原稿の校正と有意義な議論の l. d. グエンに感謝しますさらに、j. Dernedde、h. g. グエンは、ビデオ撮影を準備して私たちを助けるを感謝いたします。ビデオのほとんどのシーンは、r ・ タウバーの所で撮影されました。また、マックス ・ プランク コロイドおよびインターフェイスとの質量分析法の施設への無料アクセスをくださったことを感謝いたします。RH は、DFG (ProMoAge) によって支えられました。

1. バッファーおよび試薬の調製
<ol><li>
3 mM ナトリウムメトキシド溶液の調製
	<ol>
<li>攪拌棒 100 mL 瓶 50 mL のメタノール (3 mM) で 8.1 mg ナトリウムメトキシドを溶かしてください。数週間室温 (RT) で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
トリス塩酸バッファーの準備
	<ol>
<li>攪拌棒と 8.766 g 塩化ナトリウム, 157 mg トリス-HCl, 146 mg 100 mL ガラス瓶の中の EDTA を組み合わせるし、80 mL の水に溶かします。</li>
		<li>PH メーターで pH を観察しながら攪拌溶液中に水酸化ナトリウム (水 1 M) または HCl (水の場合は 20%) を追加し、8.0 pH を調整します。</li>
		<li>100 mL の最終的なボリュームを達成するために必要な水の量を追加します。0.22 μ m の滅菌フィルター システムを使用して、ソリューションをフィルター処理します。 注: 150 mM の NaCl、トリス-HCl、10 mM と 5 mM EDTA (pH 8.0) 100 mL トリス塩酸バッファーが含まれます。ソリューションは、数週間の 4 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アプロチニン溶液の調製
	<ol>
<li>水 (1.54 mM) 1 mL 中 10 mg アプロチニンを溶解します。因数 1.5 mL プラスチック チューブ (各 100 μ L) x 10 にアプロチニン ソリューション。数週間-20 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leupeptin 溶液の調製
	<ol>
<li>水 2 mL (10 mM) で 10 mg leupeptin を溶解します。因数 leupeptin ソリューション 1.5 mL プラスチック チューブ × 10。数週間-20 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
特異 (PMSF) フッ化物溶液の調製
	<ol>
<li>34.8 mg PMSF 2 mL エタノール (100 mM) を解散します。因数 1.5 mL プラスチック チューブ × 10 で PMSF ソリューション。数週間-20 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1, 2-ジアミノ-4, 5-methyldioxybenzol-塩酸 (DMB) 溶液の調製
	<ol>
<li>15.62 mg DMB、352 μ L β-メルカプトエタノール、および 48 μ L ナトリウム重亜硫酸塩溶液 (39%)、結合し、9.6 mL 水 (DMB 6.9 mM、500 mM β-メルカプトエタノール、0.19% ナトリウム重亜硫酸塩) を追加します。因数 1.5 mL プラスチック チューブ (各 250 μ L) x 40 で DMB ソリューション。数週間の-20 ° C で光から保護されたストア。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 M トリフルオロ酢酸 (TFA) 酸溶液の調製
	<ol>
<li>100% の 770.3 μ L を追加 9.23 mL 水 15 mL プラスチック チューブ (1 M) に TFA。数週間の 4 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
120 mM TFA 溶液の調製
	<ol>
<li>9.91 mL 水 (120 mM) 15 mL プラスチック チューブに 92.4 μ TFA (100%) を追加します。数週間の 4 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
400 mM 水酸化ナトリウム (NaOH) 溶液の調製
	<ol>
<li>160 mg 15 mL プラスチック チューブに 10 mL 水 (400 mM) で水酸化ナトリウムを溶解します。数週間の 4 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
西部のしみの換散バッファーの準備
	<ol>
<li>5.84 g, 塩化ナトリウム 0.1 g のトリス (ヒドロキシメチル) を溶解-aminomethan (Tris)、0.1 g CaCl2、0.95 g MgCl2、および 100 mL で 1 g トリトン X100 水し、7.8 に pH を合わせなさい。4 ° C でのストア換散バッファーを使用する前に各プロテアーゼ ・ インヒビター (アプロチニン、leupeptin、PMSF) の 100 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ナトリウム dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) バッファーの準備
	<ol>
<li>0.3 g のトリス、1.5 g のグリシン、0.1 g 水 100 mL に SDS を溶かし、7.3 に pH を調整します。室温ストア</li>
	</ol>
</li>
	<li>
西部のしみのバッファーの準備
	<ol>
<li>0.3 g のトリス、1.1 g グリシン 90 mL の水で溶解し、10 mL のエタノールを追加します。室温ストア</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ソリューションをブロックの準備
	<ol>
<li>25 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の無脂肪牛乳パワーの 1 g を溶解します。常に新鮮な準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ManNProp と関連Nの合成-アシル-Mannosamines を変更
<ol><li>431.2 mg マンノサミン塩酸 10 mL 3 mM ナトリウムメトキシド溶液攪拌棒の 50 mL のガラス瓶の中で溶解します。</li>
	<li>0 ° C の氷の混合物を冷却します。攪拌溶液中に徐々 に滴下 210 μ L プロピオニル塩化 (2.4 mmol)、または ManNProp または ManNBut、それぞれ合成する 248 μ L butanoyl 塩化 (2.4 mmol) を追加します。4 h の 0 の ° C で攪拌混合を孵化させなさい。</li>
	<li>50 mL プラスチック チューブにソリューションを転送します。細い針とプラスチック製のチューブのふたに 4-8 穴を突きます。液体窒素を使用して、ソリューションを急速に凍結し、その後 (凍結乾燥) を凍結乾燥 48 時間またはそれが完全に乾燥しているまで。</li>
	<li>ミックス 350 g シリカゲル 60 750 mL エチル酢酸/メタノール/水 (15:2:1) (これは懸濁液)。シリカゲル 60 サスペンションからす柱 (直径 35 mm、長さ 70 cm) を記入し、使用する前に準備ができて、追加の 100 mL のエチル酢酸/メタノール/水 (15:2:1) を洗い流します。</li>
	<li>ステップ 2.3 から乾燥製品を溶解 (5 g の乾燥品) 10 mL のエチル ・酢酸/メタノール/水 (15:2:1) と負荷、シリカにピペットを使用してゲルの列。(ManNProp) のため、500 mL の後に 4 mL の一部分を収集します。注: ManNBut は、700 mL の後でおよそ列から溶出されます。</li>
	<li>15 mL プラスチック チューブに溶出画分を転送します。細い針とプラスチック製のチューブのふたに 3-6 穴を突きます。急速凍結する液体窒素を使用して、ソリューションおよびその後、それが完全に乾燥するまでそれを凍結乾燥します。 注意: 凍結乾燥製品が数ヶ月室温保存できます。</li>
	<li>質量分析法 (セクション 9 を参照) による製品の純度を確認してください。 注: また、純度も確認できます1H 核磁気共鳴 (NMR)。</li>
</ol>3. 細胞培養
<ol><li>ケリー神経芽細胞腫細胞 10% 牛胎児血清、100 U ペニシリン、ストレプトマイシン 100 mg、2 mM L-グルタミン含む 5 mM ManNAc、ManNProp、5 mM または 5 mM ManNBut、37 ° C、5% CO2培ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI)。 注: ManNAc やその類縁体のない培地で培養された細胞は、コントロールとして使用されます。</li>
	<li>
Mannosamines のアプリケーションの前にそれらをトリプシン/EDTA (0.25%、0.02%、PBS) で 10 分間インキュベートしケリー神経芽細胞腫細胞をデタッチしてノイバウアー商工会議所またはセルのカウンターを使用してカウントします。プレート/皿のサイズに基づいて定義された数字で細胞を播きます。
	<ol>
<li>シアル酸糖を測定するには、48 ウェル培養プレートに 500 μ L 中 1 x 10 の5セルをシードします。ポリシアル酸の分析、6 cm 径細胞培養ディッシュ上に 3 mL の培地で 1 x 10 の6セルをシードします。37 ° C と 5% CO2で孵化させなさい。メディアのすべての 24 h を交換してください。 メモ: MGE の効果は治療の合計時間を増加します。高い代謝効率の 5-7 日のセルを扱います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
治療後、培地をデカントします。PBS でプレート/皿を洗います。それらをトリプシン/EDTA (0.25%、0.02%、PBS) で 10 分間インキュベートし、細胞をデタッチします。剥離細胞を細胞培養液の同じボリュームの追加によってトリプシンを中和します。15 mL プラスチック チューブに剥離細胞を転送します。500 x g で 3 分のサンプルを遠心し、上澄みを廃棄します。
	<ol>
<li>5 mL の PBS と遠心載荷セル (ステップ 3.3 を参照) を追加します。さらに 2 回洗濯の手順を繰り返します。 注: 清せず洗浄細胞ペレットは-20 ° C で数日間保存できます。ポリシアル酸の発現を解明する場合は 10 に進みます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 高速液体クロマトグラフィー分析のためのセル換散
<ol><li>
高速液体クロマトグラフィーの換散バッファーの準備
	<ol>
<li>5 mL トリス塩酸バッファー、5 μ L アプロチニン ソリューション、20 μ L leupeptin ソリューション、および 50 μ L PMSF ソリューションを組み合わせます。 注: 5 mL の HPLC の換散バッファーは 150 mM の NaCl、10 mM 5 mM EDTA、トリス-HCl 1.54 μ M アプロチニン、40 μ M、Leupeptin、1 mm PMSF (pH 8.0)。セル換散の前に新鮮なこのバッファーを準備する必要があります常に。</li>
	</ol>
</li>
	<li>再 500 μ L 冷たい HPLC 換散バッファーに収集した細胞ペレット (ステップ 3.3) 各を中断し、超-超音波サンプル超音波プロセッサ針で 3 倍の 30 の期間中-高振幅で s。サイクルの間に、少なくとも 1 分の氷のサンプルを冷却します。</li>
</ol>5. 膜分画の分離
<ol><li>遠心分離機の分離細胞サンプル 20,000 × g と 4 ° C で 2 時間1.5 mL プラスチック チューブでのゾル性細胞質蛋白質を表す上清 (約 480 μ L) で区切ります。これらの画分は、例えばブラッドフォードまたはビシンコニン酸 (BCA) 試金を使用してのタンパク質濃度を決定します。 注: 細胞質画分のタンパク質濃度 (約 1 mg/mL) は、尊敬されるシアル酸種の測定量を後関連することができます。ペレットは、6.1 のステップで使用される膜画分を表します。</li>
</ol>6. 酸性加水分解
注: オリゴ ・細胞膜多糖類は単糖類に加水分解します。さらに、可能な限りO-同様な糖に変更が加水分解します。膜画分におけるシアル酸の圧倒的多数は複合糖質に組み込まれている自然とOを負担する可能性があるかもしれないので、これは定量的な HPLC 分析に必要な-アセチルまたはO- lactolyl 変更。
<ol><li>150 μ L 1 M 追加分離膜の一部分 (セクション 5 からペレット) に TFA 溶液。200-600 rpm で振とうしながら 80 ° C で 4 時間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>20,000 x g および上部の段階の容積はより小さい 20 μ L まで 3 kDa 除外膜 0.5 mL フィルター チューブを使用して 21 ° C で約 30 分のサンプルを遠心します。 注: この手順は、高い分子破片を処分することが重要です。</li>
	<li>小さい分子、2 mL プラスチック チューブにシアル酸種を含むを含む下の相を転送します。細い針とプラスチック製のチューブのキャップに 2-4 穴を突きます。急速凍結する液体窒素を使用してサンプルとそれらを一晩凍乾します。 注: 長期保管のための RT。 置換の穴なしキャップで数日間乾燥のサンプルを格納できます。</li>
</ol>7. 蛍光ラベリング
<ol><li>10 μ L 120 mM TFA 溶液の再乾燥のサンプルを中断し、50 μ L DMB ソリューションを追加します。紫外線からそれらを保護するために暗い 1.5 mL チューブにサンプルを転送します。</li>
	<li>基準、1 μ L を解散 Neu5Ac (60 ng/mL、水で) または 1 μ L Neu5Gc (60 ng/mL、水) 暗い 1.5 mL チューブに 10 μ L 120 mM TFA 溶液中。50 μ L の DMB のソリューションを追加します。</li>
	<li>細胞膜のサンプルをインキュベートし、56 ° C で 1.5 h の基準は、光から保護します。インキュベーション後、標識反応を停止するには、各サンプルに 4 μ L 400 mM NaOH 溶液を追加します。</li>
</ol>8. HPLC 分析
注: ラベル サンプル RP C18 カラムと HPLC 装置の分析 (110 Å、3 μ m の粒子径、4.6 × 150 mm)、蛍光検出器とほんの一部のコレクター。使用される溶媒はメタノール、アセトニ トリル、水です。高速液体クロマトグラフィー システム内部脱がない場合、測定する前にすべての溶剤ガスを抜き確認します。
<ol><li>列の温度を 40 ° C に設定し、373 の蛍光検出器を構成する励起と 448 nm nm 発光、それぞれ。10 μ L の試料の注入、メタノール/アセトニ トリル/水 (6:8:86) 溶離液で 0.5 mL/分の流量で 50 分のプローブを区切ります。質量分析のための関心のピークを収集します。 注: Neu5Gc は 6-8 分、9-12 分、17-23 分後 Neu5Prop、38-44 分後 Neu5But 後 Neu5Ac 後溶出する予定です。分別されたサンプルは、光から保護 4 ° C でいくつかの時間保存できます。</li>
	<li>各サンプルを測定した後にメタノール/アセトニ トリル/水 (6:25:69) 1.0 mL/min の流量 (≈ 1.5 列ボリューム) に 7.5 分の列を洗って、メタノール/アセトニ トリル/水 (6:8:86) で 1.0 mL/分の流量で 7.5 分のシステムを再平衡します。</li>
	<li>定量分析、それぞれの HPLC システム22のオペレーティング ソフトウェアを使用して興味のシアル酸のピークの曲線下の領域を計算します。 注: Neu5Ac または Neu5Gc 標準および細胞質画分 (5.1 項を参照) で測定されたタンパク質の濃度は、得られたデータが関連付けることができます。</li>
</ol>9. シアル酸糖の質量分析
注: 特定の HPLC 保持ピークさらに分析できます液体クロマトグラフィー (LC) エレクトロ スプレー イオン化質量分析法 (MS)、によって不自然なシアル酸種を確認するために。
<ol><li>質量分析用 LC/質量選択検出器 (MSD) システムに 79.9% メタノール、20% イソプロピル アルコール溶離液、0.5 mL/分の流量、4 kV キャピラリー電圧キャピラリー温度を 350 ° C と 0.1% ギ酸との採取試料の 20 μ L を注入する.22,23。</li>
	<li>それぞれの LC/MSD システムの評価版ソフトウェア、総イオンのクロマト グラムの関心のピークを選択します。解決のピークの質量スペクトルを表示します。300 と 700 の間の正の質量/電荷比を表示します。 注: DMB は、シアル酸のラベリング 116.2 g/mol の分子量の増加に します。シアル酸の DMB ラベル種次の分子固まりがある: DMB Neu5Ac = 424.2 g/mol、DMB Neu5Gc 441.8 g/mol、DMB Neu5Prop を = = 436.2 g/mol、DMB Neu5But 453.2 g = 付加体のモル共通/アセトニ トリル、ナトリウム、またはイソプロピル アルコール。</li>
</ol>10 ケリー神経芽細胞腫細胞におけるポリシアル酸西部のしみの分析
<ol><li>
セル lysates の準備
	<ol>
<li>ステップ 3.3 と渦から細胞ペレットに 1 mL の西部のしみの換散バッファーを追加します。氷の上で 30 分間インキュベートします。渦 5 分ごと。遠心分離機の 20,000 × g と 4 ° C で 1.5 h のサンプル分離細胞からタンパク質を含む上清を収集します。</li>
		<li>蛋白分画、例えば、ブラッドフォード、BCA アッセイのタンパク質濃度を決定します。タンパク質濃度は 1.5 μ g/μ L の換散バッファーのサンプルを希釈します。</li>
		<li>90 μ L タンパク質画分 (1.5 μ g/μ L) を 10 μ L 塩化物イオン サンプル バッファーを追加して SDS ページのサンプルを準備し、沸騰 5 分24サンプルです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
免疫ブロット
	<ol>
<li>20-30 μ L ポケットと 0.75 または 1 mm 厚 8 %sds アクリルアミドゲルを使用します。25 でゲルを実行室温 2 時間 mA</li>
		<li>ゲルからガラス ・ カバーを慎重に取り外します。カットし、読み込みポケットを含んでいるゲルの上の部分を破棄します。西部のしみバッファーに浸した (0.2 μ m)、ニトロセルロース膜にゲルを配置します。システム (例えば250 4 ° C で 1 時間の mA) の推薦によると硝酸セルロースに蛋白質を転送します。</li>
		<li>しみが付くシステムからニトロセルロース膜を削除します。Ponceau としみを汚れ蛋白質を視覚化する赤。プラスチック製チャンバーに硝酸セルロースの膜を転送し、解決を妨げる 10 mL を追加します。室温で 1 時間インキュベートまたは 4 ° C で一晩</li>
		<li>ブロッキング液をデカントし、PBS にモノクローナル抗 polySia 735 抗体 (1 μ g/mL) を追加します。RT で 1 h の膜を孵化させなさいまたは 4 ° C で一晩インキュベーション後、少なくとも 3 回 PBS で 5 分間膜を洗浄します。</li>
		<li>ポリクローナル抗マウス igg 抗体二次抗体 (1 μ g/mL) は、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) または PBS の蛍光ラベルに結合を追加します。室温 1 時間膜をインキュベートします。インキュベーション後、少なくとも 3 回 PBS で 5 分間膜を洗浄します。</li>
		<li>適切な撮像素子のプレート上に膜を転送します。製造元の指示に従って信号を検出します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

化学的に合成された ManNAc 誘導体、ManNProp と ManNBut は質量分析器で分析し、両方の標本の正しいの質量ピークのみが識別必要があります。したがって、製品は、99% 以上の純度をあると仮定することができます。Neu5Gc は、ひと細胞29が存在しない通常の少量は、分離細胞の膜画分に検出されます。これは最も可能性の高いメディア30のウシ胎児血清 sialoglycocon...

シアル酸は、 N- O型糖鎖や糖脂質などの複合糖質の非還元テルミニでは見つけることができる通常単糖類です。すべての単糖の中でシアル酸はいくつかのユニークな化学的特性を持っています。C-5 位置にラジカルアニオンの下でそれにより負荷電の生理的条件、C-1 位のカルボン酸基とアミノ機能 9 C 原子のバックボーンがあります。50 以上の自然発生するシアル酸の亜種が日1に特徴付けられる人間は、シアル酸の優勢な形態はNアセチルノイラミン酸 (Neu5Ac)。他の哺乳類はまた、 N‐ グリコリルノイラミン酸 (Neu5Gc)2,3の多量を表現します。
複合糖質の露出した場所にあるためシアル酸など4ホスト細胞にインフルエンザ ウイルスのヘマグルチニン依存結合受容体-リガンド相互作用の茄多が関係します。特に胚発生中や神経系の重要な生物学的機能を持つシアル酸エピトープはポリシアル酸です。ポリシアル酸は、最大 200 のアルファ 2, 8 リンク シアル酸の高分子です。ポリシアル酸の主要な蛋白質のキャリアは神経細胞接着分子 NCAM です。ポリシアル酸の発現はポリシアル酸式密着性を減少、増加する可塑性神経系5NCAM の接着性を調節します。
(ポリ) シアル酸の発現の変化は最終的に異なる生物間相互作用の多数に影響を与えます。これは、知られているシアル酸分子レベルで、新規複合糖質の相互作用を明らかにしたり、可能な治療上のアプローチを探るに依存するプロセスを研究に使用できます。ある異なる方法利用、細胞表面のシアル酸の発現を変調することができます、シアル酸特定グリコシダーゼ (シアリダーゼ)6 シアル酸生合成に関与する酵素の阻害による治療例 ,7、8、ノックダウンやシアル酸生合成9の鍵酵素の式を変更します。
シアル酸の発現を調節する別の汎用性の高い方法は、MGE (オリゴ糖とも呼ばれる代謝工学、萌え) です。ここで、細胞、組織、またはさらには動物は、C2 アミノ変更に耐える ManNAc の非天然誘導体と扱われます。細胞内取り込み後シアル酸の前駆体分子であること、これら ManNAc アナログ方向非自然代謝シアル酸、還元末端糖で表すことができます。ManNProp または ManNBut、 N- propionylneuraminic 酸 (Neu5Prop) や複合糖質10代でN- butanoylneuraminic 酸 (Neu5But) を組み込むかなど脂肪族 C2 の変更を運ぶ ManNAc 誘導体で処理した細胞,11ManNAc の C2 位置に導入された機能グループを使用して、発生する非天然型シアル酸が結合することができます、例えば、シュタウディンガー結紮またはアジ化 alkine 環、蛍光染料で、したがって。セルの表面12上で可視化します。
これらの非天然型シアル酸の発現は感染症病原体、密着性腫瘍細胞、一般的な細胞接着、血管新生、分化 (校閲用の移行など多くの生物学的プロセスに興味をそそられる効果参照してください: Wratilら13) です。 nMGE 興味深いことに、-変更アシル mannosamines ポリシアル酸の発現に干渉する使えます。ポリシアル酸は、2 つの異なる polysialyltransferases (ST8SiaII ・ ST8SiaIV) によって生成されます。それは、その polysialyltransferase ST8SiaII、ManNProp または ManNBut14,15などの不自然なシアル酸前駆体によって抑制される実証されています。さらに、ManNProp または ManNBut のアプリケーションがシアル化による全15も減少させることにはひと神経芽腫細胞で実証されてそれ。
NMGE-アシル変更 mannosamines は簡単に使用されています、だけでなく哺乳類の種,線虫16などの全体の動物においても細菌細胞培養法を適用するにはゼブラフィッシュ17、またはマウス18,19,20,21。僅か細胞毒性、細胞培養液や血漿中 millimolar 濃度でも、特に ManNAc デリバティブ脂肪族の修正、ManNProp、ManNBut などの軸受です。さらに、彼らは比較的容易に合成です。
ここで、 nMGE を使用する方法の詳細を提供-アセチル変更 mannosamines。最初に、2 つの ManNProp と ManNBut、この分野で最も広く使用されている ManNAc 誘導体の化学合成を説明します。次に、生体内で実験の MGE の適用方法を示します。例として、神経芽細胞腫細胞株ケリー ポリシアル エピトープの発現の低下を実証する西によって選ばれた ManNAc 誘導体投与後のしみ。細胞表面に非天然型シアル酸は高速液体クロマトグラフィーによる定量化され、さらに質量分析器で分析されました。

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92110411</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>75 ml tissue culture flasks</td><td>Greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>X986.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Serva</td><td>37190.03</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td><td>VWR</td><td>SDS Gel/Blot</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Roth</td><td>3019.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein ladder</td><td>Fisher Scientific</td><td>267620</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau red</td><td>Roth</td><td>5938.2</td><td></td></tr><tr><td>Milk powder</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBLUF 0500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4784-50MG</td><td></td></tr><tr><td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS3548-100EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-10MG</td><td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td></tr><tr><td>Butyryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109614-250G</td><td></td></tr><tr><td>C18 RP column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4435-E0</td><td>110 &amp;Aring;, 3 &amp;micro;m particle size, 4.6 x 150 mm</td></tr><tr><td>D-Mannosamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4670-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56302-50ML-GL</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>36.5-38.0%, in water</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl-Roth</td><td>T169.2</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>N-Acetyl-D-mannosamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8176-250MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0812-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Glycolylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9793-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Propionyl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P51559-500G</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td><td>Eppendorf</td><td>30120191</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bisulfite solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13438-1L-R-D</td><td>40%, in water</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319511-500ML</td><td>1.0 M, in water</td></tr><tr><td>Sodium methoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164992-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-100ML-D</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-019100</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Carl-Roth</td><td>T905.1</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Silica Gel 60</td><td>Carl-Roth</td><td>9779.1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSD-System</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

