Agradecemos L. D. Nguyen pela revisão do manuscrito e frutíferos debates. Além disso, agradecemos J. Dernedde e H. G. Nguyen nos ajudar a preparar a gravação do vídeo. A maioria das cenas do vídeo foram filmadas nos laboratórios da R. Tauber. Agradecemos também o Instituto Max Planck de coloides e interfaces e por nos dar livre acesso a suas instalações de espectrometria de massa. RH foi apoiado pelo DFG (ProMoAge).

1. preparação dos reagentes e Buffers
<ol><li>
Preparação da solução de metóxido de sódio 3 mM
	<ol>
<li>Dissolva o metóxido de sódio 8,1 mg em 50 mL de metanol (3 mM) em um frasco de vidro de 100 mL com uma barra de agitação. Armazenar em temperatura ambiente (RT) durante várias semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de tampão Tris-HCl
	<ol>
<li>Combinar a 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl e 146 mg de EDTA em uma garrafa de vidro de 100 mL com uma barra de agitação e dissolver em 80 mL de água.</li>
		<li>Adicionar o hidróxido de sódio (1 M, em água) ou HCl (20%, em água) para a solução de agita, enquanto observa o pH com um medidor de pH e ajustar o pH para 8,0.</li>
		<li>Adicione o volume de água necessário para alcançar um volume final de 100 mL. Filtre a solução através de um sistema de filtro estéril de 0,22 µm. Nota: a reserva de 100 mL de Tris-HCl conterá 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl e 5 mM EDTA (pH 8.0). A solução pode ser armazenada a 4 ° C durante várias semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da solução de aprotinina
	<ol>
<li>Dissolva a aprotinina 10 mg em 1 mL de água (1,54 mM). Alíquota da solução de aprotinina em 10 x 1,5 mL-plástico tubos (100 µ l cada). Armazenar a-20 ° C durante várias semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da solução de leupeptin
	<ol>
<li>Dissolva leupeptin 10 mg em 2 mL de água (10 mM). Alíquota da solução leupeptin 10 x 1,5 mL-plástico tubos. Armazenar a-20 ° C durante várias semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da solução de fluoreto (PMSF) phenylmethylsulfonyl
	<ol>
<li>Dissolva 34,8 mg PMSF em 2 mL de etanol (100 mM). Alíquota da solução PMSF em 10 x 1,5 mL-plástico tubos. Armazenar a-20 ° C durante várias semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da solução de 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dicloridrato (DMB)
	<ol>
<li>Combine 15,62 mg DMB, 352 µ l β-Mercaptoetanol e solução bissulfito de sódio 48 µ l (39%) e adicionar água de 9,6 mL (6,9 mM DMB, 500mm β-Mercaptoetanol e 0,19% bissulfito de sódio). Alíquota da solução DMB em 40 x 1,5 mL-plástico tubos (250 µ l cada). Armazenar protegido da luz, a-20 ° C durante várias semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação 1 M trifluoroacético (TFA) da solução de ácido
	<ol>
<li>Adicione 770.3 µ l de 100% TFA para 9,23 mL de água em um tubo plástico de 15 mL (1 M). Armazenar a 4 ° C durante várias semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da solução de TFA de 120 mM
	<ol>
<li>Adicione 92.4 µ l TFA (100%) para 9,91 mL de água (120 mM) em um tubo plástico de 15 mL. Armazenar a 4 ° C durante várias semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da solução de hidróxido de sódio (NaOH) de 400 mM
	<ol>
<li>160 mg de NaOH em 10 mL de água (400 milímetros) em um tubo plástico de 15 mL, dissolva. Armazenar a 4 ° C durante várias semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de Lise borrão ocidental
	<ol>
<li>Dissolver 5,84 g NaCl, 0,1 g de Tris (hidroximetil)-aminomethan (Tris), 0,1 g de CaCl2, 0,95 g MgCl2e Triton-X100 1G em 100 mL de água e ajustar o pH a 7,8. Loja a 4 ° C. Adicione 100 µ l de cada inibidor de protease (aprotinina, leupeptin e PMSF) antes de usar o tampão de Lise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação do tampão de eletroforese (SDS-PAGE) do sódio Dodecil sulfato gel de poliacrilamida
	<ol>
<li>Dissolver 0,3 g Tris glicina 1,5 g e 0,1 g SDS em 100 mL de água e ajustar o pH para 7,3. Loja em RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação do buffer de borrão ocidental
	<ol>
<li>Dissolver 0,3 g Tris, glicina 1,1 g em 90 mL de água e adicionar 10 mL de etanol. Loja em RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da solução de bloqueio
