Nous remercions L. D. Nguyen, pour la relecture du manuscrit et des échanges fructueux. En outre, nous remercions Dernedde J. et H. G. Nguyen pour nous aider à préparer le tournage vidéo. La plupart des scènes de la vidéo ont été abattus dans les laboratoires de R. Tauber. Nous remercions également l’Institut Max Planck pour les colloïdes et interfaces et de nous donner libre accès à leurs installations de spectrométrie de masse. RH a été appuyée par la DFG (ProMoAge).

1. préparation des tampons et réactifs
<ol><li>
Préparation de solution de méthylate de sodium 3 mM
	<ol>
<li>Dissoudre le méthylate de sodium 8,1 mg dans 50 mL de méthanol (3 mM) dans une bouteille de verre de 100 mL avec une barre de remuer. Conserver à température ambiante (RT) pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de tampon Tris-HCl
	<ol>
<li>Combinez les 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl et 146 mg EDTA dans un flacon de verre de 100 mL avec une barre de remuer et dissoudre dans 80 mL d’eau.</li>
		<li>Ajouter hydroxyde de sodium (1 M, dans l’eau) ou HCl (20 %, dans l’eau) à la solution de l’agitation, tout en respectant le pH en utilisant un pH-metre et ajuster le pH à 8.0.</li>
		<li>Ajouter le volume d’eau nécessaire pour obtenir un volume final de 100 mL. Filtrer la solution à l’aide d’un système de filtration stérile de 0,22 µm. Remarque : 100 mL Tris-HCl tampon contiendra NaCl 150 mM, 10 mM Tris-HCl et 5 mM EDTA (pH 8,0). La solution peut être conservée à 4 ° C pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la solution de l’aprotinine
	<ol>
<li>Dissoudre 10 mg aprotinine dans 1 mL d’eau (1,54 mM). Partie aliquote de la solution d’aprotinine dans 10 x 1,5 mL-plastique tubes (100 µL). Conserver à-20 ° C pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la solution leupeptine
	<ol>
<li>Dissoudre 10 mg leupeptine dans 2 mL d’eau (10 mM). Partie aliquote de la solution de leupeptine 10 x 1,5 mL-plastique tubes. Conserver à-20 ° C pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la solution de fluorure (PMSF) phénylméthylsulfonyle
	<ol>
<li>Dissoudre 34,8 mg PMSF dans 2 mL d’éthanol (100 mM). Partie aliquote de la solution PMSF à 10 x 1,5 mL-plastique tubes. Conserver à-20 ° C pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la solution 1, 2-diamino-4, 5-methyldioxybenzol-dichlorhydrate (DMB)
	<ol>
<li>Mélanger 15,62 mg DMB, 352 µL β-mercaptoéthanol et 48 µL, bisulfite de sodium-solution (39 %) et ajouter 9,6 mL d’eau (6,9 mM DMB, 500 mM β-mercaptoéthanol et bisulfite de sodium 0,19 %). Partie aliquote de la solution DMB en 40 x 1,5 mL-plastique tubes (250 µL). Boutique abri de la lumière à-20 ° C pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la solution (TFA) d’acide trifluoroacétique 1 M
	<ol>
<li>Ajouter 770,3 µL de 100 % TFA à 9,23 mL d’eau dans un tube en plastique de 15 mL (1 M). Conserver à 4 ° C pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la solution AGT 120 mM
	<ol>
<li>Ajouter 92,4 µL AGT (100 %) à 9,91 mL d’eau (120 mM) dans un tube en plastique de 15 mL. Conserver à 4 ° C pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) 400 mM
	<ol>
<li>Dissoudre 160 mg NaOH dans 10 mL d’eau (400 mM) dans un tube en plastique de 15 mL. Conserver à 4 ° C pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation du tampon de lyse Western blot
	<ol>
<li>Dissoudre 5,84 g de NaCl, 0,1 g de Tris (hydroxyméthyl)-aminomethan (Tris), 0,1 g de CaCl2, 0,95 g MgCl2et 1 g Triton-X100 dans 100 mL d’eau et ajuster le pH à 7,8. Conserver à 4 ° C. Ajouter 100 µL de chaque inhibiteur de la protéase (aprotinine, leupeptine et PMSF) avant d’utiliser le tampon de lyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel électrophorèse (SDS-PAGE) tampon
	<ol>
<li>Dissoudre 0,3 g de Tris, glycine de 1,5 g et 0,1 g SDS dans 100 mL d’eau et ajuster le pH à 7,3. Magasin à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation du tampon de Western blot
	<ol>
<li>Dissoudre 0,3 g de Tris, glycine de 1,1 g dans 90 mL d’eau et ajouter 10 mL d’éthanol. Magasin à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la solution de blocage
	<ol>
<li>Dissoudre 1 g de puissance de lait sans gras dans une solution saline tamponnée au phosphate de 25 mL (PBS). Préparez toujours frais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. synthèse des ManNProp et des N-acyl-modification Mannosamines
<ol><li>Dissoudre 431,2 mg de chlorhydrate de mannosamine en solution de méthylate de sodium 3 mM 10 mL dans un flacon de verre de 50 mL avec une barre de remuer.</li>
	<li>Laisser refroidir le mélange sur la glace à 0 ° C. À la solution en remuant, ajouter lentement goutte à goutte 210 chlorure de propionyle µL (2,4 mmol), ou chlorure de butanoyl 248 µL (2,4 mmol) de synthétiser les ManNProp ou ManNBut, respectivement. Incuber le mélange en remuant à 0 ° C pendant 4 h.</li>
	<li>Transvaser la solution dans un tube en plastique de 50 mL. Piquez 4-8 trous dans le couvercle du tube en plastique avec une aiguille fine. Congeler rapidement la solution à l’aide d’azote liquide et ensuite lyophiliser (gel sec) pendant 48 heures ou jusqu'à ce qu’il soit complètement sec.</li>
	<li>Mélanger 350 g de gel de silice 60 avec 750 mL d’éthyle acétate/méthanol/eau (15:2:1) (il s’agit d’une suspension). Remplir une colonne de verre (35 mm de diamètre et 70 cm de longueur) avec la suspension du gel de silice 60 et laver la colonne préparée avec un autre 100 mL éthyl-acétate/méthanol/eau (15:2:1) avant utilisation.</li>
	<li>Dissoudre les produits séchés de l’étape 2.3 (produit sec de 5 g) dans 10 mL d’éthyl-acétate/méthanol/eau (15:2:1) et la charge à l’aide d’une pipette sur la silice gel colonne. Recueillir les fractions 4 mL après 500 mL (pour ManNProp). Remarque : ManNBut va éluer de la colonne après environ 700 mL.</li>
	<li>Transférer les fractions éluées dans les tubes en plastique de 15 mL. Piquez 3-6 trous dans le couvercle du tube en plastique avec une aiguille fine. Rapid geler la solution à l’aide d’azote liquide et par la suite il lyophiliser jusqu'à ce qu’il soit complètement sec. Remarque : Les produits lyophilisés peuvent être stockés pendant plusieurs mois à température ambiante.</li>
	<li>Vérifier la pureté des produits par spectrométrie de masse (voir section 9). Remarque : Vous pouvez également pureté peut également être vérifiée par 1H résonance magnétique nucléaire (RMN).</li>
</ol>3. Culture cellulaire
<ol><li>Cellules de neuroblastome de Kelly culture dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenant 10 % sérum de veau fœtal, 100 pénicilline U, streptomycine 100 mg, 2 mM de L-glutamine contenant 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp ou 5 mM ManNBut, à 37 ° C et 5 % de CO2. Remarque : Les cellules cultivées dans un milieu sans ManNAc ou ses analogues sont utilisés comme un contrôle.</li>
	<li>
Avant l’application de la mannosamines, détacher les cellules de neuroblastome Kelly en incubant les pendant 10 min avec la trypsine/EDTA (0,25 % et 0,02 %, dans du PBS) et compter à l’aide d’un compteur de Neubauer-chambre ou cellule. Les cellules aux numéros définis selon la taille du plat/plaque de graines.
	<ol>
<li>Pour mesurer l’acide sialique monosaccharides, graines 1 x 105 cellules de 500 µL de milieu dans une plaque de 48 puits vitroplants. Pour l’analyse des acides polysialique, graines 1 x 106 cellules dans 3 mL de milieu sur une boîte de Petri de cellule de diamètre 6 cm. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2. Remplacer le support de toutes les 24 h. Remarque : L’effet de MGE augmente avec la durée totale du traitement. Pour un rendement métabolique élevé traiter les cellules pendant 5 à 7 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Après le traitement, décanter le milieu. Laver les plaques/plats avec du PBS. Détacher les cellules en les incubant pendant 10 min avec la trypsine/EDTA (0,25 % et 0,02 %, dans du PBS). Neutraliser la trypsine en ajoutant le même volume de milieu de culture cellulaire dans les cellules individuelles. Transférer les cellules individuelles dans des tubes en plastique de 15 mL. Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 500 x g et éliminer le surnageant.
	<ol>
<li>Ajouter 5 mL des cellules de PBS et centrifuger (voir étape 3.3). Répétez la procédure de nettoyage deux fois plus. Remarque : Le culot de cellules lavées sans surnageant peut être stocké à-20 ° C pendant plusieurs jours. Si l’expression de l’acide polysialique doit être élucidé continuent à l’article 10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cellule Lysis pour analyse par CLHP
<ol><li>
Préparation du tampon de lyse HPLC
	<ol>
<li>Mélanger 5 mL Tris-HCl de tampon, 5 µL de solution d’aprotinine, 20 µL de solution de leupeptine et 50 µL de solution de PMSF. NOTE : tampon de lyse de HPLC de 5 mL contient 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM aprotinine, 40 µM leupeptine et 1 mM PMSF (pH 8,0). Ce tampon toujours doit être préparé fraîche avant de la lyse cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remettre en suspension les granules des cellules recueillies (étape 3.3) chaque dans 500 µL glacee HPLC-tampon de lyse et ultra-laisser agir les échantillons avec une aiguille de processeur ultra sonique trois fois pour une période de 30 s à feu moyen-vif amplitudes. Laisser refroidir les échantillons sur glace pendant au moins 1 min entre les cycles.</li>
</ol>5. la séparation de la Fraction de Membrane
<ol><li>Centrifuger les échantillons de cellules lysées pendant 2 h à 20 000 x g et 4 ° C. Séparer le surnageant (environ 480 µL), représentant des protéines cytosoliques, dans des tubes en plastique de 1,5 mL. Déterminer la concentration de protéines de ces fractions en utilisant, par exemple, le Bradford ou dosage bicinchoninic acid (BCA). NOTE : La concentration de la protéine (environ 1 mg/mL) des fractions cytosoliques peut plus tard être liée aux quantités mesurées de l’espèce de l’acide sialique respecté. Le plomb représente la fraction de membrane, qui est utilisée à l’étape 6.1.</li>
</ol>6. acide hydrolyse
NOTE : Oligo - et polysaccharides dans les membranes cellulaires sont hydrolysés en monosaccharides. En outre, possible O-modifications dans les monosaccharides sont hydrolysés, aussi bien. C’est nécessaire pour l’analyse quantitative de HPLC, parce que l’écrasante majorité des acides sialiques dans les fractions membranaires est naturellement intégrée à glycoconjugués et pourrait éventuellement porter O-acétyl ou O- lactolyl modifications.
<ol><li>Ajouter 150 µL 1 M TFA-solution pour les fractions de membrane séparées (pellet du chapitre 5). Incuber les échantillons pendant 4 h à 80 ° C sous agitation à 200-600 tr/min.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons pour environ 30 min à 20 000 x g et 21 ° C à l’aide de tubes filtre 0,5 mL avec 3 membranes d’exclusion kDa, jusqu'à ce que le volume de la phase supérieure est inférieure à 20 µL. Remarque : Cette étape est importante pour éliminer les débris moléculaire plus élevé.</li>
	<li>Transférer la phase inférieure contenant des molécules plus petites, notamment l’espèce acide sialique, dans des tubes en plastique de 2 mL. Piquez 2-4 trous dans les bouchons des tubes en plastique avec une aiguille fine. Rapid congeler les échantillons à l’aide d’azote liquide et ensuite leur lyophiliser du jour au lendemain. Remarque : Les échantillons séchés peuvent être stockés pendant plusieurs jours à RT., remplacera un cap sans trous pour une conservation plus longue.</li>
</ol>7. fluorescent étiquetage
<ol><li>Remettre en suspension les échantillons séchés à 10 µL de solution de TFA 120 mM et ajouter 50 µL de solution de DMB. Transférer les échantillons dans des tubes de sombre 1,5 mL pour les protéger des rayons ultraviolets.</li>
	<li>Pour les normes, dissoudre 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, dans l’eau) ou 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, dans l’eau) dans 10 µL de solution de TFA 120 mM en tubes sombres de 1,5 mL. Ajouter 50 µL de solution de DMB.</li>
	<li>Incuber les échantillons de la membrane cellulaire et les normes pour 1,5 h à 56 ° C abri de la lumière. Après l’incubation, ajouter 4 ml 400 mM solution de NaOH à chaque échantillon pour arrêter la réaction d’étiquetage.</li>
</ol>8. analyse par CLHP
Remarque : Les échantillons étiquetés sont analysés sur un système HPLC équipé d’une colonne C18 RP (110 Å, granulométrie 3 µm, 4.6 x 150 mm), un détecteur de fluorescence et un collecteur de fraction. Les solvants utilisés sont le méthanol, l’acétonitrile et l’eau. Veillez à dégazer tous les solvants avant les mesures, si le système de CLHP manque un dégazeur interne.
<ol><li>Régler la température de la colonne à 40 ° C et de configurer le détecteur de fluorescence avec 373 nm pour l’excitation et 448 nm pour l’émission, respectivement. Injecter le volume d’échantillon de 10 µL et séparez les sondes pendant 50 min à 0,5 mL/min débit par méthanol/acétonitrile/eau (6:8:86) comme l’éluant. Pour l’analyse de spectrométrie de masse, recueillir les pics d’intérêt. Remarque : Neu5Gc est censé d’éluat après 6-8 min, Neu5Ac après 9 à 12 min, Neu5Prop après 17-23 min et Neu5But après 38-44 min. Les échantillons fractionnés peuvent être conservés pendant plusieurs heures à 4 ° C, abri de la lumière.</li>
	<li>La mesure de chaque échantillon, laver la colonne pendant 7,5 min à débit de 1,0 mL/min (volumes de colonne 1,5 ≈) avec méthanol/acétonitrile/eau (6:25:69) et rééquilibrer le système pendant 7,5 min à débit de 1,0 mL/min avec méthanol/acétonitrile/eau (6:8:86).</li>
	<li>Pour une analyse quantitative, calculer l’aire sous la courbe des pics d’intérêt en utilisant le logiciel d’exploitation du système HPLC respectifs22acide sialique. NOTE : Données obtenues peuvent être liées à la Neu5Ac ou la norme Neu5Gc et aux concentrations mesurées de protéine dans les fractions cytosoliques (voir section 5.1).</li>
</ol>9. mass Spectrometry analyse de l’acide sialique Monosaccharides
NOTE : Pics de rétention HPLC d’intérêt peuvent être davantage analysés par spectrométrie de masse par chromatographie liquide (CL)-ionisation par électrospray (ESI-MS), afin de vérifier l’espèce de l’acide sialique contre nature.
<ol><li>Pour l’analyse de spectrométrie de masse, injecter 20 µL de l’échantillon prélevé dans un système de détecteur sélectif LC/masse (MSD) avec 79,9 % de méthanol, alcool isopropylique à 20 % et 0,1 % d’acide formique comme éluant, débit 0,5 mL/min, 4 kV de tension capillaire et 350 ° C température capillaire 22 , 23.</li>
	<li>Dans le logiciel d’évaluation du système LC/MSD respectif, sélectionnez le pic d’intérêt dans le chromatogramme d’ion totale. Découvre le spectre de masse du pic résolu. Afficher le rapport masse/charge positive entre 300 et 700. NOTE : DMB étiquetage des acides sialiques conduit à une augmentation de la masse moléculaire de 116,2 g/mol. Les espèces de l’acide sialique marquée DMB ont les masses moléculaires suivantes : DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436,2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/mol communs adduits sont l’acétonitrile, de sodium ou de l’alcool isopropylique.</li>
</ol>10. immunobuvardage, d’acide polysialique dans les cellules de neuroblastome Kelly
<ol><li>
Préparation des lysats cellulaires
	<ol>
<li>Ajouter tampon de lyse de Western blot 1 mL pour les pellets de la cellule à l’étape 3.3 et vortex. Incuber pendant 30 minutes sur la glace. Vortex toutes les 5 min. Centrifuger les échantillons pendant 1,5 h 20 000 x g et 4 ° C. Récupérer le surnageant contenant les protéines des cellules lysées.</li>
		<li>Déterminer la concentration de protéine les fractions protéiques, par exemple, le Bradford ou le dosage de la BCA. Diluer les échantillons à une concentration de protéines de 1,5 µg/µL de tampon de lyse.</li>
		<li>Préparer les échantillons pour la SDS-PAGE, en ajoutant 10 µL de tampon de Laemmli sample à la fraction de protéine 90 µL (1,5 µg/µL) et faire bouillir l’échantillon pendant 5 min24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunoblotting
	<ol>
<li>Utiliser les gels SDS-acrylamide 8 % avec 20-30 µL poches et 0,75 ou 1 mm épaisseur. Exécutez le gel à 25 mA pendant 2 h à température ambiante.</li>
		<li>Retirez soigneusement le couvercle en verre du gel. Couper et jeter la partie supérieure du gel contenant les poches de chargement. Placer le gel sur une membrane de nitrocellulose (0,2 µm), gonflée dans le tampon de Western blot. Les protéines de transfert sur nitrocellulose conformément à la recommandation du système (p. ex., 250 mA pendant 1 h à 4 ° C).</li>
		<li>Enlever la membrane de nitrocellulose du système buvard. La tache avec Ponceau tache rouge pour visualiser les protéines. Transférer la membrane de nitrocellulose dans une chambre en plastique et ajouter 10 mL de solution de blocage. Incuber pendant 1 heure à ta ou toute la nuit à 4 ° C.</li>
		<li>Décanter la solution de saturation et ajoutez l’anticorps monoclonal anti-polySia 735 (1 µg/mL) dans du PBS. Incuber la membrane pendant 1 h à RT ou toute la nuit à 4 ° C. Après incubation, laver la membrane au moins trois fois pendant 5 min avec du PBS.</li>
		<li>Ajouter anti-souris IgG secondaires anticorps polyclonal (1 µg/mL) couplé à la peroxydase de raifort (HRP) ou une étiquette fluorescente dans du PBS. Incuber la membrane pendant 1 h à température ambiante. Après incubation, laver la membrane au moins trois fois pendant 5 min avec du PBS.</li>
		<li>Le transfert de la membrane sur une plaque d’un imageur approprié. Détecter le signal selon les instructions du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Si les synthèse chimique dérivés de ManNAc, ManNProp et ManNBut sont analysés par spectrométrie de masse, seulement le pic de masse correct pour les deux spécimens doit être identifié. Par conséquent, les produits peuvent supposer avoir une pureté supérieure à 99 %. Petites quantités de Neu5Gc, qui se trouve normalement pas dans les cellules humaines29, sont détectées dans les fractions membranaires des cellules lysées. Cela se produit probablement par une voie de récupération qu...

L’acide sialique est un monosaccharide qui se trouvent généralement à la termini non réductrice des glycoconjugués, tels que le N- O- glycanes ou glycolipides. Parmi tous les monosaccharides, l’acide sialique présente des caractéristiques chimiques uniques. Il a un squelette d’atomes C 9, un groupe carboxylique en position de C-1, qui est déprotoné et ainsi négativement chargées sous des conditions physiologiques et une fonction amine en position C-5. Bien que plus de 50 variantes d’acide sialique naturels ont été caractérisés à ce jour1, la forme prédominante de l’acide sialique trouvée chez l’homme est l’acide N- acétylneuraminique (Neu5Ac). Autres mammifères expriment également des quantités plus élevées de N- GLYCOLYLNEURAMINIQUE acide (Neu5Gc)2,3.
En raison de sa position exposée en glycoconjugués, l’acide sialique est impliqué dans une multitude d’interactions ligand-récepteur, par exemple, la liaison dépendant d’hémagglutinine du virus de la grippe à hôte cellules4. Un épitope acide sialique avec des fonctions biologiques importantes, en particulier au cours de l’embryogenèse et dans le système nerveux, est l’acide polysialique. L’acide polysialique est un polymère de jusqu'à 200 acides sialiques liés à 2,8 alpha. Le transporteur de la protéine majeure de l’acide polysialique est la molécule d’adhésion cellulaire neuronal (NCAM). Polysialic acide expression module la propriété adhésive de la NCAM qu’expression acide polysialique diminue l’adhérence et augmente la plasticité du système nerveux5.
Changements dans l’expression de l’acide sialique (poly) affecteront en fin de compte une multitude d’interactions biologiques différentes. Ceci peut être utilisé pour étudier les processus dépendants connus acide sialique au niveau moléculaire, de découvrir les interactions glycoconjugués roman, ou d’explorer des approches thérapeutiques possibles. Il existe différentes méthodes disponibles permettant l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule peut être modulée, par exemple le traitement avec l’acide sialique glycosidases spécifique (sialidases), l’inhibition des enzymes impliquées dans la biosynthèse de l’acide sialique6 ,7,8, ou faire tomber ou changement de l’expression de l’enzyme clé de la biosynthèse de l’acide sialique9.
Une autre méthode polyvalente pour moduler l’expression de l’acide sialique est MGE (génie métabolique également connu sous le nom d’oligosaccharide, MOE). Dans les présentes, cellules, tissus ou même les animaux sont traités avec non naturels dérivés de ManNAc portant modifications C2-aminés. Étant des molécules précurseurs de l’acide sialique, après absorption cellulaire, ces analogues de ManNAc sont les acides sialiques métabolisés à non-naturelles unidirectionnels et peuvent être exprimées sur glycoconjugués sialylés. Les cellules traitées avec ManNAc dérivés transportant aliphatiques C2-modifications, telles que ManNProp ou ManNBut, intègrent l’acide N- propionylneuraminic (Neu5Prop) ou l’acide N- butanoylneuraminic (Neu5But) dans leur glycoconjugués10 , 11. à l’aide de groupes fonctionnels à la position C2 de ManNAc, les naturels les acides sialiques non naturels peuvent être couplés, par exemple, via la ligature de Staudinger ou la cycloaddition de bases azoture, avec les colorants fluorescents et donc visualisées sur la surface de cellule12.
L’expression de ces acides sialiques de non naturel a des effets intrigantes sur nombreux processus biologiques, y compris les infections pathogènes, l’adhérence et la migration des cellules tumorales, d’adhérence cellulaire générale, ainsi que de vascularisation et de différenciation (pour révision Voir : Wratil et al. 13). il est intéressant, MGE avec N-acyl modifié mannosamines peut également être utilisé pour gêner l’expression de l’acide polysialique. L’acide polysialique est généré par deux polysialyltransferases différentes (ST8SiaII et ST8SiaIV). Il a été démontré, que polysialyltransferase ST8SiaII est inhibée par l’acide sialique unnatural précurseurs, tels que ManNProp ou ManNBut14,15. En outre, il a été démontré dans les cellules de neuroblastome humain que ManNProp ou ManNBut application réduit également sialylation au total15.
MGE avec N-acyl modifié mannosamines est un facile d’appliquer la méthode qui a été utilisé avec succès, non seulement dans les mammifères et la culture de cellules de bactéries mais aussi dans tout animaux de différentes espèces, telles que Caenorhabditis elegans16, poisson zèbre17ou souris18,19,20,21. En particulier les dérivés de ManNAc portant modifications aliphatiques, y compris ManNProp et ManNBut, sont négligeable cytotoxiques, même à des concentrations millimolaires dans un milieu de culture cellulaire ou de plasma sanguin. En outre, ils sont relativement faciles à synthétiser.
Ici, nous donne des détails sur comment utiliser MGE avec la N-acétyl modifiés mannosamines. Tout d’abord, la synthèse chimique de deux des dérivés ManNAc plus largement utilisés dans ce domaine, ManNProp et ManNBut, s’explique. Ensuite, nous montrons comment MGE peut être appliqué dans une expérience in vivo . À titre d’exemple, la lignée de cellules de neuroblastome Kelly a été choisie pour démontrer une diminution d’expression de l’épitope polysialique par Western blot après le traitement avec les dérivés de ManNAc. Les acides sialiques non naturelle sur la surface de la cellule ont été quantifiés par HPLC et plus analysés par spectrométrie de masse.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92110411</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>75 ml tissue culture flasks</td><td>Greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>X986.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Serva</td><td>37190.03</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td><td>VWR</td><td>SDS Gel/Blot</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Roth</td><td>3019.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein ladder</td><td>Fisher Scientific</td><td>267620</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau red</td><td>Roth</td><td>5938.2</td><td></td></tr><tr><td>Milk powder</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBLUF 0500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4784-50MG</td><td></td></tr><tr><td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS3548-100EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-10MG</td><td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td></tr><tr><td>Butyryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109614-250G</td><td></td></tr><tr><td>C18 RP column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4435-E0</td><td>110 &amp;Aring;, 3 &amp;micro;m particle size, 4.6 x 150 mm</td></tr><tr><td>D-Mannosamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4670-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56302-50ML-GL</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>36.5-38.0%, in water</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl-Roth</td><td>T169.2</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>N-Acetyl-D-mannosamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8176-250MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0812-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Glycolylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9793-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Propionyl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P51559-500G</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td><td>Eppendorf</td><td>30120191</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bisulfite solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13438-1L-R-D</td><td>40%, in water</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319511-500ML</td><td>1.0 M, in water</td></tr><tr><td>Sodium methoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164992-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-100ML-D</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-019100</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Carl-Roth</td><td>T905.1</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Silica Gel 60</td><td>Carl-Roth</td><td>9779.1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSD-System</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

L’acide sialique (Sia) est un constituant très important des glycoconjugués, tels que le N- O- glycanes ou glycolipides. En raison de sa position à des terminaisons non réductrice des oligo - et polysaccharides, ainsi que ses caractéristiques chimiques, l’acide sialique est impliqué dans une multitude d’interactions ligand-récepteur différent. En modifiant l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule, l’acide sialique dépendant des interactions seront par conséquent influencées. Cela peut être utile pour étudier les interactions acide sialique-dépendante et a le potentiel d’influencer certaines maladies d’une manière bénéfique. Par l’intermédiaire de glycosylation métabolique (MGE), l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule peut être modulée. Dans les présentes, cellules, tissus ou même ensemble animaux est traités avec C2-modified dérivés de N- acétylmannosamine (ManNAc). Ces sucres aminés agissent comme molécules précurseurs de l’acide sialique donc métabolisés en acide sialique espèces correspondantes et sont exprimées sur glycoconjugués. En appliquant cette méthode produit des effets fascinants sur divers processus biologiques. Par exemple, il peut réduire considérablement l’expression de l’acide polysialique (polySia) dans les cellules neuronales traitées et affecte donc la différenciation et la croissance neuronale. Ici, nous montrons la synthèse chimique de deux des plus courants dérivés C2-modification N- acylmannosamine, N- propionylmannosamine (ManNProp) ainsi que de N- butanoylmannosamine (ManNBut) et en outre montrer comment ces non naturels sucres aminés peuvent être appliquées dans les expériences de culture cellulaire. L’expression des espèces acide sialique modifié est quantifiée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) et plus analysée par spectrométrie de masse. Les effets sur l’expression acide polysialique ont été élucidés par Western blot, en utilisant un anticorps acide polysialique disponible dans le commerce.

Les chromatogrammes HPLC de le fluorescent étiquetés Neu5Ac et les normes de Neu5Gc sont représentés dans la Figure 2. À l’aide de la méthode décrite ci-après, DMB-étiqueté Neu5Gc élue généralement entre temps d’élution 7-9 min et DMB-Neu5Ac entre 10-12 min. Plusieurs petits pics sur le chromatogramme apparaissent généralement entre 2 à 6 min. Ces pics représentent DMB n’a pas réagi et intermédiaires de réaction25<...

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Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

L’acide sialique est une monosaccharide-unité typique trouvée dans glycoconjugués. Il est impliqué dans une multitude d’interactions moléculaires et cellulaires. Nous présentons ici une méthode pour modifier l’expression de la cellule l’acide sialique surface à l’aide de glycosylation métabolique avec N- acétylmannosamine dérivés.

Glycosylation métabolique de l’acide sialique à l’aide de N-acyl-modification Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

metabolic-glycoengineering-sialic-acid-using-n-acyl-modified

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

12.6K vues.  LMU München. L’acide sialique est une monosaccharide-unité typique trouvée dans glycoconjugués. Il est impliqué dans une multitude d’interactions moléculaires et cellulaires. Nous présentons ici une méthode pour modifier l’expression de la cellule l’acide sialique surface à l’aide de glycosylation métabolique avec N- acétylmannosamine dérivés.

Vidéo: Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

À haut débit la synthèse des glucides et fonctionnalisation de nanoparticules polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Recherche

Bio-ingénierie

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) expression. These are acidic sugars that have a 9-carbon backbone and that cap vertebrate glycans on cell surfaces. Two of the major Sia forms in mammals are N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) and its hydroxylated form, N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc). Humans cannot produce endogenous Neu5Gc due to the inactivation of the gene encoding cytidine 5&#39;monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Foreign Neu5Gc is acquired by human cells through the dietary consumption of red meat and dairy and subsequently appears on diverse glycans on the cell surface, accumulating mostly on carcinomas. Consequently, humans have circulating anti-Neu5Gc antibodies that play diverse roles in cancer and other chronic inflammation-mediated diseases and that are becoming potential diagnostic and therapeutic targets. Here, we describe a high-throughput sialoglycan microarray assay to assess such anti-Neu5Gc antibodies in the human sera. Neu5Gc-containing glycans and their matched pairs of controls (Neu5Ac-containing glycans), each with a core primary amine, are covalently linked to epoxy-coated glass slides. We exemplify the printing of 56 slides in a 16-well format using a specific nano-printer capable of generating up to 896 arrays per print. Each slide can be used to screen 16 different human sera samples for the evaluation of anti-Neu5Gc antibody specificity, intensity, and diversity. The protocol describes the complexity of this robust tool and provides a basic guideline for those aiming to investigate the response to Neu5Gc dietary carbohydrate antigen in diverse clinical samples in an array format.

A sialoglycan microarray assay can be used to evaluate anti-Neu5Gc antibodies in human sera, making it a potential high-throughput diagnostic assay for cancer and other chronic inflammation-mediated human diseases.

Profilage anti-Neu5Gc IgG dans les sérums humains avec un dosage de microarray de sialoglycan

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

Sciences du comportement

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

Synthèse de chimio-enzymatique des N- glycans pour le développement de la baie et anticorps anti-VIH de profilage

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Chimie

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having multifarious bioactivities. Although chemical O-glycosylation is a commonly beneficial strategy to synthesize disaccharide nucleosides, the preparation of substrates such as glycosyl donors and acceptors requires&#160;tedious protecting&#160;group manipulations and a purification at each synthetic step. Meanwhile, several research groups have reported that boronic and borinic esters serve as a protecting or activating group of carbohydrate derivatives to achieve the regio- and/or stereoselective acylation, alkylation, silylation, and glycosylation. In this article, we demonstrate the procedure for the regioselective O-glycosylation of unprotected ribonucleosides utilizing boronic acid. The esterification of 2&#39;,3&#39;-diol of ribonucleosides with boronic acid makes the temporary protection of diol, and, following O-glycosylation with a glycosyl donor in the presence of p-toluenesulfenyl chloride and silver triflate, permits the regioselective reaction of the 5&#39;-hydroxyl group to afford the disaccharide nucleosides. This method could be applied to various nucleosides, such as guanosine, adenosine, cytidine, uridine, 5-metyluridine, and 5-fluorouridine. This article and the accompanying video represent&#160;useful (visual) information for the O-glycosylation of unprotected nucleosides and their analogs for the synthesis of not only disaccharide nucleosides, but also a variety of biologically relevant derivatives.

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Here, we present protocols for the synthesis of disaccharide nucleosides by the regioselective O-glycosylation of ribonucleosides via a temporary protection of their 2&#39;,3&#39;-diol moieties utilizing a cyclic boronic ester. This method applies to several unprotected nucleosides such as adenosine, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine, and 5-fluorouridine to give corresponding disaccharide nucleosides.

Régiosélective O- Glycosylation de nucléosides via le temporaire 2', 3'-Diol Protection par un Ester boronique pour la synthèse des nucléosides Disaccharide

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Stratégie glycomique non spécifique basée sur la protéolyse pour les glycoprotéines bactériennes

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

Stratégie glycomique non spécifique basée sur la protéolyse pour les glycoprotéines bactériennes

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

Biochimie

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Ciblage des Thiols de cystéine pour in Vitro in situ Glycosylation des protéines recombinantes

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Immunologie et infection

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. However, monoclonal antibody functionality and half-life may be reduced by the type and distribution of host-specific glycosylation. Attempts to produce superior antibodies have inspired the development of genetically modified producer cells that synthesize glyco-optimized antibodies. Glycoengineering typically requires the generation of a stable knockout or knockin cell line using methods such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9. Monoclonal antibodies produced by engineered cells are then characterized using mass spectrometric methods to determine if the desired glycoprofile has been obtained. This strategy is time-consuming, technically challenging, and requires specialists. Therefore, an alternative strategy that utilizes streamlined protocols for genetic glycoengineering and glycan detection may assist endeavors toward optimal antibodies. In this proof-of-concept study, an IgG-producing Chinese hamster ovary cell served as an ideal host to optimize glycoengineering. Short interfering RNA targeting the Fut8 gene was delivered to Chinese hamster ovary cells, and the resulting changes in FUT8 protein expression were quantified. The results indicate that knockdown by this method was efficient, leading to a ~60% reduction in FUT8. Complementary analysis of the antibody glycoprofile was performed using a rapid yet highly sensitive technique: capillary gel electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. All knockdown experiments showed an increase in afucosylated glycans; however, the greatest shift achieved in this study was ~20%. This protocol simplifies glycoengineering efforts by harnessing in silico design tools, commercially synthesized gene targeting reagents, and rapid quantification assays that do not require extensive prior experience. As such, the time efficiencies offered by this protocol may assist investigations into new gene targets.

The glycosylation pattern of an antibody determines its clinical performance, thus industrial and academic efforts to control glycosylation persist. Since typical glycoengineering campaigns are time- and labor-intensive, the generation of a rapid protocol to characterize the impact of glycosylation genes using transient silencing would prove useful.

Glycoingénierie rapide des anticorps dans les cellules ovaires du hamster chinois

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

DC dérivées de monocytes désionnels à partir de PBMC isolés à l’aide d’un traitement à la sialidase

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical characteristics, they are involved in numerous biological processes, such as modulation of the immune response, recognition of self and non-self antigens, carbohydrate-protein interactions, etc. The cellular content of sialic acid is regulated by sialidase, which catalyzes the removal of sialic acid residues. Several studies have shown that sialo-glycans are critical in monitoring immune surveillance by engaging with cis and trans inhibitory Siglec receptors on immune cells. Likewise, glyco-immune checkpoints in cancer are becoming crucial targets for developing immunotherapies. Additionally, dendritic cells (DCs) are envisioned as an important component in immunotherapies, especially in cancer research, due to their unique role as professional antigen-presenting cells (APC) and their capacity to trigger adaptive immune responses and generate immunologic memory. Nevertheless, the function of DCs is dependent on their full maturation. Immature DCs have an opposing function to mature DCs and a high sialic acid content, which further dampens their maturation level. This downregulates the ability of immature DCs to activate T-cells, leading to a compromised immune response. Consequently, removing sialic acid from the cell surface of human DCs induces their maturation, thus increasing the expression of MHC molecules and antigen presentation. In addition, it can restore the expression of co-stimulatory molecules and IL-12, resulting in DCs having a higher ability to polarize T-cells toward a Th1 phenotype and specifically activate cytotoxic T-cells to kill tumor cells. Therefore, sialic acid has emerged as a key modulator of DCs and is being used as a novel target to advance their therapeutic use. This study provides a unique approach to treat in vitro monocyte-derived DCs with sialidase, aimed at generating DC populations with different cell surface sialic acid phenotypes and tailored maturation and co-stimulatory profiles.

Pleins feux sur l’auteur : Maturation des cellules dendritiques à l’aide d’un traitement enzymatique de la surface cellulaire à base de sialidases 

A unique, comprehensive protocol to generate de-sialylated human monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a sialidase treatment is presented. Further, methods to assess the phenotypic and functional characterization of mo-DCs and evaluate how sialidase treatment improves the maturation level of mo-DCs are described.

Génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes avec différents phénotypes sialylés

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...

Glycosylation métabolique de l’acide sialique à l’aide de N-acyl-modification Mannosamines

Résumé

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