シアル酸 (Sia) は、 N- O型糖鎖や糖脂質などの複合糖質の非常に重要な成分です。オリゴ糖類とユニークな化学特性の非還元テルミニで地位によるシアル酸は異なる受容体-リガンド相互作用の多数にかかわる。変更すると細胞表面のシアル酸の発現、シアル酸依存性相互作用は影響その結果。これはシアル酸依存性相互作用を調査する役に立つことができる、有益な方法である特定の病気に影響を与える可能性があります。代謝独自 (MGE)、を介して細胞表面のシアル酸の発現を調整できます。ここで、C2 変更誘導体のN- acetylmannosamine (ManNAc) 細胞、組織、または全体の動物が扱われます。これらのアミノ糖シアル酸前駆体分子として従って対応するシアル酸種に代謝され、複合糖質の表現。このメソッドを適用すると、様々 な生物学的プロセスに興味をそそられる効果が生成されます。たとえば、ポリシアル酸 (polySia) 処理の神経細胞での発現を大幅に削減することができ、こうして神経細胞の増殖と分化に影響を与えます。ここで、 N- butanoylmannosamine (ManNBut)、およびN- propionylmannosamine (ManNProp) 最も一般的な C2 変更N- アシルマンノサミン誘導体の 2 つの化学合成を紹介し、さらにどのようにこれらの非天然を表示アミノ糖は、細胞培養試験において適用できます。変更されたシアル酸種の式は高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による定量化、さらに質量分析器で分析されました。ポリシアル酸の発現に及ぼす影響は、市販ポリシアル酸抗体を用いたウエスタンブロットによって解明します。

ラベル Neu5Ac Neu5Gc 規格蛍光灯の HPLC クロマト グラムを図 2で描かれています。ここに記述されたメソッドを使用すると、地上波 DMB ラベル Neu5Gc 通常た 7-9 分溶出時間と DMB Neu5Ac 10-12 分の間。クロマト グラムのいくつかのより小さいピークは通常 2-6 分間表示されます。これらのピークは、未反応の DMB を表し、反応中間体25。</p...

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Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

シアル酸は、典型的な単糖単位の複合糖質は、です。分子と細胞の相互作用の茄多になっています。代謝独自のN- acetylmannosamine 誘導体を用いた細胞表面のシアル酸の発現を変更する方法をご紹介します。

Nを用いたシアル酸の代謝独自-アシル-Mannosamines を変更

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

metabolic-glycoengineering-sialic-acid-using-n-acyl-modified

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

12.6K ビュー.  LMU München. シアル酸は、典型的な単糖単位の複合糖質は、です。分子と細胞の相互作用の茄多になっています。代謝独自のN- acetylmannosamine 誘導体を用いた細胞表面のシアル酸の発現を変更する方法をご紹介します。

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High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

生物工学

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) expression. These are acidic sugars that have a 9-carbon backbone and that cap vertebrate glycans on cell surfaces. Two of the major Sia forms in mammals are N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) and its hydroxylated form, N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc). Humans cannot produce endogenous Neu5Gc due to the inactivation of the gene encoding cytidine 5&#39;monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Foreign Neu5Gc is acquired by human cells through the dietary consumption of red meat and dairy and subsequently appears on diverse glycans on the cell surface, accumulating mostly on carcinomas. Consequently, humans have circulating anti-Neu5Gc antibodies that play diverse roles in cancer and other chronic inflammation-mediated diseases and that are becoming potential diagnostic and therapeutic targets. Here, we describe a high-throughput sialoglycan microarray assay to assess such anti-Neu5Gc antibodies in the human sera. Neu5Gc-containing glycans and their matched pairs of controls (Neu5Ac-containing glycans), each with a core primary amine, are covalently linked to epoxy-coated glass slides. We exemplify the printing of 56 slides in a 16-well format using a specific nano-printer capable of generating up to 896 arrays per print. Each slide can be used to screen 16 different human sera samples for the evaluation of anti-Neu5Gc antibody specificity, intensity, and diversity. The protocol describes the complexity of this robust tool and provides a basic guideline for those aiming to investigate the response to Neu5Gc dietary carbohydrate antigen in diverse clinical samples in an array format.

A sialoglycan microarray assay can be used to evaluate anti-Neu5Gc antibodies in human sera, making it a potential high-throughput diagnostic assay for cancer and other chronic inflammation-mediated human diseases.

Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

行動学

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

N型糖鎖アレイ開発および HIV 抗体のための化学酵素合成プロファイリング

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

化学

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having multifarious bioactivities. Although chemical O-glycosylation is a commonly beneficial strategy to synthesize disaccharide nucleosides, the preparation of substrates such as glycosyl donors and acceptors requires&#160;tedious protecting&#160;group manipulations and a purification at each synthetic step. Meanwhile, several research groups have reported that boronic and borinic esters serve as a protecting or activating group of carbohydrate derivatives to achieve the regio- and/or stereoselective acylation, alkylation, silylation, and glycosylation. In this article, we demonstrate the procedure for the regioselective O-glycosylation of unprotected ribonucleosides utilizing boronic acid. The esterification of 2&#39;,3&#39;-diol of ribonucleosides with boronic acid makes the temporary protection of diol, and, following O-glycosylation with a glycosyl donor in the presence of p-toluenesulfenyl chloride and silver triflate, permits the regioselective reaction of the 5&#39;-hydroxyl group to afford the disaccharide nucleosides. This method could be applied to various nucleosides, such as guanosine, adenosine, cytidine, uridine, 5-metyluridine, and 5-fluorouridine. This article and the accompanying video represent&#160;useful (visual) information for the O-glycosylation of unprotected nucleosides and their analogs for the synthesis of not only disaccharide nucleosides, but also a variety of biologically relevant derivatives.

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Here, we present protocols for the synthesis of disaccharide nucleosides by the regioselective O-glycosylation of ribonucleosides via a temporary protection of their 2&#39;,3&#39;-diol moieties utilizing a cyclic boronic ester. This method applies to several unprotected nucleosides such as adenosine, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine, and 5-fluorouridine to give corresponding disaccharide nucleosides.

ヌクレオシドを介して一時 2'、3'-ジオール保護ホウ酸エステル糖ヌクレオシドの合成のためのOの位置選択的グリコシル化反応

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

<meta charset="utf8"></head><body>細菌糖タンパク質の非特異的タンパク質分解に基づくグライコミクス戦略

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

細菌糖タンパク質の非特異的タンパク質分解に基づくグライコミクス戦略

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

生化学

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

免疫・感染学

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. However, monoclonal antibody functionality and half-life may be reduced by the type and distribution of host-specific glycosylation. Attempts to produce superior antibodies have inspired the development of genetically modified producer cells that synthesize glyco-optimized antibodies. Glycoengineering typically requires the generation of a stable knockout or knockin cell line using methods such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9. Monoclonal antibodies produced by engineered cells are then characterized using mass spectrometric methods to determine if the desired glycoprofile has been obtained. This strategy is time-consuming, technically challenging, and requires specialists. Therefore, an alternative strategy that utilizes streamlined protocols for genetic glycoengineering and glycan detection may assist endeavors toward optimal antibodies. In this proof-of-concept study, an IgG-producing Chinese hamster ovary cell served as an ideal host to optimize glycoengineering. Short interfering RNA targeting the Fut8 gene was delivered to Chinese hamster ovary cells, and the resulting changes in FUT8 protein expression were quantified. The results indicate that knockdown by this method was efficient, leading to a ~60% reduction in FUT8. Complementary analysis of the antibody glycoprofile was performed using a rapid yet highly sensitive technique: capillary gel electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. All knockdown experiments showed an increase in afucosylated glycans; however, the greatest shift achieved in this study was ~20%. This protocol simplifies glycoengineering efforts by harnessing in silico design tools, commercially synthesized gene targeting reagents, and rapid quantification assays that do not require extensive prior experience. As such, the time efficiencies offered by this protocol may assist investigations into new gene targets.

The glycosylation pattern of an antibody determines its clinical performance, thus industrial and academic efforts to control glycosylation persist. Since typical glycoengineering campaigns are time- and labor-intensive, the generation of a rapid protocol to characterize the impact of glycosylation genes using transient silencing would prove useful.

チャイニーズハムスター卵巣細胞における迅速な抗体糖工学

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

シアリダーゼ処理を用いた単離PBMCからの脱シアル化単球誘導型DC

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical characteristics, they are involved in numerous biological processes, such as modulation of the immune response, recognition of self and non-self antigens, carbohydrate-protein interactions, etc. The cellular content of sialic acid is regulated by sialidase, which catalyzes the removal of sialic acid residues. Several studies have shown that sialo-glycans are critical in monitoring immune surveillance by engaging with cis and trans inhibitory Siglec receptors on immune cells. Likewise, glyco-immune checkpoints in cancer are becoming crucial targets for developing immunotherapies. Additionally, dendritic cells (DCs) are envisioned as an important component in immunotherapies, especially in cancer research, due to their unique role as professional antigen-presenting cells (APC) and their capacity to trigger adaptive immune responses and generate immunologic memory. Nevertheless, the function of DCs is dependent on their full maturation. Immature DCs have an opposing function to mature DCs and a high sialic acid content, which further dampens their maturation level. This downregulates the ability of immature DCs to activate T-cells, leading to a compromised immune response. Consequently, removing sialic acid from the cell surface of human DCs induces their maturation, thus increasing the expression of MHC molecules and antigen presentation. In addition, it can restore the expression of co-stimulatory molecules and IL-12, resulting in DCs having a higher ability to polarize T-cells toward a Th1 phenotype and specifically activate cytotoxic T-cells to kill tumor cells. Therefore, sialic acid has emerged as a key modulator of DCs and is being used as a novel target to advance their therapeutic use. This study provides a unique approach to treat in vitro monocyte-derived DCs with sialidase, aimed at generating DC populations with different cell surface sialic acid phenotypes and tailored maturation and co-stimulatory profiles.

著者スポットライト:細胞表面のシアリダーゼベースの酵素処理を使用した樹状細胞の成熟 

A unique, comprehensive protocol to generate de-sialylated human monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a sialidase treatment is presented. Further, methods to assess the phenotypic and functional characterization of mo-DCs and evaluate how sialidase treatment improves the maturation level of mo-DCs are described.

シアル化表現型の異なる単球由来樹状細胞の作製

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...

Nを用いたシアル酸の代謝独自-アシル-Mannosamines を変更

要約

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