	<ol>
<li>Dissolva 1 g de poder de gordura de leite grátis na salina de 25 mL tamponada fosfato (PBS). Sempre prepare fresco.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. síntese de ManNProp e afins N-acil-modificado Mannosamines
<ol><li>Dissolva o cloridrato de mannosamine 431,2 mg em 10 mL solução de metóxido de sódio de 3 mM em um frasco de vidro de 50 mL com uma barra de agitação.</li>
	<li>Arrefecer a mistura no gelo a 0 ° C. Para a solução de agita, adicione lentamente cloreto de propionil gota 210 µ l (2,4 mmol), ou cloreto de butanoyl 248 µ l (2,4 mmol) para sintetizar ManNProp ou ManNBut, respectivamente. Incube a mistura mexendo a 0 ° C, durante 4 h.</li>
	<li>Transferi a solução para um tubo de plástico de 50 mL. Picar furos de 4-8 na tampa do tubo plástico com uma agulha fina. Congelar rapidamente a solução usando nitrogênio líquido e posteriormente lyophilize (gelo seco) para 48 h ou até que esteja completamente seca.</li>
	<li>350 g de gel de sílica 60 se misturam com 750ml etil-acetato/metanol/água (15:2:1) (esta é uma suspensão). Preencher uma coluna de vidro (35 mm de diâmetro e 70 cm de comprimento) com a suspensão de sílica gel 60 e lavar a coluna preparada com uma adicional de 100 mL etil-acetato/metanol/água (15:2:1) antes do uso.</li>
	<li>Dissolver os produtos secos da etapa 2.3 (produto de 5 g secada) em 10 mL etil-acetato/metanol/água (15:2:1) e carga-los usando uma pipeta para a sílica gel de coluna. Colete frações 4 mL após 500 mL (para ManNProp). Nota: ManNBut vai eluir da coluna aproximadamente depois de 700 mL.</li>
	<li>Transferi as frações eluted para tubos de plástico de 15 mL. Picar 3-6 furos na tampa do tubo plástico com uma agulha fina. Rapid congelar a solução usando nitrogênio líquido e posteriormente lyophilize-la até que esteja completamente seca. Nota: Os produtos liofilizados podem ser armazenados por vários meses no RT</li>
	<li>Verificar a pureza dos produtos por espectrometria de massa (ver seção 9). Nota: Como alternativa, pureza também pode ser verificada por 1H. ressonância magnética Nuclear (RMN).</li>
</ol>3. cultura celular
<ol><li>Células de neuroblastoma Kelly cultura meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U penicilina, estreptomicina 100 mg, 2 mM L-glutamina contendo 5 mM ManNAc, ManNProp de 5 mM ou 5 mM ManNBut, a 37 ° C e 5% de CO2. Nota: As células cultivadas em meio sem ManNAc ou seus análogos são usadas como um controle.</li>
	<li>
Antes da aplicação do mannosamines, separar as células de neuroblastoma Kelly incubando-os por 10 min com tripsina/EDTA (0,25%, 0,02%, em PBS) e conta usando um contador-câmara de Neubauer ou célula. As células com números definidos com base no tamanho do prato/placa de semente.
	<ol>
<li>Para medir os monossacarídeos ácido siálico, sementes 1 x 105 células no meio de 500 µ l para uma placa de cultura de tecidos de 48-bem. Para a análise de ácidos polysialic, sementes 1 x 106 células em 3 mL de meio numa placa de cultura de células de diâmetro de 6 cm. Incube a 37 ° C e 5% de CO2. Substitua o medium cada 24 h. Nota: O efeito da MGE aumenta com o tempo total de tratamento. Para alta eficiência metabólica trate as células de 5-7 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Após o tratamento, decante o meio. Lave os pratos/placas com PBS. Separe as células incubando-os por 10 min com tripsina/EDTA (0,25%, 0,02%, em PBS). Neutralize a tripsina, adicionando o mesmo volume de meio de cultura celular para as células desanexadas. Transferi as células destacadas para tubos de plástico de 15 mL. Centrifugar as amostras por 3 min a 500 x g e descartar o sobrenadante.
	<ol>
<li>Adicione células de PBS e centrífuga de 5 mL (ver passo 3.3). Repita o procedimento de lavagem mais duas vezes. Nota: O centrifugado lavados sem sobrenadante pode ser armazenado a-20 ° C por vários dias. Se a expressão de ácido polysialic é para ser elucidado continuam a seção 10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Lysis da pilha para análise HPLC
<ol><li>
Preparação de tampão de Lise HPLC
	<ol>
<li>Combine o tampão Tris-HCl de 5 mL, 5 µ l aprotinina solução, solução de leupeptin 20 µ l e solução PMSF 50 µ l. Nota: 5 mL de tampão de Lise HPLC conterá 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM aprotinina, 40 µM Leupeptin e 1 mM PMSF (pH 8.0). Esse buffer deve estar sempre preparado fresco antes da lise celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ressuspender as células coletadas Pelotas (passo 3.3) cada em 500 µ l gelada HPLC-Lise e ultraproceda à sonicação as amostras com uma agulha de processador ultrasônico três vezes durante um período de 30 s às amplitudes de média-alta. Fixe as amostras no gelo pelo menos 1 min entre os ciclos.</li>
</ol>5. separação da fração de membrana
<ol><li>Centrifugar as amostras de células lisados por 2 h a 20.000 x g e 4 ° C. Separe o sobrenadante (aproximadamente 480 µ l), representando as proteínas cytosolic, em tubos plásticos de 1,5 mL. Determine a concentração de proteína destas frações usando, por exemplo, o Bradford ou ensaio bicinchoninic ácido (BCA). Nota: A concentração de proteína (aproximadamente 1 mg/mL) das frações citosólica mais tarde pode estar relacionada com a mediu a quantidade de espécies respeitado ácido siálico. A pelota representa a fração de membrana, que é usada na etapa 6.1.</li>
</ol>6. ácido hidrólise
Nota: Oligo - e polissacarídeos nas membranas celulares são hidrolisados a monossacarídeos. Além disso, possível O-modificações nos monossacáridos são hidrolisadas, também. Isto é necessário para a análise quantitativa de HPLC, porque a esmagadora maioria dos ácidos siálicos nas fracções da membrana é naturalmente incorporada em glicoconjugados e possivelmente pode suportar O-acetil ou O- lactolyl modificações.
<ol><li>Adicionar 150 µ l M 1 TFA-solução para as frações separadas da membrana (pelota da seção 5). Incube as amostras por 4 h a 80 ° C com agitação a 200-600 rpm.</li>
	<li>Centrifugar as amostras por aproximadamente 30 min em 20.000 x g e 21 ° C, utilizando tubos de filtro de 0,5 mL com 3 membranas de exclusão kDa, até que o volume da fase superior é inferior a 20 µ l. Nota: Este passo é importante para eliminar detritos molecular superior.</li>
	<li>Transferi a fase inferior contendo moléculas menores, incluindo as espécies de ácido siálico, para tubos de plástico de 2 mL. Picar furos de 2-4 para as tampas dos tubos de plástico com uma agulha fina. Rapid congelar as amostras usando nitrogênio líquido e depois lyophilize-los durante a noite. Nota: As amostras secas podem ser armazenadas por vários dias no RT. Replace um boné sem buracos para conservação mais longa.</li>
</ol>7. fluorescente de rotulagem
<ol><li>Re-suspender as amostras secas em solução de TFA 10 µ l 120 mM e adicionar 50 µ l de solução DMB. Transferi as amostras para tubos de escuro 1,5 mL para protegê-los de luz ultravioleta.</li>
	<li>Para os padrões, dissolver 1 µ l Neu5Ac (60 ng/mL, em água) ou 1 µ l Neu5Gc (60 ng/mL, em água) em 10 µ l 120mm TFA solução tubos escuros 1,5 mL. Adicione 50 µ l solução DMB.</li>
	<li>Incubar as amostras da membrana celular e os padrões para 1,5 h a 56 ° C protegido da luz. Após a incubação, adicione 4 µ l de solução de NaOH de 400mm para cada amostra para parar a reação de rotulagem.</li>
</ol>8. HPLC análise
Nota: Amostras etiquetadas são analisadas em um sistema HPLC equipado com uma coluna C18 RP (110 Å, tamanho de partícula de 3 µm, 4.6 x 150 mm), um detector de fluorescência e um coletor de fração. Os solventes usados são o metanol, acetonitrila e água. Certifique-se de desgaseificar todos os solventes antes da medição, se o sistema HPLC carece de um desgaseificador interno.
<ol><li>Definir a temperatura da coluna a 40 ° C e configurar o detector de fluorescência com 373 nm de excitação e 448 nm por emissão, respectivamente. Injetar o volume de amostra 10 µ l e separar as sondas por 50 min na taxa de fluxo de 0,5 mL/min com água/metanol/acetonitrilo (6:8:86) como eluente. Para análise de espectrometria de massa, recolha os picos de interesse. Nota: Neu5Gc deverá eluído após 6-8 min, Neu5Ac após 9-12 min, Neu5Prop depois de 17-23 min e Neu5But após 38-44 min. As amostras fracionadas podem ser armazenadas por vários h a 4 ° C, protegido da luz.</li>
	<li>Após a medição de cada amostra, lavar a coluna para 7,5 min a taxa de fluxo de 1,0 mL/min (≈ 1,5 volume) com água/metanol/acetonitrilo (6:25:69) e re-equilibrar o sistema para 7,5 min, a taxa de fluxo de 1,0 mL/min com água/metanol/acetonitrilo (6:8:86).</li>
	<li>Para análise quantitativa, calcule a área sob a curva dos picos de interesse usando o software operacional do respectivo sistema de HPLC-22ácido siálico. Nota: Os dados obtidos podem ser relacionados para o Neu5Ac ou o padrão de Neu5Gc e as concentrações de proteína medido nas fracções citosólica (ver secção 5.1).</li>
</ol>9. espectrometria análise de monossacarídeos ácido siálico
Nota: Picos de retenção HPLC de interesse podem ser mais analisados por espectrometria maciça de cromatografia líquida (LC)-ionização electrospray (ESI-MS), a fim de verificar a espécie natural ácido siálico.
<ol><li>Para análise de espectrometria de massa, injetar 20 µ l de amostra coletada em um sistema Detector seletivo LC/massa (MSD) com metanol de 79,9%, 20% de álcool isopropílico e 0,1% de ácido fórmico como eluente, taxa de fluxo de 0,5 mL/min, 4 kV tensão capilar e 350 ° C temperatura capilar 22 , 23.</li>
	<li>Do software de avaliação do respectivo sistema LC/MSD, selecione o pico de interesse no cromatograma total do íon. Ver os o espectro de massa do pico resolvido. Exiba a relação massa/carga positiva entre 300 e 700. Nota: DMB rotulagem de ácidos siálicos leva a um aumento na massa molecular de 116,2 g/mol. As espécies de DMB-rotulado o ácido siálico têm as seguintes massas moleculares: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/PM comum adutos são acetonitrilo, sódio ou álcool isopropílico.</li>
</ol>10. Western Blot análise de ácido Polysialic em células de Neuroblastoma de Kelly
<ol><li>
Preparação de lisados celulares
	<ol>
<li>Adicione 1 mL de tampão de Lise borrão ocidental para as pelotas de célula da etapa 3.3 e vórtice. Incube durante 30 min no gelo. Vórtice cada 5 min. Centrifugar as amostras por 1,5 h em 20.000 x g e 4 ° C. Recolha o sobrenadante contendo as proteínas das células lisadas.</li>
		<li>Determine a concentração de proteína das frações de proteína, por exemplo, o Bradford ou o ensaio BCA. Dilua as amostras a uma concentração de proteína de 1,5 µ g / µ l de tampão de Lise.</li>
		<li>Preparar as amostras para o SDS-PAGE, adicionando 10 amortecedor da amostra Laemmli µ l a fração de proteína 90 µ l (1,5 µ g / µ l) e ferver a amostra por 5 min24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunoblotting
	<ol>
<li>Use gel de SDS-acrilamida 8% com 20-30 µ l bolsos e 0,75 ou 1 mm de espessura. Funcione o gel a 25 mA por 2 h no RT</li>
		<li>Remova cuidadosamente a tampa de vidro do gel. Cortar e descartar a parte superior do gel contendo os bolsos de carregamento. Coloque o gel em uma membrana de nitrocelulose (0,2 µm), previamente embebido em buffer de Western blot. Transferência das proteínas de nitrocelulose, de acordo com a recomendação do sistema (por exemplo, 250 mA para 1 h a 4 ° C).</li>
		<li>Remova a membrana de nitrocelulose do sistema mancha. O blot com Ponceau mancha vermelha para visualizar as proteínas. Transferir a membrana de nitrocelulose em uma câmara de plástico e adicionar 10 mL de solução de bloqueio. Incubar durante 1 h no RT ou overnight a 4 ° C.</li>
		<li>Decantar a solução de bloqueio e adicionar o anticorpo monoclonal anti-polySia 735 (1 µ g/mL) em PBS. Incubar a membrana por 1h no RT ou overnight a 4 ° C. Após a incubação, lave a membrana pelo menos três vezes por 5 min com PBS.</li>
		<li>Adicione policlonal anti-mouse IgG anticorpo secundário (1 µ g/mL) acoplado a peroxidase de rábano (HRP) ou uma etiqueta fluorescente em PBS. Incubar a membrana por 1h no RT Após a incubação, lave a membrana pelo menos três vezes por 5 min com PBS.</li>
		<li>Transferi a membrana em uma placa de um adequado sistema de imagem. Detecta o sinal de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Se os derivados quimicamente sintetizados do ManNAc, ManNProp e ManNBut são analisados através de espectrometria de massa, apenas o pico de massa correto para ambas as amostras deve ser identificado. Portanto, os produtos podem ser considerados para ter um grau de pureza superior a 99%. Pequenas quantidades de Neu5Gc, que normalmente não é encontrada em células humanas29, são detectadas nas fracções da membrana das células lisadas. Isto provavelmente ocorre através de uma via de salvamen...

Ácido siálico é um monossacarídeo que normalmente pode ser encontrado na termini não-redução de glicoconjugados, tais como N- e O- os glicanos ou glicolipídeos. Entre todos os monossacarídeos, ácido siálico tem algumas características químicas únicas. Tem um backbone de átomo C 9, um grupo carboxílico na posição C-1, que é deprotonado e, assim, negativamente carregadas sob condições fisiológicas e uma função amino na posição C-5. Embora a data1, caracterizaram-se mais de 50 naturais variantes de ácido siálico, a forma predominante de ácido siálico, encontrado em seres humanos é N- acetilneuramínico ácido (Neu5Ac). Outros mamíferos também expressam quantidades mais elevadas de N- glycolylneuraminic ácido (Neu5Gc)2,3.
Devido à sua posição exposta em glicoconjugados, ácido siálico é envolvido em uma infinidade de interações ligante-receptor, por exemplo, a vinculação dependente de hemaglutinina do vírus da gripe ao anfitrião células4. Um epítopo de ácido siálico, com importantes funções biológicas, especialmente durante a embriogênese e no sistema nervoso, é o ácido polysialic. O ácido Polysialic é um polímero de até 200 ácidos siálicos de 2,8-lig alfa. O portador de proteína principal do ácido polysialic é a molécula de adesão celular neural (NCAM). Polysialic ácido expressão modula a propriedade adesiva da NCAM em que polysialic ácido expressão diminui a adesão e aumenta a plasticidade com o sistema nervoso5.
Alterações na expressão de ácido siálico de (poli) acabará por afectar uma infinidade de interações biológicas diferentes. Isso pode ser usado para estudar processos dependentes de conhecido de ácido siálico em um nível molecular, para descobrir o romance glicoconjugado interações, ou explorar possíveis abordagens terapêuticas. Existem diferentes métodos disponíveis pelo qual a expressão de ácido siálico na superfície da pilha pode ser modulada, por exemplo, tratamento com ácido siálico glicosidases específico (sialidases), inibição de enzimas envolvidas na biossíntese de ácido siálico6 ,7,8, ou derrubando ou mudar a expressão da enzima chave da biossíntese de ácido siálico9.
Outro método versátil para modular a expressão de ácido siálico é MGE (engenharia metabólica também conhecido como oligossacarídeo, MOE). Neste documento, células, tecidos ou até os animais são tratados com não-naturais derivados de ManNAc que levam a modificações C2-amino. Sendo moléculas precursoras para o ácido siálico, após a absorção celular, estes análogos de ManNAc são metabolizados para não-natural unidirecionais siálico ácidos e podem ser expressa na sialylated glicoconjugados. As células tratadocom com derivados de ManNAc carregando C2-modificações alifáticas, tais como ManNProp ou ManNBut, incorporar ácido de N- propionylneuraminic (Neu5Prop) ou N- butanoylneuraminic acid (Neu5But) em seus glicoconjugados10 , 11. usando grupos funcionais apresentados a posição C2 de ManNAc, podem ser acoplados os ocorrendo ácidos siálicos não-naturais, por exemplo, através da ligadura de Staudinger ou a azida alkine cicloadição, com corantes fluorescentes e, portanto, visualizado na superfície celular12.
A expressão destes ácidos siálicos do não-natural tem efeitos intrigantes em muitos processos biológicos, incluindo infecções do patógeno, a adesão e migração de células tumorais, adesão celular geral, bem como vascularização e diferenciação (para revisão Ver: Wratil et al . 13). Curiosamente, MGE com N-acil modificado mannosamines também pode ser usado para interferir com a expressão de ácido polysialic. O ácido Polysialic é gerado por dois polysialyltransferases diferentes (ST8SiaII e ST8SiaIV). Foi demonstrado, que polysialyltransferase ST8SiaII é inibida pela natural ácido siálico precursores, tais como ManNProp ou ManNBut de14,15. Além disso, foi demonstrado em células de neuroblastoma humano que ManNProp ou ManNBut aplicativo reduz também sialylation no total15.
MGE com N-acil modificado mannosamines é um fácil de aplicar o método que tem sido utilizado com sucesso, não só em mamíferos e cultura de células de bactérias mas também em toda animais de diferentes espécies, tais como Caenorhabditis elegans16, zebrafish17ou18,de ratos a19,20,21. Especialmente ManNAc derivados alifáticas modificações, incluindo ManNProp e ManNBut, do rolamento são insignificante citotóxicos, mesmo em concentrações milimolar em meio de cultura celular ou plasma sanguíneo. Além disso, eles são relativamente fáceis de sintetizar.
Aqui, nós fornecemos detalhes sobre como usar o MGE com N-acetil modificado mannosamines. Primeiro, a síntese química de dois dos mais utilizados derivativos ManNAc neste campo, ManNProp e ManNBut, é explicado. Em seguida, mostramos como MGE pode ser aplicada em um experimento na vivo . Como exemplo, a linhagem de células de neuroblastoma Kelly foi escolhida para demonstrar a diminuição da expressão do epítopo polysialic por Western blot após o tratamento com os derivados de ManNAc. Os ácidos siálicos não-natural na superfície da pilha foram quantificados por CLAE e mais analisados através de espectrometria de massa.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92110411</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>75 ml tissue culture flasks</td><td>Greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>X986.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Serva</td><td>37190.03</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td><td>VWR</td><td>SDS Gel/Blot</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Roth</td><td>3019.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein ladder</td><td>Fisher Scientific</td><td>267620</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau red</td><td>Roth</td><td>5938.2</td><td></td></tr><tr><td>Milk powder</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBLUF 0500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4784-50MG</td><td></td></tr><tr><td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS3548-100EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-10MG</td><td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td></tr><tr><td>Butyryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109614-250G</td><td></td></tr><tr><td>C18 RP column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4435-E0</td><td>110 &amp;Aring;, 3 &amp;micro;m particle size, 4.6 x 150 mm</td></tr><tr><td>D-Mannosamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4670-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56302-50ML-GL</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>36.5-38.0%, in water</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl-Roth</td><td>T169.2</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>N-Acetyl-D-mannosamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8176-250MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0812-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Glycolylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9793-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Propionyl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P51559-500G</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td><td>Eppendorf</td><td>30120191</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bisulfite solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13438-1L-R-D</td><td>40%, in water</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319511-500ML</td><td>1.0 M, in water</td></tr><tr><td>Sodium methoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164992-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-100ML-D</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-019100</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Carl-Roth</td><td>T905.1</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Silica Gel 60</td><td>Carl-Roth</td><td>9779.1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSD-System</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

Ácido siálico (Sia) é um componente altamente importante de glicoconjugados, tais como N- e O- os glicanos ou glicolipídeos. Devido à sua posição na termini não-redução de oligo - e polissacarídeos, bem como suas características químicas únicas, ácido siálico é envolvido em uma infinidade de interações ligante-receptor diferente. Modificando a expressão de ácido siálico na superfície das células, dependentes de ácido siálico interações serão influenciadas consequentemente. Isto pode ser útil para investigar interações ácido siálico-dependente e tem o potencial para influenciar certas doenças de uma forma benéfica. Via metabólica glycoengineering (MGE), a expressão de ácido siálico na superfície da pilha pode ser modulada. Neste documento, células, tecidos ou mesmo todo animais são tratados com C2-modificado derivados de N- acetylmannosamine (ManNAc). Estes aminoácidos açúcares atuam como moléculas de ácido siálico precursor e, portanto, são metabolizados para ácido siálico espécie correspondente e expressa na glicoconjugados. Aplicar este método produz efeitos intrigantes sobre diversos processos biológicos. Por exemplo, ele pode reduzir drasticamente a expressão de ácido polysialic (polySia) em células neuronais tratadas e afeta, portanto, diferenciação e crescimento neuronal. Aqui, nós mostramos a síntese química de duas das mais comuns derivadas - acylmannosamine C2-modificado N, N- propionylmannosamine (ManNProp) bem como o N- butanoylmannosamine (ManNBut) e ainda mostrar como esses não-naturais aminoácidos açúcares podem ser aplicados em experiências da cultura de pilha. A expressão de espécies modificadas ácido siálico é quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e mais analisada através de espectrometria de massa. Os efeitos sobre a expressão de ácido polysialic são elucidados através de Western blot utilizando um anticorpo ácido polysialic comercialmente disponível.

Cromatogramas HPLC do fluorescente etiquetado Neu5Ac e os padrões de Neu5Gc estão representadas na Figura 2. Usando o método descrito neste documento, Neu5Gc DMB-rotulado elutes tipicamente entre 7-9 min tempo de eluição e DMB-Neu5Ac entre 10 a 12 min. Vários pequenos picos no cromatograma costumam aparecem entre 2-6 min. Estes picos representam não tenha reagido DMB e reação intermediários25.
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Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Ácido siálico é uma monossacarídeo-unidade típica encontrada em glicoconjugados. Está envolvido em uma infinidade de interações moleculares e celulares. Aqui nós apresentamos um método para modificar a expressão de superfície de ácido siálico célula usando glycoengineering metabólica com derivados de N- acetylmannosamine.

Glycoengineering metabólica do ácido siálico usando N-acil-modificado Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

12.7K visualizações.  LMU München. Ácido siálico é uma monossacarídeo-unidade típica encontrada em glicoconjugados. Está envolvido em uma infinidade de interações moleculares e celulares. Aqui nós apresentamos um método para modificar a expressão de superfície de ácido siálico célula usando glycoengineering metabólica com derivados de N- acetylmannosamine.

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High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Alta capacidade de síntese de hidratos de carbono e funcionalização de nanopartículas polianidrido

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Bioengenharia

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) expression. These are acidic sugars that have a 9-carbon backbone and that cap vertebrate glycans on cell surfaces. Two of the major Sia forms in mammals are N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) and its hydroxylated form, N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc). Humans cannot produce endogenous Neu5Gc due to the inactivation of the gene encoding cytidine 5&#39;monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Foreign Neu5Gc is acquired by human cells through the dietary consumption of red meat and dairy and subsequently appears on diverse glycans on the cell surface, accumulating mostly on carcinomas. Consequently, humans have circulating anti-Neu5Gc antibodies that play diverse roles in cancer and other chronic inflammation-mediated diseases and that are becoming potential diagnostic and therapeutic targets. Here, we describe a high-throughput sialoglycan microarray assay to assess such anti-Neu5Gc antibodies in the human sera. Neu5Gc-containing glycans and their matched pairs of controls (Neu5Ac-containing glycans), each with a core primary amine, are covalently linked to epoxy-coated glass slides. We exemplify the printing of 56 slides in a 16-well format using a specific nano-printer capable of generating up to 896 arrays per print. Each slide can be used to screen 16 different human sera samples for the evaluation of anti-Neu5Gc antibody specificity, intensity, and diversity. The protocol describes the complexity of this robust tool and provides a basic guideline for those aiming to investigate the response to Neu5Gc dietary carbohydrate antigen in diverse clinical samples in an array format.

A sialoglycan microarray assay can be used to evaluate anti-Neu5Gc antibodies in human sera, making it a potential high-throughput diagnostic assay for cancer and other chronic inflammation-mediated human diseases.

Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

Comportamento

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

Quimio-enzimático síntese de N- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Química

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having multifarious bioactivities. Although chemical O-glycosylation is a commonly beneficial strategy to synthesize disaccharide nucleosides, the preparation of substrates such as glycosyl donors and acceptors requires&#160;tedious protecting&#160;group manipulations and a purification at each synthetic step. Meanwhile, several research groups have reported that boronic and borinic esters serve as a protecting or activating group of carbohydrate derivatives to achieve the regio- and/or stereoselective acylation, alkylation, silylation, and glycosylation. In this article, we demonstrate the procedure for the regioselective O-glycosylation of unprotected ribonucleosides utilizing boronic acid. The esterification of 2&#39;,3&#39;-diol of ribonucleosides with boronic acid makes the temporary protection of diol, and, following O-glycosylation with a glycosyl donor in the presence of p-toluenesulfenyl chloride and silver triflate, permits the regioselective reaction of the 5&#39;-hydroxyl group to afford the disaccharide nucleosides. This method could be applied to various nucleosides, such as guanosine, adenosine, cytidine, uridine, 5-metyluridine, and 5-fluorouridine. This article and the accompanying video represent&#160;useful (visual) information for the O-glycosylation of unprotected nucleosides and their analogs for the synthesis of not only disaccharide nucleosides, but also a variety of biologically relevant derivatives.

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Here, we present protocols for the synthesis of disaccharide nucleosides by the regioselective O-glycosylation of ribonucleosides via a temporary protection of their 2&#39;,3&#39;-diol moieties utilizing a cyclic boronic ester. This method applies to several unprotected nucleosides such as adenosine, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine, and 5-fluorouridine to give corresponding disaccharide nucleosides.

Regioselective O- glicosilação de nucleosídeos através o temporário 2', 3'-Diol proteção por um éster de Boronic para a síntese de dissacarídeo nucleosídeos

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Estratégia glicômica baseada em proteólise inespecífica para glicoproteínas bacterianas

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

Estratégia glicômica baseada em proteólise inespecífica para glicoproteínas bacterianas

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

Bioquímica

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Imunologia e Infecção

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. However, monoclonal antibody functionality and half-life may be reduced by the type and distribution of host-specific glycosylation. Attempts to produce superior antibodies have inspired the development of genetically modified producer cells that synthesize glyco-optimized antibodies. Glycoengineering typically requires the generation of a stable knockout or knockin cell line using methods such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9. Monoclonal antibodies produced by engineered cells are then characterized using mass spectrometric methods to determine if the desired glycoprofile has been obtained. This strategy is time-consuming, technically challenging, and requires specialists. Therefore, an alternative strategy that utilizes streamlined protocols for genetic glycoengineering and glycan detection may assist endeavors toward optimal antibodies. In this proof-of-concept study, an IgG-producing Chinese hamster ovary cell served as an ideal host to optimize glycoengineering. Short interfering RNA targeting the Fut8 gene was delivered to Chinese hamster ovary cells, and the resulting changes in FUT8 protein expression were quantified. The results indicate that knockdown by this method was efficient, leading to a ~60% reduction in FUT8. Complementary analysis of the antibody glycoprofile was performed using a rapid yet highly sensitive technique: capillary gel electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. All knockdown experiments showed an increase in afucosylated glycans; however, the greatest shift achieved in this study was ~20%. This protocol simplifies glycoengineering efforts by harnessing in silico design tools, commercially synthesized gene targeting reagents, and rapid quantification assays that do not require extensive prior experience. As such, the time efficiencies offered by this protocol may assist investigations into new gene targets.

The glycosylation pattern of an antibody determines its clinical performance, thus industrial and academic efforts to control glycosylation persist. Since typical glycoengineering campaigns are time- and labor-intensive, the generation of a rapid protocol to characterize the impact of glycosylation genes using transient silencing would prove useful.

Glicoengenia de anticorpos rápidos em células de ovário de hamster chinês

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

DCs derivadas de monócitos dessialilados de PBMCs isoladas usando tratamento com sialidase

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical characteristics, they are involved in numerous biological processes, such as modulation of the immune response, recognition of self and non-self antigens, carbohydrate-protein interactions, etc. The cellular content of sialic acid is regulated by sialidase, which catalyzes the removal of sialic acid residues. Several studies have shown that sialo-glycans are critical in monitoring immune surveillance by engaging with cis and trans inhibitory Siglec receptors on immune cells. Likewise, glyco-immune checkpoints in cancer are becoming crucial targets for developing immunotherapies. Additionally, dendritic cells (DCs) are envisioned as an important component in immunotherapies, especially in cancer research, due to their unique role as professional antigen-presenting cells (APC) and their capacity to trigger adaptive immune responses and generate immunologic memory. Nevertheless, the function of DCs is dependent on their full maturation. Immature DCs have an opposing function to mature DCs and a high sialic acid content, which further dampens their maturation level. This downregulates the ability of immature DCs to activate T-cells, leading to a compromised immune response. Consequently, removing sialic acid from the cell surface of human DCs induces their maturation, thus increasing the expression of MHC molecules and antigen presentation. In addition, it can restore the expression of co-stimulatory molecules and IL-12, resulting in DCs having a higher ability to polarize T-cells toward a Th1 phenotype and specifically activate cytotoxic T-cells to kill tumor cells. Therefore, sialic acid has emerged as a key modulator of DCs and is being used as a novel target to advance their therapeutic use. This study provides a unique approach to treat in vitro monocyte-derived DCs with sialidase, aimed at generating DC populations with different cell surface sialic acid phenotypes and tailored maturation and co-stimulatory profiles.

Autor em destaque: Maturação de células dendríticas usando tratamento enzimático baseado em sialidases da superfície celular 

A unique, comprehensive protocol to generate de-sialylated human monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a sialidase treatment is presented. Further, methods to assess the phenotypic and functional characterization of mo-DCs and evaluate how sialidase treatment improves the maturation level of mo-DCs are described.

Geração de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos com Fenótipos Sialilados Diferentes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...

Glycoengineering metabólica do ácido siálico usando N-acil-modificado Mannosamines

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