing Chinese hamster ovary cell served as an ideal host to optimize glycoengineering. Short interfering RNA targeting the Fut8 gene was delivered to Chinese hamster ovary cells, and the resulting changes in FUT8 protein expression were quantified. The results indicate that knockdown by this method was efficient, leading to a ~60% reduction in FUT8. Complementary analysis of the antibody glycoprofile was performed using a rapid yet highly sensitive technique: capillary gel electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. All knockdown experiments showed an increase in afucosylated glycans; however, the greatest shift achieved in this study was ~20%. This protocol simplifies glycoengineering efforts by harnessing in silico design tools, commercially synthesized gene targeting reagents, and rapid quantification assays that do not require extensive prior experience. As such, the time efficiencies offered by this protocol may assist investigations into new gene targets.

The glycosylation pattern of an antibody determines its clinical performance, thus industrial and academic efforts to control glycosylation persist. Since typical glycoengineering campaigns are time- and labor-intensive, the generation of a rapid protocol to characterize the impact of glycosylation genes using transient silencing would prove useful.

גליקו-הנדסה מהירה של נוגדנים בתאי שחלת אוגר סיניים

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

De-Sialylated Monocyte-Derived-DCs מ-PBMCs מבודדים באמצעות טיפול Sialidase

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical characteristics, they are involved in numerous biological processes, such as modulation of the immune response, recognition of self and non-self antigens, carbohydrate-protein interactions, etc. The cellular content of sialic acid is regulated by sialidase, which catalyzes the removal of sialic acid residues. Several studies have shown that sialo-glycans are critical in monitoring immune surveillance by engaging with cis and trans inhibitory Siglec receptors on immune cells. Likewise, glyco-immune checkpoints in cancer are becoming crucial targets for developing immunotherapies. Additionally, dendritic cells (DCs) are envisioned as an important component in immunotherapies, especially in cancer research, due to their unique role as professional antigen-presenting cells (APC) and their capacity to trigger adaptive immune responses and generate immunologic memory. Nevertheless, the function of DCs is dependent on their full maturation. Immature DCs have an opposing function to mature DCs and a high sialic acid content, which further dampens their maturation level. This downregulates the ability of immature DCs to activate T-cells, leading to a compromised immune response. Consequently, removing sialic acid from the cell surface of human DCs induces their maturation, thus increasing the expression of MHC molecules and antigen presentation. In addition, it can restore the expression of co-stimulatory molecules and IL-12, resulting in DCs having a higher ability to polarize T-cells toward a Th1 phenotype and specifically activate cytotoxic T-cells to kill tumor cells. Therefore, sialic acid has emerged as a key modulator of DCs and is being used as a novel target to advance their therapeutic use. This study provides a unique approach to treat in vitro monocyte-derived DCs with sialidase, aimed at generating DC populations with different cell surface sialic acid phenotypes and tailored maturation and co-stimulatory profiles.

מחבר זרקור: הבשלת תאים דנדריטיים באמצעות טיפול אנזימטי מבוסס סיאלידסות על פני התא 

A unique, comprehensive protocol to generate de-sialylated human monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a sialidase treatment is presented. Further, methods to assess the phenotypic and functional characterization of mo-DCs and evaluate how sialidase treatment improves the maturation level of mo-DCs are described.

יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים עם פנוטיפים סיליליים שונים

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...

Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות N-acyl השומן-שונה Mannosamines

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST