Ringraziamo L. D. Nguyen per la correzione del manoscritto e per discussioni fruttuose. Inoltre, ringraziamo J. Dernedde e H. G. Nguyen per aiutarci a preparare le riprese video. La maggior parte delle scene del video sono state girate nei laboratori di R. Tauber. Ringraziamo anche il Max Planck Institute per i colloidi e le interfacce e per averci dato libero accesso alla loro funzione di spettrometria di massa. RH è stata sostenuta dal DFG (ProMoAge).

1. preparazione dei tamponi e reagenti
<ol><li>
Preparazione della soluzione di idrossido di sodio 3 mM
	<ol>
<li>Sciogliere metossido di sodio 8,1 mg in 50 mL di metanolo (3 mM) in una bottiglia di vetro 100ml con un'ancoretta. Conservare a temperatura ambiente (TA) per diverse settimane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del tampone Tris-HCl
	<ol>
<li>Combinare 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl e 146 mg EDTA in un flacone di vetro da 100 mL con un'ancoretta e sciogliere in 80 mL di acqua.</li>
		<li>Aggiungere alla soluzione mescolando, idrossido di sodio (1 M, in acqua) o HCl (20%, in acqua) rispettando il pH con un pH-metro e regolare il pH a 8.0.</li>
		<li>Aggiungere il volume di acqua necessaria per ottenere un volume finale di 100 mL. Filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtro sterile da 0,22 µm. Nota: 100 mL di Tris-HCl buffer conterrà 150 mM NaCl, Tris-HCl 10 mM e 5 mM EDTA (pH 8.0). La soluzione può essere conservata a 4 ° C per diverse settimane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della soluzione di aprotinina
	<ol>
<li>Sciogliere aprotinina 10 mg in 1 mL di acqua (1,54 millimetri). Aliquota della soluzione di aprotinina in 10 x 1,5 mL-plastica tubi (100 µ l). Conservare a-20 ° C per diverse settimane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della soluzione leupeptina
	<ol>
<li>Sciogliere leupeptina 10 mg in 2 mL di acqua (10 mM). Aliquotare la soluzione leupeptina 10 x 1,5 mL-plastica tubi. Conservare a-20 ° C per diverse settimane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della soluzione di fluoruro (PMSF) phenylmethylsulfonyl
	<ol>
<li>Sciogliere 34,8 mg PMSF in 2 mL di etanolo (100 mM). Aliquota della soluzione PMSF in 10 x 1,5 mL-plastica tubi. Conservare a-20 ° C per diverse settimane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della soluzione di 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dicloridrato (DMB)
	<ol>
<li>Combinare 15,62 mg DMB, 352 µ l β-mercaptoetanolo e 48 µ l sodio bisolfito-soluzione (39%) e aggiungere acqua mL 9,6 (6,9 mM DMB, 500mm β-mercaptoetanolo e 0,19% sodio bisolfito). Aliquota della soluzione DMB in 40 x 1,5 mL-plastica tubi (250 µ l). Conservare al riparo dalla luce a-20 ° C per diverse settimane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione 1 M trifluoroacetico (TFA) di soluzione di acido
	<ol>
<li>770.3 µ l di 100% TFA a 9,23 mL di acqua in un tubo di plastica da 15 mL (1 M). Conservare a 4 ° C per diverse settimane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della soluzione TFA 120 mM
	<ol>
<li>µ L 92,4 TFA (100%) a 9,91 mL di acqua (120 mM) in un tubo di plastica da 15 mL. Conservare a 4 ° C per diverse settimane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 400 mM
	<ol>
<li>Sciogliere 160 mg di NaOH in 10 mL di acqua (400 mM) in un tubo di plastica da 15 mL. Conservare a 4 ° C per diverse settimane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del tampone di lisi di Western blot
	<ol>
<li>Sciogliere 5,84 g NaCl, 0,1 g Tris (idrossimetil)-aminomethan (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2e 1 g Triton-X100 in 100 mL di acqua e regolare il pH a 7,8. Conservare a 4 ° C. Aggiungere 100 µ l di ogni inibitore di proteasi (aprotinina, leupeptina e PMSF) prima di utilizzare il buffer di lisi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del buffer di sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide elettroforesi (SDS-PAGE)
	<ol>
<li>Sciogliere 0,3 g Tris, glicina 1,5 g e 0,1 g SDS in 100 mL di acqua e regolare il pH a 7,3. Conservare a RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del buffer di Western blot
	<ol>
<li>Sciogliere 0,3 g Tris, glicina 1,1 g in 90 mL di acqua e aggiungere 10 mL di etanolo. Conservare a RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della soluzione di blocco
	<ol>
<li>Sciogliere 1 g di potere di grasso del latte gratis in salino di 25 mL tamponato fosfato (PBS). Sempre preparare fresco.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sintesi di ManNProp e correlati N-acil-per volta Mannosamines
<ol><li>Sciogliere mg 431,2 mannosammina cloridrato in soluzione di idrossido di sodio 3 mM 10 mL in una bottiglia di vetro 50ml con un'ancoretta.</li>
	<li>Raffreddare la miscela sul ghiaccio a 0 ° C. Per la soluzione di agitazione, aggiungere lentamente goccia a goccia 210 µ l propionil cloruro (2,4 mmol), o 248 µ l butanoil (2,4 mmol) di sintetizzare ManNProp o ManNBut, rispettivamente. Incubare la miscela agitazione a 0 ° C per 4 h.</li>
	<li>Trasferire la soluzione in un tubo di plastica da 50 mL. Poke 4-8 fori nel coperchio del tubo di plastica con un ago sottile. Congelare rapidamente la soluzione usando azoto liquido e successivamente lyophilize (congelamento a secco) e per 48 ore o fino a quando non si è completamente asciugata.</li>
	<li>350 g gel di silice 60 si mescolano 750ml etil-acetato/metanolo/acqua (15:2:1) (si tratta di una sospensione). Riempire una colonna di vetro (35 mm di diametro e 70 cm di lunghezza) con la sospensione di gel di silice 60 e lavare la colonna preparata con un ulteriore 100 mL etil-acetato/metanolo/acqua (15:2:1) prima dell'uso.</li>
	<li>Sciogliere i secchi prodotti dal passaggio 2.3 (5g essiccato prodotto) in 10 mL di etil-acetato/metanolo/acqua (15:2:1) e carico di loro utilizzando una pipetta sulla silice gel colonna. Raccogliere le frazioni 4 mL dopo 500 mL (per ManNProp). Nota: ManNBut sarà eluire dalla colonna dopo circa 700 mL.</li>
	<li>Trasferire le frazioni eluite in tubi di plastica da 15 mL. Poke 3-6 fori nel coperchio del tubo di plastica con un ago sottile. Rapid congelare la soluzione usando azoto liquido e successivamente si lyophilize fino a quando non si è completamente asciugata. Nota: I prodotti liofilizzati possono essere memorizzati per diversi mesi a TA.</li>
	<li>Verificare la purezza dei prodotti mediante spettrometria di massa (cfr. capitolo 9). Nota: In alternativa, purezza può essere verificata anche da 1H a risonanza magnetica nucleare (NMR).</li>
</ol>3. coltura cellulare
<ol><li>Cellule di neuroblastoma di Kelly di cultura in mezzo di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenente 10% siero bovino fetale, 100 U penicillina, streptomicina 100 mg, 2 mM L-Glutammina contenente 5 mM ManNAc, 5mm ManNProp o 5 mM ManNBut, a 37 ° C e 5% CO2. Nota: Le cellule coltivate in medium senza ManNAc o i suoi analoghi sono utilizzate come controllo.</li>
	<li>
Prima dell'applicazione della mannosamines, staccare le cellule di neuroblastoma Kelly incubando li per 10 min con tripsina/EDTA (0,25%, 0,02% in PBS) e contare utilizzando un contatore di Neubauer-camera o cella. Le cellule a numeri definiti in base alla dimensione del piatto/piatto del seme.
	<ol>
<li>Per misurare l'acido sialico monosaccaridi, seme 1 x 105 cellule nel mezzo di 500 µ l in una piastra di coltura del tessuto 48 pozzetti. Per l'analisi degli acidi polisialico, seme 1 x 106 cellule in 3 mL di terreno su una piastra di coltura cellulare di diametro 6 cm. Incubare a 37 ° C e 5% CO2. Sostituire il mezzo ogni 24 ore. Nota: L'effetto di MGE aumenta con il tempo totale di trattamento. Per alta efficienza metabolica trattare le cellule per 5-7 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dopo il trattamento, decantare il mezzo. Lavare i piatti/piatti con PBS. Staccare le cellule incubando li per 10 min con tripsina/EDTA (0,25%, 0,02% in PBS). Neutralizzare la tripsina aggiungendo lo stesso volume di terreno di coltura delle cellule alle cellule indipendente. Trasferire le cellule indipendente in tubi di plastica da 15 mL. Centrifugare i campioni per 3 min a 500 x g e scartare il surnatante.
	<ol>
<li>Aggiungere 5 mL PBS e centrifuga celle (Vedi punto 3.3). Ripetere il lavaggio due volte. Nota: Il pellet cellulare lavato senza surnatante possa essere memorizzato a-20 ° C per diversi giorni. Se l'espressione di acido polisialico deve essere delucidato continuare alla sezione 10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cellula Lisi per l'analisi HPLC
<ol><li>
Preparazione del tampone di lisi HPLC
	<ol>
<li>Combinare il buffer di 5 mL di Tris-HCl, 5 µ l di soluzione di aprotinina, 20 µ l di soluzione di leupeptina e 50 µ l di soluzione PMSF. Nota: 5 mL di tampone di lisi HPLC conterrà 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 aprotinina µM, 40 µM leupeptina e 1 mM PMSF (pH 8.0). Questo buffer dovrebbe sempre essere preparato freschi prima della lisi cellulare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare raccolti (punto 3.3) ogni in 500 µ l ghiacciata HPLC-tampone di lisi e ultra-Sonicare i campioni con un ago di processore ultra-sonico tre volte per un periodo di 30 s a medio-alte ampiezze. Raffreddare i campioni su ghiaccio per almeno 1 min tra i cicli.</li>
</ol>5. la separazione della frazione della membrana
<ol><li>Centrifugare i campioni lisati cellulari per 2 h a 20.000 x g e a 4 ° C. Separare il surnatante (circa 480 µ l), che rappresentano proteine citosoliche, in tubi di plastica da 1,5 mL. Determinare la concentrazione di proteina di queste frazioni utilizzando, ad esempio, il Bradford o il dosaggio (BCA) acido bicinconinico. Nota: La concentrazione di proteina (circa 1 mg/mL) delle frazioni citosoliche più tardi può essere correlata agli importi misurati delle specie rispettato acido sialico. Il pellet rappresenta la frazione di membrana, che viene utilizzata nel passaggio 6.1.</li>
</ol>6. acido idrolisi
Nota: Oligo - e polisaccaridi nelle membrane cellulari sono idrolizzati a monosaccaridi. Inoltre, possibile O-modifiche nei monosaccaridi sono idrolizzate, pure. Ciò è necessario per l'analisi HPLC quantitativa, perché la stragrande maggioranza degli acidi sialici nelle frazioni della membrana è naturalmente incorporata nei glycoconjugates e potrebbe possibilmente bear O-acetile o O- lactolyl modifiche.
<ol><li>Aggiungere 150 µ l 1 M TFA-soluzione per le frazioni di membrana separati (pellet dalla sezione 5). Incubare i campioni per 4 h a 80 ° C con agitazione a 200-600 giri/min.</li>
	<li>Centrifugare i campioni per circa 30 min a 20.000 x g e 21 ° C, utilizzando tubi filtro 0,5 mL con 3 membrane di esclusione di kDa, fino a quando il volume di fase superiore è meno di 20 µ l. Nota: Questo passaggio è importante smaltire detriti molecolare più elevato.</li>
	<li>Trasferire la fase inferiore contenenti molecole più piccole, comprese le specie di acido sialico, in tubi di plastica di 2 mL. Poke 2-4 fori nei tappi dei tubi in plastica con un ago sottile. Rapid congelare i campioni utilizzando azoto liquido e poi li lyophilize durante la notte. Nota: I campioni essiccati possono essere conservati per diversi giorni a RT. Sostituisci un cappuccio senza fori per archiviazione a lungo.</li>
</ol>7. fluorescente etichettatura
<ol><li>Risospendere i campioni essiccati in soluzione TFA di 10 µ l 120 mM e aggiungere 50 µ l di soluzione DMB. Trasferire i campioni in provette scuro 1,5 mL per proteggerli dai raggi ultravioletti.</li>
	<li>Per gli standard, sciogliere 1 µ l Neu5Ac (60 ng/mL, in acqua) o 1 µ l Neu5Gc (60 ng/mL, in acqua) in soluzione di TFA mM 120 µ l 10 provette scuro 1,5 mL. Aggiungere 50 µ l di soluzione DMB.</li>
	<li>Incubare i campioni di membrana delle cellule e gli standard per 1,5 h a 56 ° C al riparo dalla luce. Dopo l'incubazione, aggiungere 4 µ l 400 mM della soluzione di NaOH per ogni campione per arrestare la reazione d'etichettatura.</li>
</ol>8. analisi HPLC
Nota: Con etichettati campioni vengono analizzati su un sistema HPLC equipaggiato con una colonna C18 RP (110 Å, dimensione delle particelle di 3 µm, 4.6 x 150 mm), un rivelatore a fluorescenza e un collezionista di frazione. I solventi utilizzati sono metanolo, acetonitrile e acqua. Assicurarsi di degassare tutti i solventi prima le misurazioni, se il sistema HPLC manca un degasatore interna.
<ol><li>Impostare la temperatura della colonna a 40 ° C e configurare il rivelatore a fluorescenza con 373 nm per l'eccitazione e 448 nm per l'emissione, rispettivamente. Iniettare 10 µ l di campione e separare le sonde per 50 min a 0,5 mL/min di portata con metanolo/acetonitrile/acqua (6:8:86) come eluente. Per l'analisi di spettrometria di massa, raccogliere i picchi di interesse. Nota: Neu5Gc è previsto di eluato dopo 6-8 min, Neu5Ac dopo 9-12 min, Neu5Prop dopo 17-23 min e Neu5But dopo 38-44 min. I campioni frazionati possono essere conservati per diverse ore a 4 ° C al riparo dalla luce.</li>
	<li>Dopo la misurazione ogni campione, lavare la colonna per 7,5 min a portata di 1,0 mL/min (volumi di colonna 1,5 ≈) con metanolo/acetonitrile/acqua (6:25:69) e riequilibrare il sistema per 7,5 min a 1,0 mL/min di portata con metanolo/acetonitrile/acqua (6:8:86).</li>
	<li>Per l'analisi quantitativa, calcolare l'area sotto la curva dei picchi di interesse utilizzando il software operativo del rispettivo sistema HPLC22acido sialico. Nota: I dati ottenuti possono essere correlati per il Neu5Ac o lo standard di Neu5Gc e per le concentrazioni di proteina misurati nelle frazioni citosoliche (vedere paragrafo 5.1).</li>
</ol>9. spettrometria totale analisi di acido sialico monosaccaridi
Nota: Picchi di ritenzione HPLC di interesse possono essere ulteriormente analizzati tramite spettrometria di massa di cromatografia liquida (LC)-elettrospray (ESI-MS), al fine di verificare le specie di acido sialico innaturale.
<ol><li>Per l'analisi di spettrometria di massa, iniettare 20 µ l di campione raccolto in un sistema rivelatore selettivo LC/massa (MSD) con 79,9% metanolo, alcool isopropilico al 20% e 0,1% acido formico come eluente, portata 0,5 mL/min, 4 kV tensione capillare e 350 ° C di temperatura capillare 22 , 23.</li>
	<li>Il software di valutazione del rispettivo sistema LC/MSD, selezionare il picco di interesse nel cromatogramma totale dello ione. Mostra lo spettro di massa del picco risolto. Visualizzare il rapporto massa/carica positiva tra 300 e 700. Nota: DMB etichettatura degli acidi sialici conduce ad un aumento della massa molecolare di 116,2 g/mol. Le specie di DMB-etichettati acido sialico hanno le masse molecolari seguenti: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441,8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436,2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/PM comune addotti sono acetonitrile, sodio o alcool isopropilico.</li>
</ol>10. Western Blot analisi di acido polisialico in cellule di Neuroblastoma di Kelly
<ol><li>
Preparazione dei lisati cellulari
	<ol>
<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lisi Western blot per il pellet cellulare dalla fase 3.3 e vortice. Incubare per 30 min in ghiaccio. Vortice ogni 5 min. Centrifugare i campioni per 1,5 h a 20.000 x g e a 4 ° C. Raccogliere il surnatante contenente le proteine dalle cellule lisate.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di proteina le frazioni di proteine, per esempio, il Bradford o il dosaggio BCA. Diluire i campioni ad una concentrazione di proteina di 1,5 µ g / µ l di tampone di lisi.</li>
		<li>Preparare i campioni per la SDS-PAGE con l'aggiunta di tampone di Laemmli 10 µ l dei campioni alla frazione di proteina 90 µ l (1,5 µ g / µ l) e far bollire il campione per 5 min24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunoblotting
	<ol>
<li>Utilizzare gel SDS-acrilammide 8% con 20-30 µ l tasche e 0,75 o 1 mm di spessore. Esegua il gel a 25 mA per 2 h a TA.</li>
		<li>Rimuovere attentamente la copertura di vetro dal gel. Tagliare ed eliminare la parte superiore del gel contenente le tasche di caricamento. Collocare il gel su una membrana di nitrocellulosa (0,2 µm), precedentemente ammollato nel buffer di Western blot. Trasferire le proteine alla nitrocellulosa secondo la raccomandazione del sistema (ad es., 250 mA per 1 h a 4 ° C).</li>
		<li>Rimuovere la membrana di nitrocellulosa dal sistema macchiante. Macchia la macchia con Ponceau rosso per visualizzare le proteine. Trasferire la membrana di nitrocellulosa in un alloggiamento di plastica e aggiungere 10 mL di soluzione di blocco. Incubare per 1 h a RT o durante la notte a 4 ° C.</li>
		<li>Decantare la soluzione bloccante e aggiungere dell'anticorpo monoclonale anti-polySia 735 (1 µ g/mL) in PBS. Incubare la membrana per 1h a RT o durante la notte a 4 ° C. Dopo l'incubazione, lavare la membrana almeno tre volte per 5 min con PBS.</li>
		<li>Aggiungere policlonale anticorpo secondario di IgG anti-topo (1 µ g/mL) accoppiato alla perossidasi di rafano (HRP) o un'etichetta fluorescente in PBS. Incubare la membrana per 1 h a TA. Dopo l'incubazione, lavare la membrana almeno tre volte per 5 min con PBS.</li>
		<li>Trasferire la membrana su un piatto di un imager appropriato. Rilevare il segnale secondo le istruzioni del produttore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Se i derivati chimicamente sintetizzati di ManNAc, ManNProp e ManNBut vengono analizzati tramite spettrometria di massa, solo il picco di massa corretto per entrambi gli esemplari deve essere identificato. Di conseguenza, i prodotti possono essere presupposto per avere una purezza superiore al 99%. Piccole quantità di Neu5Gc, che normalmente non viene trovato in cellule umane29, vengono rilevati nelle frazioni della membrana delle cellule lisate. Questo si verifica più probabilmente attraverso u...

Acido sialico è un monosaccaride che è reperibile in genere le estremità non riducente dei glicoconiugati, quali N- e O- glicani o glicolipidi. Tra tutti i monosaccaridi, acido sialico ha alcune caratteristiche chimiche uniche. Ha una spina dorsale C-atomo 9, un gruppo carbossilico in posizione C-1, che è deprotonato e quindi negativamente caricate sotto condizioni fisiologiche e una funzione amminica nella posizione C-5. Anche se oltre 50 varianti di acido sialico naturali sono stati caratterizzati a data1, la forma predominante di acido sialico trovato in esseri umani è acido N- acetilneuraminico (Neu5Ac). Altri mammiferi anche esprimono una maggiore quantità di N- glycolylneuraminic acido (Neu5Gc)2,3.
Grazie alla sua posizione esposta nei glycoconjugates, acido sialico è coinvolto in una pletora di interazioni recettore-ligando, ad esempio, l'associazione dipendente emagglutinina del virus dell'influenza a host cellule4. Un epitopo di acido sialico con importanti funzioni biologiche, soprattutto durante l'embriogenesi e nel sistema nervoso, è l'acido polisialico. Acido polisialico è un polimero di fino a 200 2,8-collegato sialico acidi alfa. Il vettore di proteina principale di acido polisialico è la molecola di adesione neurale delle cellule (NCAM). Espressione di acido polisialico modula le proprietà adesive di NCAM in quanto espressione acido polisialico diminuisce l'adesione e aumenta la plasticità con il sistema nervoso5.
Cambiamenti nell'espressione di acido sialico (poli) influirà in definitiva una moltitudine di interazioni biologiche diverse. Questo può essere utilizzato per studiare processi dipendenti noto acido sialico a livello molecolare, per scoprire nuovi glicoconiugati interazioni, o esplorare i possibili approcci terapeutici. Ci sono diversi metodi disponibili da cui l'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule può essere modulata, ad esempio il trattamento con acido sialico specifiche glicosidasi (sialidasi), inibizione di enzimi coinvolti nella biosintesi di acido sialico6 ,7,8, o di abbattere o cambiare l'espressione dell'enzima chiave della biosintesi di acido sialico9.
Un altro metodo versatile per modulare l'espressione di acido sialico è MGE (ingegneria conosciuto anche come metabolica oligosaccaride, MOE). Nel presente documento, cellule, tessuti o anche gli animali sono trattati con derivati non naturali della ManNAc che recano modifiche C2-amminico. Essendo molecole precursori dell'acido sialico, dopo l'assorbimento cellulare, questi analoghi ManNAc sono unidirezionale metabolizzato a non naturali sialico acidi e possono essere espressa su sialilato glicoconiugati. Le cellule trattate con derivati di ManNAc portando alifatiche C2-modifiche, come ManNProp o ManNBut, incorporare N- propionylneuraminic (Neu5Prop) o N- butanoylneuraminic acido (Neu5But) nel loro glicoconiugati10 , 11. utilizzando gruppi funzionali introdotti alla C2-posizione della ManNAc, gli acidi di sialico non naturali che si verificano possono essere accoppiati, per esempio, tramite la legatura di Staudinger o l'azide alkine cicloaddizione, con le tinture fluorescenti e pertanto visualizzate sulla superficie delle cellule12.
L'espressione di questi acidi sialici non naturali ha intriganti effetti su molti processi biologici, tra cui infezioni da agenti patogeni, l'adesione e la migrazione di cellule tumorali, adesione cellulare generale, come pure vascolarizzazione e differenziazione (per revisione vedere: Wratil et al. 13). interessante, MGE con N-acil per volta mannosamines può essere utilizzato anche per interferire con l'espressione di acido polisialico. Acido polisialico è generato da due differenti polysialyltransferases (ST8SiaII e ST8SiaIV). È stato dimostrato, che polysialyltransferase ST8SiaII è inibita da precursori di acido sialico innaturali, come ad esempio ManNProp o ManNBut14,15. Inoltre, è stato dimostrato in cellule umane di neuroblastoma che ManNProp o ManNBut applicazione riduce anche sialylation in totale15.
MGE con N-acil per volta mannosamines è un facile da applicare il metodo che è stato utilizzato con successo, non solo in coltura delle cellule dei batteri ma anche nell'intero animali di specie diverse, ad esempio Caenorhabditis elegans16e mammiferi zebrafish17, o topi18,19,20,21. Soprattutto i derivati di ManNAc recanti modifiche alifatiche, compreso ManNProp e ManNBut, sono modo trascurabile citotossici, anche alle concentrazioni millimolar in terreno di coltura delle cellule o plasma sanguigno. Inoltre, sono relativamente facili da sintetizzare.
Qui, forniamo i dettagli su come utilizzare MGE con N-acetile per volta mannosamines. In primo luogo, la sintesi chimica di due dei derivati ManNAc più ampiamente usati in questo campo, ManNProp e ManNBut, è spiegata. Successivamente, vi mostriamo come MGE può essere applicata in un esperimento in vivo . Ad esempio, la linea cellulare di neuroblastoma Kelly è stato scelto per dimostrare la diminuita espressione dell'epitopo polisialico mediante Western blot dopo il trattamento con i derivati di ManNAc. Gli acidi sialici non naturali sulla superficie delle cellule sono stati quantificati da HPLC e ulteriormente analizzati tramite spettrometria di massa.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92110411</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>75 ml tissue culture flasks</td><td>Greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>X986.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Serva</td><td>37190.03</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td><td>VWR</td><td>SDS Gel/Blot</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Roth</td><td>3019.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein ladder</td><td>Fisher Scientific</td><td>267620</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau red</td><td>Roth</td><td>5938.2</td><td></td></tr><tr><td>Milk powder</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBLUF 0500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4784-50MG</td><td></td></tr><tr><td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS3548-100EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-10MG</td><td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td></tr><tr><td>Butyryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109614-250G</td><td></td></tr><tr><td>C18 RP column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4435-E0</td><td>110 &amp;Aring;, 3 &amp;micro;m particle size, 4.6 x 150 mm</td></tr><tr><td>D-Mannosamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4670-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56302-50ML-GL</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>36.5-38.0%, in water</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl-Roth</td><td>T169.2</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>N-Acetyl-D-mannosamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8176-250MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0812-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Glycolylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9793-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Propionyl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P51559-500G</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td><td>Eppendorf</td><td>30120191</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bisulfite solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13438-1L-R-D</td><td>40%, in water</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319511-500ML</td><td>1.0 M, in water</td></tr><tr><td>Sodium methoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164992-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-100ML-D</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-019100</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Carl-Roth</td><td>T905.1</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Silica Gel 60</td><td>Carl-Roth</td><td>9779.1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSD-System</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

Acido sialico (Sia) è un costituente importante di glicoconiugati, quali N- e O- glicani o glicolipidi. Grazie alla sua posizione presso le estremità non riducente di oligo - e polisaccaridi, come pure le sue caratteristiche chimiche uniche, acido sialico è coinvolto in una moltitudine di interazioni recettore-ligando diverso. Modificando l'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule, interazioni acido sialico-dipendente di conseguenza saranno influenzati. Questo può essere utile per indagare le interazioni acido sialico-dipendente e ha il potenziale per influenzare determinate malattie in modo benefico. Via metabolica glycoengineering (MGE), l'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule può essere modulata. Nel presente documento, cellule, tessuti o addirittura interi animali sono trattati con derivati C2-modificati del N- monosaccaridico (ManNAc). Questi zuccheri amminici fungere da molecole di acido sialico precursore e pertanto sono metabolizzati della corrispondente specie di acido sialico ed espressi sulla glycoconjugates. L'applicazione di questo metodo produce effetti intriganti su vari processi biologici. Ad esempio, e può drasticamente ridurre l'espressione di acido polisialico (polySia) in cellule di un neurone trattate e quindi colpisce differenziazione e crescita neuronale. Qui, indichiamo la sintesi chimica di due dei più comuni C2-modificato N- acilmannosammina derivati, N- propionylmannosamine (ManNProp) così come N- butanoylmannosamine (ManNBut) e ulteriormente mostrano come questi non-naturali aminici possono essere applicati in esperimenti della coltura cellulare. L'espressione di acido sialico modificato specie è quantificata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e ulteriormente analizzato tramite spettrometria di massa. Gli effetti sull'espressione acido polisialico sono chiariti tramite Western blot usando un anticorpo acido polisialico commercialmente disponibili.

Cromatogrammi HPLC di fluorescente etichettati Neu5Ac e gli standard di Neu5Gc sono rappresentati in Figura 2. Utilizzando il metodo qui descritto, Neu5Gc DMB-labeled eluisce in genere tra 7-9 min tempo di eluizione e DMB-Neu5Ac tra 10-12 min. Parecchi più piccoli picchi nel cromatogramma appaiono in genere tra 2-6 min. Questi picchi rappresentano non reagito DMB e reazione intermedi25.
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Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Acido sialico è una tipica unità di monosaccaride trovata nei glycoconjugates. È coinvolto in una pletora di interazioni cellulari e molecolari. Qui presentiamo un metodo per modificare l'espressione di superficie acido sialico cellulare utilizzando glycoengineering metabolica con N- monosaccaridico derivati.

Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando N-acil-per volta Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

12.6K Views.  LMU München. Acido sialico è una tipica unità di monosaccaride trovata nei glycoconjugates. È coinvolto in una pletora di interazioni cellulari e molecolari. Qui presentiamo un metodo per modificare l'espressione di superficie acido sialico cellulare utilizzando glycoengineering metabolica con N- monosaccaridico derivati.

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High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

High-throughput sintesi dei carboidrati e funzionalizzazione di nanoparticelle polianidride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Ricerca

Bioingegneria

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) expression. These are acidic sugars that have a 9-carbon backbone and that cap vertebrate glycans on cell surfaces. Two of the major Sia forms in mammals are N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) and its hydroxylated form, N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc). Humans cannot produce endogenous Neu5Gc due to the inactivation of the gene encoding cytidine 5&#39;monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Foreign Neu5Gc is acquired by human cells through the dietary consumption of red meat and dairy and subsequently appears on diverse glycans on the cell surface, accumulating mostly on carcinomas. Consequently, humans have circulating anti-Neu5Gc antibodies that play diverse roles in cancer and other chronic inflammation-mediated diseases and that are becoming potential diagnostic and therapeutic targets. Here, we describe a high-throughput sialoglycan microarray assay to assess such anti-Neu5Gc antibodies in the human sera. Neu5Gc-containing glycans and their matched pairs of controls (Neu5Ac-containing glycans), each with a core primary amine, are covalently linked to epoxy-coated glass slides. We exemplify the printing of 56 slides in a 16-well format using a specific nano-printer capable of generating up to 896 arrays per print. Each slide can be used to screen 16 different human sera samples for the evaluation of anti-Neu5Gc antibody specificity, intensity, and diversity. The protocol describes the complexity of this robust tool and provides a basic guideline for those aiming to investigate the response to Neu5Gc dietary carbohydrate antigen in diverse clinical samples in an array format.

A sialoglycan microarray assay can be used to evaluate anti-Neu5Gc antibodies in human sera, making it a potential high-throughput diagnostic assay for cancer and other chronic inflammation-mediated human diseases.

Profilare IgG anti-Neu5Gc in Sera umana con un assaggio microarray di Sialoglycan

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

Comportamento

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Chimica

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having multifarious bioactivities. Although chemical O-glycosylation is a commonly beneficial strategy to synthesize disaccharide nucleosides, the preparation of substrates such as glycosyl donors and acceptors requires&#160;tedious protecting&#160;group manipulations and a purification at each synthetic step. Meanwhile, several research groups have reported that boronic and borinic esters serve as a protecting or activating group of carbohydrate derivatives to achieve the regio- and/or stereoselective acylation, alkylation, silylation, and glycosylation. In this article, we demonstrate the procedure for the regioselective O-glycosylation of unprotected ribonucleosides utilizing boronic acid. The esterification of 2&#39;,3&#39;-diol of ribonucleosides with boronic acid makes the temporary protection of diol, and, following O-glycosylation with a glycosyl donor in the presence of p-toluenesulfenyl chloride and silver triflate, permits the regioselective reaction of the 5&#39;-hydroxyl group to afford the disaccharide nucleosides. This method could be applied to various nucleosides, such as guanosine, adenosine, cytidine, uridine, 5-metyluridine, and 5-fluorouridine. This article and the accompanying video represent&#160;useful (visual) information for the O-glycosylation of unprotected nucleosides and their analogs for the synthesis of not only disaccharide nucleosides, but also a variety of biologically relevant derivatives.

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Here, we present protocols for the synthesis of disaccharide nucleosides by the regioselective O-glycosylation of ribonucleosides via a temporary protection of their 2&#39;,3&#39;-diol moieties utilizing a cyclic boronic ester. This method applies to several unprotected nucleosides such as adenosine, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine, and 5-fluorouridine to give corresponding disaccharide nucleosides.

Regioselettiva O- glicosilazione dei nucleosidi tramite il temporaneo 2', 3'-diolo protezione da boronico per la sintesi di disaccaride nucleosidi

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Strategia glicomica aspecifica basata sulla proteolisi per glicoproteine batteriche

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

Strategia glicomica aspecifica basata sulla proteolisi per glicoproteine batteriche

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

Biochimica

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Targeting dei tioli cisteina per in Vitro site-specific glicosilazione delle proteine ricombinanti

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Immunologia e infezioni

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. However, monoclonal antibody functionality and half-life may be reduced by the type and distribution of host-specific glycosylation. Attempts to produce superior antibodies have inspired the development of genetically modified producer cells that synthesize glyco-optimized antibodies. Glycoengineering typically requires the generation of a stable knockout or knockin cell line using methods such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9. Monoclonal antibodies produced by engineered cells are then characterized using mass spectrometric methods to determine if the desired glycoprofile has been obtained. This strategy is time-consuming, technically challenging, and requires specialists. Therefore, an alternative strategy that utilizes streamlined protocols for genetic glycoengineering and glycan detection may assist endeavors toward optimal antibodies. In this proof-of-concept study, an IgG-producing Chinese hamster ovary cell served as an ideal host to optimize glycoengineering. Short interfering RNA targeting the Fut8 gene was delivered to Chinese hamster ovary cells, and the resulting changes in FUT8 protein expression were quantified. The results indicate that knockdown by this method was efficient, leading to a ~60% reduction in FUT8. Complementary analysis of the antibody glycoprofile was performed using a rapid yet highly sensitive technique: capillary gel electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. All knockdown experiments showed an increase in afucosylated glycans; however, the greatest shift achieved in this study was ~20%. This protocol simplifies glycoengineering efforts by harnessing in silico design tools, commercially synthesized gene targeting reagents, and rapid quantification assays that do not require extensive prior experience. As such, the time efficiencies offered by this protocol may assist investigations into new gene targets.

The glycosylation pattern of an antibody determines its clinical performance, thus industrial and academic efforts to control glycosylation persist. Since typical glycoengineering campaigns are time- and labor-intensive, the generation of a rapid protocol to characterize the impact of glycosylation genes using transient silencing would prove useful.

Glicoingegneria anticorpale rapida nelle cellule ovariche di criceto cinese

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

DC derivate da monociti de-siaalilati da PBMC isolate utilizzando il trattamento con sialidasi

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical characteristics, they are involved in numerous biological processes, such as modulation of the immune response, recognition of self and non-self antigens, carbohydrate-protein interactions, etc. The cellular content of sialic acid is regulated by sialidase, which catalyzes the removal of sialic acid residues. Several studies have shown that sialo-glycans are critical in monitoring immune surveillance by engaging with cis and trans inhibitory Siglec receptors on immune cells. Likewise, glyco-immune checkpoints in cancer are becoming crucial targets for developing immunotherapies. Additionally, dendritic cells (DCs) are envisioned as an important component in immunotherapies, especially in cancer research, due to their unique role as professional antigen-presenting cells (APC) and their capacity to trigger adaptive immune responses and generate immunologic memory. Nevertheless, the function of DCs is dependent on their full maturation. Immature DCs have an opposing function to mature DCs and a high sialic acid content, which further dampens their maturation level. This downregulates the ability of immature DCs to activate T-cells, leading to a compromised immune response. Consequently, removing sialic acid from the cell surface of human DCs induces their maturation, thus increasing the expression of MHC molecules and antigen presentation. In addition, it can restore the expression of co-stimulatory molecules and IL-12, resulting in DCs having a higher ability to polarize T-cells toward a Th1 phenotype and specifically activate cytotoxic T-cells to kill tumor cells. Therefore, sialic acid has emerged as a key modulator of DCs and is being used as a novel target to advance their therapeutic use. This study provides a unique approach to treat in vitro monocyte-derived DCs with sialidase, aimed at generating DC populations with different cell surface sialic acid phenotypes and tailored maturation and co-stimulatory profiles.

Autore in primo piano: Maturazione delle cellule dendritiche mediante trattamento enzimatico della superficie cellulare a base di sialidasi 

A unique, comprehensive protocol to generate de-sialylated human monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a sialidase treatment is presented. Further, methods to assess the phenotypic and functional characterization of mo-DCs and evaluate how sialidase treatment improves the maturation level of mo-DCs are described.

Generazione di cellule dendritiche derivate da monociti con diversi fenotipi sialilati

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...

Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando N-acil-per volta Mannosamines

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