Biz L. ö Nguyen için el yazması yazım denetleme ve verimli tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca, biz J. Dernedde ve H. G. Nguyen video çekimi hazırlanıyor bize yardımcı olduğunuz için teşekkür ederiz. Çoğu sahneleri video R. Tauber laboratuvarlarda çekildi. Ayrıca Max Planck Enstitüsü Kolloidler ve arabirimleri ile ilgili ve bize kütle spektrometresi tesislerini ücretsiz erişim verdiğiniz için teşekkür ederiz. RH DFG (ProMoAge) tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlanması arabellekleri ve Kimyasalları
<ol><li>
3 mM sodyum methoxide çözüm hazırlanması
	<ol>
<li>8.1 mg sodyum methoxide 50 mL metanol (3 mM) içinde bir heyecan çizgiyle 100 mL cam şişede geçiyoruz. Oda sıcaklığında (RT) birkaç hafta için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tris-HCl tampon hazırlanması
	<ol>
<li>8.766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl ve 146 mg 100 mL cam şişe içinde EDTA bir heyecan bar ile birleştirin ve 80 mL suda çözülür.</li>
		<li>Sodyum hidroksit (suda 1 M) veya HCl (suda %20) karıştırma, pH metre ile pH kesilmediğini gözleyerek ekleyin ve 8,0 pH ayarlayın.</li>
		<li>100 mL son hacmi elde etmek için gereken su hacmi ekleyin. 0,22 µm steril filtre sistemi kullanarak çözüm filtre. Not: 100 mL Tris-HCl tampon 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl ve 5 mM EDTA (pH 8.0) içerir. Çözüm 4 ° C'de birkaç hafta saklanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aprotinin çözüm hazırlanması
	<ol>
<li>10 mg aprotinin (1.54 mM) 1 mL suda çözülür. Aliquot 10 x 1,5 mL-plastik tüpler (100 µL her) aprotinin çözümde. -20 ° C'de birkaç hafta için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leupeptin çözüm hazırlanması
	<ol>
<li>10 mg leupeptin (10 mM) 2 mL suda çözülür. Aliquot leupeptin çözüm 10 x 1,5 mL-plastik tüpler. -20 ° C'de birkaç hafta için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) çözüm hazırlanması
	<ol>
<li>34.8 mg PMSF 2 mL etanol (100 mM) geçiyoruz. Aliquot PMSF çözüm 10 x 1,5 mL-plastik tüpler içinde. -20 ° C'de birkaç hafta için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB) çözüm hazırlanması
	<ol>
<li>15.62 mg DMB, 352 µL β-mercaptoethanol ve 48 µL Sodyum bisülfit-çözüm (% 39) birleştirin ve 9,6 mL su (6,9 mM DMB, 500 mM β-mercaptoethanol ve %0.19 Sodyum bisülfit) ekleyin. Aliquot 40 x 1,5 mL-plastik tüpler (250 her µL) DMB çözümde. Mağaza için birkaç hafta ışık-20 ° C'de korunuyorsunuz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 M trifluoroacetic asit (TFA) çözüm hazırlanması
	<ol>
<li>% 100 770.3 µL eklemek TFA bir 15 mL plastik tüp (1 M) 9,23 mL su için. Birkaç hafta için 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
120 mM TFA çözüm hazırlanması
	<ol>
<li>92,4 µL TFA (% 100) 9.91 mL suda 15 mL plastik tüp (120 mM) ekleyin. Birkaç hafta için 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
400 mM sodyum hidroksit (NaOH) çözüm hazırlanması
	<ol>
<li>160 mg 15 mL plastik tüp 10 mL su (400 mM) NaOH geçiyoruz. Birkaç hafta için 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Western blot lizis arabellek hazırlanması
	<ol>
<li>Dağıtılması 5,84 g NaCl, 0.1 g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 0.1 g CaCl2, 0.95 g MgCl2ve 1 g Triton-X100 100 ml su ve pH 7.8 için ayarlayın. 4 ° C'de mağaza Her proteaz inhibitörü (aprotinin, leupeptin ve PMSF) 100 µL lizis arabellek kullanmadan önce ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) arabellek hazırlanması
	<ol>
<li>0.3 g Tris, 1.5 g glisin ve 0.1 g SDS 100 mL suda çözülür ve pH 7,3 için ayarlayın. Mağazada RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Western blot arabellek hazırlanması
	<ol>
<li>0.3 g Tris, 1.1 g glisin 90 mL suda çözülür ve 10 mL etanol ekleyin. Mağazada RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hazırlık çözüm engelleme
	<ol>
<li>Yağlı ücretsiz süt güç 25 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 g geçiyoruz. Her zaman taze hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ManNProp ve ilgili Nsentezi-asil-Mannosamines modifiye
<ol><li>431.2 mg mannosamine hidroklorid çözümde 10 mL 3 mM sodyum methoxide 50 mL cam şişe bir heyecan çizgiyle geçiyoruz.</li>
	<li>Buz 0 ° c üzerinde karışımı serin Karıştırma, yavaş yavaş dropwise 210 µL propionyl klorür (2.4 mmol) veya ManNProp veya ManNBut, sırasıyla sentez 248 µL butanoyl klorür (2.4 mmol) ekleyin. 0 ° C 4 h için karıştırma karisimin kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm 50 mL plastik tüpün içine aktarın. 4-8 delik plastik tüp kapağı ince bir iğne ile poke. Hızla sıvı nitrojen kullanarak çözüm donma ve daha sonra lyophilize (dondurma kuru) bu 48 h veya kadar tamamen kurudu.</li>
	<li>350 g silikon jel 60 750 mL Etil-asetat/metanol / (Bu bir süspansiyon) mix su ile (15:2:1). Bir cam sütun (35 mm çap ve 70 cm uzunluk) silika jel 60 süspansiyon ile doldurun ve bir ek 100 mL Etil asetat/metanol/su (15:2:1) ile hazırlanmış sütun kullanmadan önce yıkayın.</li>
	<li>Adım 2.3 kurutulmuş Urun dağıtılması (5 g kurutulmuş ürün) 10 mL Etil asetat/metanol/su (15:2:1) ve yük bir pipet silis üzerine kullanarak sütun jel. 4 mL kesirler sonra 500 mL (ManNProp için) toplamak. Not: ManNBut sütundan sonra yaklaşık 700 mL elute.</li>
	<li>Eluted kesirler 15 mL plastik tüpler içine aktarın. 3-6 delik plastik tüp kapağı ince bir iğne ile poke. Hızlı sıvı nitrojen kullanarak çözüm donma ve daha sonra tamamen kurudu kadar lyophilize. Not: Lyophilized ürünleri RT. birkaç ay depolanabilir</li>
	<li>Saflık Ürünler Kütle spektrometresi (bakınız Bölüm 9) doğrulayın. Not: Alternatif olarak, saflık da 1tarafından H Nükleer manyetik rezonans (NMR) doğrulanabilir.</li>
</ol>3. hücre kültürü
<ol><li>Kültür Kelly Nöroblastom Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta % 10 fetal sığır serum, 100 U penisilin, 100 mg streptomisin, 2 mM L-glutamin içeren 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp veya 5 mM ManNBut, 37 ° C ve % 5 CO2içeren hücrelerde. Not: Orta ManNAc veya kendi analogları olmadan kültürlü hücreler bir denetim olarak kullanılır.</li>
	<li>
Mannosamines uygulanması önce onları tripsin/EDTA (% 0.25, %0.02, PBS) ile 10 min için kuluçka Kelly Nöroblastom hücre bağlantısını kesin ve Neubauer-odası veya hücre sayaç saymak. Tohum hücreleri tanımlanmış numaralarından plaka/çanak boyutuna bağlı.
	<ol>
<li>Sialik asit bol ölçmek için 1 x 105 500 µL orta hücrelerde bir 48-iyi doku kültürü tabak tohum. Polysialic asitler analiz için 1 x 106 6 cm çapında hücre kültür çanak 3 mL ortamına hücrelerde tohum. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya. Her 24 h orta yerine. Not: Tedavi toplam süresi ile MGE etkisini artırır. Yüksek metabolik verimlilik için 5-7 gün için hücreleri tedavi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kullanımdan sonra orta dikkatle boşaltmak. PBS ile plakalar/bulaşıkları yıkamak. Hücreleri onları tripsin/EDTA (% 0.25, %0.02, PBS) ile 10 min için kuluçka bağlantısını kesin. Tripsin müstakil hücrelere hücre kültür orta aynı hacmi ekleyerek etkisiz hale getirin. Müstakil hücreleri 15 mL plastik tüpler içine aktarın. Örnekleri için 500 x g de 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
	<ol>
<li>(Bkz. Adım 3.3) 5 mL PBS ve santrifüj hücreleri ekleyin. Yıkama işlemi iki kez daha tekrarlayın. Not: Yıkanmış hücre Pelet süpernatant olmadan birkaç gün için-20 ° C'de muhafaza edilebilir. Polysialic asit ifade aydınlatılmamıştır için ise 10 bölümüne gidin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. hücre lizis HPLC analiz için
<ol><li>
HPLC lizis arabellek hazırlanması
	<ol>
<li>5 mL Tris-HCl tampon, 5 µL aprotinin çözüm, 20 µL leupeptin çözüm ve 50 µL PMSF çözüm birleştirir. Not: 5 mL HPLC lizis arabellek 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1.54 µM aprotinin, 40 µM içerecektir Leupeptin ve 1 mM PMSF (pH 8.0). Bu arabellek her zaman taze hücre lizis önce hazırlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toplanan hücre granül (Adım 3.3) her 500 µL buz gibi HPLC lizis-arabellekte yeniden askıya alma ve ultra-örnekleri bir ultra sonik işlemci iğne ile üç kez bir süre 30 için solüsyon içeren temizleyicide orta-yüksek genlikleri s. Örnekleri için en az 1 dk döngüleri arasında buzda ne yapıyorsun?</li>
</ol>5. membran kesir ayrılması
<ol><li>20.000 x g ve 4 ° c 2 h lysed hücre örnekleri santrifüj kapasitesi 1.5 mL plastik tüpler sitozolik protein temsil eden süpernatant (yaklaşık 480 µL), ayırın. Kullanarak, örneğin, Bradford veya bicinchoninic asit (BCA) tahlil bu kesirler protein konsantrasyonu belirlemek. Not: Sitozolik kesirler protein konsantrasyonu (yaklaşık 1 mg/mL) daha sonra saygın sialik asit türü ölçülen miktarlarda ilgili olabilir. Pelet 6.1 adımda kullanılan membran kesir temsil eder.</li>
</ol>6. asidik hidroliz
Not: Oligo - ve hücre zarlarında polisakkaritler için bol hidrolize. Ayrıca, olası O-bol olarak değişiklikleri hidrolize, de. Sialik asit membran kesirler ezici çoğunluğu doğal olarak glycoconjugates içinde dahil edilmiştir ve muhtemelen Oayı olabilir kantitatif HPLC analiz için gerekli olmasıdır-asetil ya da O- lactolyl değişiklikler.
<ol><li>150 µL 1 M eklemek TFA-çözüm için ayrılmış membran kesirler (Pelet bölümünden 5). Örnekleri 200-600 devir / dakikada sallayarak ile 80 ° C 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Yaklaşık 30 dakika 20.000 x g ve üst aşama birim daha az 20 µL olana 3 kDa dışlama membranlar ile 0.5 mL filtre tüpler kullanarak 21 ° C için örnekler santrifüj kapasitesi. Not: Bu adım daha yüksek moleküler enkaz imha etmek önemlidir.</li>
	<li>2 mL plastik tüpler içine sialik asit türler de dahil olmak üzere daha küçük moleküller içeren alt aşaması aktarın. 2-4 delik plastik tüpler kapaklar ince bir iğne ile poke. Hızlı sıvı nitrojen kullanarak örnekleri donma ve sonra onları bir gecede lyophilize. Not: Kurutulmuş örnekleri RT. Değiştir bir kap delik olmadan, birkaç gün daha uzun depolama için saklanır.</li>
</ol>7. floresan etiketleme
<ol><li>Kurutulmuş örnekleri 10 µL 120 mM TFA çözümde yeniden askıya alma ve 50 µL DMB çözüm ekleyin. Örnekleri ultraviyole ışık onları korumak için karanlık 1,5 mL tüpler içine aktarın.</li>
	<li>Standartları için 1 µL çözülür Neu5Ac (60 ng/mL, su) veya 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, su) 10 µL 120 mM TFA çözüm karanlık 1,5 mL tüpler içinde. 50 µL DMB çözüm ekleyin.</li>
	<li>Hücre zarının örnekleri kuluçkaya ve 1,5 saat 56 ° c standartları ışıktan korunan. Kuluçka sonra etiketleme reaksiyonu durdurmak için her bir örneği için 4 µL 400 mM NaOH çözüm ekleyin.</li>
</ol>8. HPLC analiz
Not: Etiketli örnekleri C18 RP sütun ile donatılmış bir HPLC sistemi analiz edilir (110 Å, 3 µm partikül büyüklüğü 4.6 x 150 mm), Floresans dedektörü ve kesir toplayıcı. Kullanılan çözücüler metanol, Asetonitril ve su vardır. HPLC sistemi dahili bir degasser yoksa ölçümler önce tüm çözücüler degas emin olun.
<ol><li>Sütun sıcaklık 40 ° C ila ayarlayın ve floresan dedektörü ile 373 yapılandırmak için uyarma ve 448 nm nm için emisyon, sırasıyla. 10 µL numune hacmi enjekte ve metanol/Asetonitril/su (6:8:86) olarak eluent ile 50 dk az 0.5 mL/dk akış hızı probları ayrı. Kütle spektrometresi analiz için faiz doruklarına toplamak. Not: Neu5Gc 6-8 min, 9-12 dakika, 17-23 dk sonra Neu5Prop ve 38-44 dakika sonra Neu5But sonra Neu5Ac sonra eluate için bekleniyor. Fraksiyonlara örnekleri için birkaç h ışıktan korunan 4 ° C'de muhafaza edilebilir.</li>
	<li>Her örnek ölçme sonra sütun için 7.5 dak 1.0 mL/dk akış hızı (≈ 1.5 sütun birimler) metanol/Asetonitril/su (6:25:69) ile yıkama ve 1.0 mL/dk akış hızı metanol/Asetonitril/su (6:8:86) ile 7.5 dakika için sistemi yeniden equilibrate.</li>
	<li>Kantitatif analiz için ilgili HPLC sistemi22işletim yazılımı kullanarak faiz sialik asit doruklarına eğri altındaki alan hesaplamak. Not: Elde edilen veri Neu5Ac veya Neu5Gc standart ve ölçülen protein konsantrasyonları sitozolik kesirler (bakınız Bölüm 5.1) ilgili olabilir.</li>
</ol>9. sialik asit bol kütle spektrometresi analizleri
Not: HPLC saklama doruklarına ilgi daha fazla sıvı Kromatografi (LC) electrospray-iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS), tarafından doğal olmayan sialik asit türler doğrulamak için analiz edilebilir.
<ol><li>Kütle spektrometresi analiz için toplanan örnek 20 µL %79.9 metanol, % 20 izopropil alkol ve %0,1 formik asit eluent, 0.5 mL/dk akış hızı, 4 kV kapiller gerilim ve kapiller 350 ° C sıcaklık ile bir LC/kütle seçici dedektörü (MSD) sistemi içine enjekte 22 , 23.</li>
	<li>Değerlendirme yazılım ilgili LC/MSD sistem, toplam iyon Kromatografik ilgi zirvesine seçin. Çözümlenmiş tepe kütle spektrumu görüntüleyin. 300 ve 700 arasındaki olumlu kütle/şarj oranı görüntüler. Not: DMB sialik asit etiketleme 116.2 g/mol moleküler kütlesi bir artışa yol açar. DMB etiketli sialik asit türü aşağıdaki moleküler kütlesi var: DMB-Neu5Ac 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453.2 g = / moleküler ortak adducts Asetonitril, sodyum veya izopropil alkol vardır.</li>
</ol>10. Western Blot analizi Kelly Neuroblastoma hücre Polysialic asit
<ol><li>
Hücre lysates hazırlanması
	<ol>
<li>1 mL Western blot lizis arabellek hücre topakları adım 3.3 girdap ekleyebilir. Buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya. Girdap her 5 dak. 20.000 g ve 4 ° c x 1,5 saat için örnekler santrifüj kapasitesi Lysed hücrelerden protein içeren süpernatant toplamak.</li>
		<li>Protein kesirler, örneğin, Bradford veya BCA tahlil protein konsantrasyonu belirlemek. Örnekleri için 1,5 µg/µL lizis arabellekte bir protein konsantrasyonu sulandırmak.</li>
		<li>Örnekleri 10 µL Laemmli örnek arabellek 90 µL protein Fraksiyonu (1,5 µg/µL) ekleyerek SDS-sayfa için hazırlamak ve örnek 5 min24için kaynatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunoblotting
	<ol>
<li>% 8 SDS-Akrilamid jelleri 20-30 µL cepler ve 0,75 veya 1 mm kalınlığı ile kullanın. Jel 25, koş mA RT 2 h için</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde cam kapak jel çıkarın. Kes şunu ve yükleme cepler içeren jel üst kısmını atın. Daha önce Western blot arabellekte batırılmış jel nitroselüloz membran (0.2 µm), üzerinde yerleştirin. Proteinler nitroselüloz öneri sistemi (Örneğin, 250 mA için 1 h 4 ° C'de) göre aktarın.</li>
		<li>Nitroselüloz membran blotting sisteminizden kaldırın. Leke Ponceau olan proteinleri görselleştirmek için kırmızı leke. Plastik bir odaya nitroselüloz membran aktarmak ve 10 mL çözüm engelleme ekleyin. RT, 1 h için kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de</li>
		<li>Engelleme çözüm dikkatle boşaltmak ve PBS içinde monoklonal anti-polySia 735 antikor (1 µg/mL) ekleyin. Membran RT, 1 h için kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de Kuluçka sonra PBS ile 5 min için en az üç kez membran yıkayın.</li>
		<li>Poliklonal Anti-fare IgG ikincil antikor (1 µg/mL) horseradish peroksidaz (HRP) veya floresan bir etiket PBS ile birleştiğinde ekleyin. Membran RT. 1 h için kuluçkaya Kuluçka sonra PBS ile 5 min için en az üç kez membran yıkayın.</li>
		<li>Membran uygun bir Imager bir tabak üzerine aktarın. Üreticinin yönergelerine uygun sinyal tespit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kimyasal sentez ManNAc türevleri, ManNProp ve ManNBut kütle spektrometresi ile analiz edilir, sadece doğru kitle tepe her iki örnekleri için tespit edilmelidir. Bu nedenle, ürünler üzerinde % 99 saflık için kabul edilebilir. İnsan hücreleri29normalde bulunmazsa, Neu5Gc az miktarda lysed hücre membran kesirler tespit edilir. Bu en olası fetal sığır serum sialoglycoconjugates medya30' dan Neu5Gc acemi bir kurtarma yol boyunca oluşur. Sialik asit biyosentezi,...

Sialik asit glycoconjugates, N- ve O- glukanlardir veya glikolipitler gibi sigara azaltarak termini genellikle bulunabilir bir yaşam var. Tüm bol arasında sialik asit bazı benzersiz kimyasal özelliklere sahiptir. C-5 bulunduğu bir 9 C-atom omurga, karboksilik grubu deprotonated ve böylece olumsuz altında ücret fizyolojik şartlarda C-1 pozisyonda ve amino bir işlevi vardır. Sialik asit türevleri doğal olarak meydana gelen 50'in üzerinde tarihi1olarak nitelendirmiştir rağmen en baskın sialik asit insanlarda bulunan N- asetilnöraminik asit (Neu5Ac) biçimidir. Diğer memeliler de N- glycolylneuraminic asit (Neu5Gc)2,3daha yüksek miktarda hızlı.
Glycoconjugates nedeniyle maruz konumunu, sialik asit reseptör-ligand etkileşimleri, Örneğin, ana bilgisayar hücreleri4grip virüsü hemagglutinin bağımlı bağlantısını bir bolluk ilgilenmektedir. Sialik asit epitope önemli biyolojik fonksiyonları, özellikle sırasında embriyo ve sinir sisteminde polysialic asittir. Polysialic asit 200 alfa 2,8 bağlı sialik asit bir polimerdir. Polysialic asit büyük protein taşıyıcı sinir hücre adezyon molekülü (NCAM) olduğunu. Polysialic asit ifade yapışma azalır ve plastisite sinir sistemi5ile artar Polysialic asit ifade NCAM yapışkanlı mülkiyeti modüle.
Değişiklikler (poli) sialik asit ifadesi sonuçta bir çok farklı biyolojik etkileşimlerin etkiler. Bu bilinen sialik asit bağımlı işlemler roman glycoconjugate etkileşimleri ortaya çıkarmak veya olası tedavi edici yaklaşımlar keşfetmek için moleküler düzeyde eğitim için kullanılabilir. Farklı yöntem kullanılabilir örneğin sialik asit belirli glycosidases (sialidases), enzimler sialik asit biyosentezi6 dahil inhibisyonu ile tedavi hangi sialik asit hücre yüzeyinde ifade modülasyonlu, vardır ,7,8, ya da vurma veya anahtar enzim sialik asit biyosentezi9ifade değiştirme.
Sialik asit ifade modüle için başka bir çok yönlü MGE (olarak da bilinen metabolik oligosakkarit mühendislik, MOE) yöntemidir. Burada, hücre, doku veya hayvanlar için bile C2-amino değişiklikleri taşıyan doğal olmayan türevleri ManNAc ile tedavi edilir. Habercisi moleküller sialik asit, sonra hücresel alımını olmak, bu ManNAc analogları tek yönlü doğal olmayan metabolize sialik asit vardır ve sialylated glycoconjugates ifade edilebilir. ManNProp veya ManNBut, dahil N- propionylneuraminic asit (Neu5Prop) veya N- butanoylneuraminic asit (Neu5But) onların glycoconjugates10 olarak hücreleri Alifatik C2-değişiklikler, taşıma ManNAc türevleri ile kabul edilir , 11. fonksiyonel ManNAc C2-pozisyon tanıttı gruplarını kullanarak, meydana gelen doğal olmayan sialik asit birleştiğinde olabilir, mesela Staudinger ligasyonu veya floresan boyalar ile azid alkine cycloaddition üzerinden ve bu nedenle hücre yüzey12görüntülenir.
Bu doğal olmayan sialik asit ifade patojen enfeksiyonlar, yapışma ve göç tümör hücreleri, genel hücre adezyon, yanı sıra vaskülarizasyon ve farklılaşma (gözden geçirme için de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçleri üzerinde ilginç etkileri vardır bkz: Wratil vd. 13). İlginçtir, MGE ile N-modifiye asil mannosamines polysialic asit ifade ile müdahale için de kullanılabilir. Polysialic asit tarafından iki farklı polysialyltransferases (ST8SiaII ve ST8SiaIV) oluşturulur. Bu göstermiştir, bu polysialyltransferase ST8SiaII ManNProp veya ManNBut14,15gibi doğal olmayan sialik asit öncüleri tarafından engellenir. Buna ek olarak, bu insan Nöroblastom hücrelerde ManNProp veya ManNBut uygulaması da toplam15sialylation azalttığı gösterilmiştir.
MGE ile N-modifiye asil mannosamines başarılı bir şekilde, sadece memeli ve bakteri hücre kültürü Caenorhabditis elegans16gibi farklı türlerin tüm hayvanlarda aynı zamanda kullanılmıştır yöntemi uygulamak kolay bir şey Zebra balığı17, ya da fareler18,19,20,21. Özellikle ManNProp ve ManNBut, dahil olmak üzere Alifatik değişiklik taşıyan ManNAc türevleri negligibly sitotoksik hücre kültür orta veya kan plazması millimolar konsantrasyonlarda bile. Ayrıca, onlar sentez nispeten kolaydır.
Burada, MGE Nile kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi sağlamak-asetil değiştiren mannosamines. İlk olarak, iki ManNProp ve ManNBut, bu alanda en yaygın olarak kullanılan ManNAc türevlerinin kimyasal sentez açıkladı. Daha sonra biz MGE vivo içinde deney uygulanabilir nasıl gösterir. Örnek olarak, Nöroblastom hücre kültürünü Kelly seçildi polysialic epitope azalmış ifade göstermek için tarafından Western blot tedavi ManNAc türevleri ile sonra. Doğal olmayan sialik asit hücre yüzeyinde HPLC tarafından sayısal ve daha fazla kütle spektrometresi ile analiz edildi.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92110411</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>75 ml tissue culture flasks</td><td>Greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>X986.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Serva</td><td>37190.03</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td><td>VWR</td><td>SDS Gel/Blot</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Roth</td><td>3019.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein ladder</td><td>Fisher Scientific</td><td>267620</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau red</td><td>Roth</td><td>5938.2</td><td></td></tr><tr><td>Milk powder</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBLUF 0500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4784-50MG</td><td></td></tr><tr><td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS3548-100EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967-1L</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-10MG</td><td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td></tr><tr><td>Butyryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109614-250G</td><td></td></tr><tr><td>C18 RP column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4435-E0</td><td>110 &amp;Aring;, 3 &amp;micro;m particle size, 4.6 x 150 mm</td></tr><tr><td>D-Mannosamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4670-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56302-50ML-GL</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>36.5-38.0%, in water</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl-Roth</td><td>T169.2</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>N-Acetyl-D-mannosamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8176-250MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0812-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-Glycolylneuraminic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9793-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Propionyl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P51559-500G</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td><td>Eppendorf</td><td>30120191</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bisulfite solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13438-1L-R-D</td><td>40%, in water</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319511-500ML</td><td>1.0 M, in water</td></tr><tr><td>Sodium methoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164992-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-100ML-D</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-019100</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Carl-Roth</td><td>T905.1</td><td>HPLC gradient grade</td></tr><tr><td>Silica Gel 60</td><td>Carl-Roth</td><td>9779.1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSD-System</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

Sialik asit (SIA) glycoconjugates, N- ve O- glukanlardir veya glikolipitler gibi son derece önemli bir kurucu olduğunu. Sigara azaltarak termini adlı oligo - ve polisakkaritler, aynı zamanda benzersiz kimyasal özellikleri onun konumunu nedeniyle çok sayıda farklı Reseptör-ligand etkileşimleri sialik asit ilgilenmektedir. Sialik asit hücre yüzeyinde ifade değiştirerek, sialik asit bağımlı etkileşimleri sonuç olarak etkilenir. Bu sialik asit bağımlı etkileşimleri araştırmak yararlı olabilir ve bazı hastalıklara yararlı bir şekilde etkilemek için bir potansiyele sahiptir. (MGE) metabolik glycoengineering sialik asit hücre yüzeyinde ifade modülasyonlu. Burada, hücre, doku veya hatta tüm hayvanlar N- acetylmannosamine (ManNAc) C2-modified türevleri ile tedavi edilir. Bu amino şeker sialik asit öncül molekül olarak hareket ve bu nedenle ilgili sialik asit tür metabolize edilir ve glycoconjugates üzerinde dile getirdi. Bu yöntemi uygulayarak çeşitli biyolojik süreçleri ilginç etkiler üretir. Örneğin, bu ifade polysialic asit (polySia) tedavi nöronal hücre önemli ölçüde azaltır ve böylece nöronal büyüme ve farklılaşma etkiler. İşte, N- butanoylmannosamine (ManNBut), yanı sıra iki en yaygın C2-modified N- acylmannosamine türevleri, N- propionylmannosamine (ManNProp) kimyasal sentez göstermektedir ve daha fazla nasıl bu doğal olmayan göster amino şeker hücre kültür deneylerde uygulanabilir. Ifade değiştirilmiş sialik asit türlerin yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) sayılabilir ve kütle spektrometresi ile daha fazla analiz. Polysialic asit ifade üzerinde etkileri bir piyasada bulunan polysialic asit antikor kullanarak Western blot yolu ile aydınlatılmamıştır.

HPLC chromatograms Neu5Ac ve Neu5Gc standartları etiketli Floresan, Şekil 2' de tasvir edilmektedir. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, DMB etiketli Neu5Gc genellikle 7-9 dk elüsyon süresi ile DMB-Neu5Ac arasında 10-12 dk arasında elutes. Kromatografik birkaç daha küçük tepeler genellikle 2-6 dk arasında görünür. Bu tepeler unreacted DMB temsil ve reaksiyon25ara ürün.
<p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialik asit glycoconjugates içinde bulunan tipik bir yaşam ünitesi var. Moleküler ve hücresel etkileşimlerin bir bolluk ilgilenmektedir. Burada hücre yüzey sialik asit ifadesi N- acetylmannosamine türevleri ile metabolik glycoengineering kullanarak değiştirmek için bir yöntem mevcut.

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

metabolic-glycoengineering-sialic-acid-using-n-acyl-modified

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

12.6K Görüntüleme.  LMU München. Sialik asit glycoconjugates içinde bulunan tipik bir yaşam ünitesi var. Moleküler ve hücresel etkileşimlerin bir bolluk ilgilenmektedir. Burada hücre yüzey sialik asit ifadesi N- acetylmannosamine türevleri ile metabolik glycoengineering kullanarak değiştirmek için bir yöntem mevcut.

Video: Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Biyomühendislik

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) expression. These are acidic sugars that have a 9-carbon backbone and that cap vertebrate glycans on cell surfaces. Two of the major Sia forms in mammals are N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) and its hydroxylated form, N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc). Humans cannot produce endogenous Neu5Gc due to the inactivation of the gene encoding cytidine 5&#39;monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Foreign Neu5Gc is acquired by human cells through the dietary consumption of red meat and dairy and subsequently appears on diverse glycans on the cell surface, accumulating mostly on carcinomas. Consequently, humans have circulating anti-Neu5Gc antibodies that play diverse roles in cancer and other chronic inflammation-mediated diseases and that are becoming potential diagnostic and therapeutic targets. Here, we describe a high-throughput sialoglycan microarray assay to assess such anti-Neu5Gc antibodies in the human sera. Neu5Gc-containing glycans and their matched pairs of controls (Neu5Ac-containing glycans), each with a core primary amine, are covalently linked to epoxy-coated glass slides. We exemplify the printing of 56 slides in a 16-well format using a specific nano-printer capable of generating up to 896 arrays per print. Each slide can be used to screen 16 different human sera samples for the evaluation of anti-Neu5Gc antibody specificity, intensity, and diversity. The protocol describes the complexity of this robust tool and provides a basic guideline for those aiming to investigate the response to Neu5Gc dietary carbohydrate antigen in diverse clinical samples in an array format.

A sialoglycan microarray assay can be used to evaluate anti-Neu5Gc antibodies in human sera, making it a potential high-throughput diagnostic assay for cancer and other chronic inflammation-mediated human diseases.

Anti-Neu5Gc IgG&#39;yi İnsan Sera&#39;sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

Davranış

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Kimya

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having multifarious bioactivities. Although chemical O-glycosylation is a commonly beneficial strategy to synthesize disaccharide nucleosides, the preparation of substrates such as glycosyl donors and acceptors requires&#160;tedious protecting&#160;group manipulations and a purification at each synthetic step. Meanwhile, several research groups have reported that boronic and borinic esters serve as a protecting or activating group of carbohydrate derivatives to achieve the regio- and/or stereoselective acylation, alkylation, silylation, and glycosylation. In this article, we demonstrate the procedure for the regioselective O-glycosylation of unprotected ribonucleosides utilizing boronic acid. The esterification of 2&#39;,3&#39;-diol of ribonucleosides with boronic acid makes the temporary protection of diol, and, following O-glycosylation with a glycosyl donor in the presence of p-toluenesulfenyl chloride and silver triflate, permits the regioselective reaction of the 5&#39;-hydroxyl group to afford the disaccharide nucleosides. This method could be applied to various nucleosides, such as guanosine, adenosine, cytidine, uridine, 5-metyluridine, and 5-fluorouridine. This article and the accompanying video represent&#160;useful (visual) information for the O-glycosylation of unprotected nucleosides and their analogs for the synthesis of not only disaccharide nucleosides, but also a variety of biologically relevant derivatives.

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Here, we present protocols for the synthesis of disaccharide nucleosides by the regioselective O-glycosylation of ribonucleosides via a temporary protection of their 2&#39;,3&#39;-diol moieties utilizing a cyclic boronic ester. This method applies to several unprotected nucleosides such as adenosine, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine, and 5-fluorouridine to give corresponding disaccharide nucleosides.

Regioselective O- glikozilasyon nükleozitler üzerinden geçici 2', 3'-Diol koruması tarafından Boronic Ester Disaccharide nükleozitler sentezi için

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Bakteriyel Glikoproteinler için Spesifik Olmayan Proteoliz Tabanlı Glikomik Stratejisi

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

Bakteriyel Glikoproteinler için Spesifik Olmayan Proteoliz Tabanlı Glikomik Stratejisi

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

Biyokimya

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. However, monoclonal antibody functionality and half-life may be reduced by the type and distribution of host-specific glycosylation. Attempts to produce superior antibodies have inspired the development of genetically modified producer cells that synthesize glyco-optimized antibodies. Glycoengineering typically requires the generation of a stable knockout or knockin cell line using methods such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9. Monoclonal antibodies produced by engineered cells are then characterized using mass spectrometric methods to determine if the desired glycoprofile has been obtained. This strategy is time-consuming, technically challenging, and requires specialists. Therefore, an alternative strategy that utilizes streamlined protocols for genetic glycoengineering and glycan detection may assist endeavors toward optimal antibodies. In this proof-of-concept study, an IgG-producing Chinese hamster ovary cell served as an ideal host to optimize glycoengineering. Short interfering RNA targeting the Fut8 gene was delivered to Chinese hamster ovary cells, and the resulting changes in FUT8 protein expression were quantified. The results indicate that knockdown by this method was efficient, leading to a ~60% reduction in FUT8. Complementary analysis of the antibody glycoprofile was performed using a rapid yet highly sensitive technique: capillary gel electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. All knockdown experiments showed an increase in afucosylated glycans; however, the greatest shift achieved in this study was ~20%. This protocol simplifies glycoengineering efforts by harnessing in silico design tools, commercially synthesized gene targeting reagents, and rapid quantification assays that do not require extensive prior experience. As such, the time efficiencies offered by this protocol may assist investigations into new gene targets.

The glycosylation pattern of an antibody determines its clinical performance, thus industrial and academic efforts to control glycosylation persist. Since typical glycoengineering campaigns are time- and labor-intensive, the generation of a rapid protocol to characterize the impact of glycosylation genes using transient silencing would prove useful.

Çin Hamster Yumurtalık Hücrelerinde Hızlı Antikor Glikomühendisliği

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

Sialidaz Tedavisi Kullanılarak İzole PBMC'lerden De-Sialillenmiş Monosit Türetilmiş DC'ler

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical characteristics, they are involved in numerous biological processes, such as modulation of the immune response, recognition of self and non-self antigens, carbohydrate-protein interactions, etc. The cellular content of sialic acid is regulated by sialidase, which catalyzes the removal of sialic acid residues. Several studies have shown that sialo-glycans are critical in monitoring immune surveillance by engaging with cis and trans inhibitory Siglec receptors on immune cells. Likewise, glyco-immune checkpoints in cancer are becoming crucial targets for developing immunotherapies. Additionally, dendritic cells (DCs) are envisioned as an important component in immunotherapies, especially in cancer research, due to their unique role as professional antigen-presenting cells (APC) and their capacity to trigger adaptive immune responses and generate immunologic memory. Nevertheless, the function of DCs is dependent on their full maturation. Immature DCs have an opposing function to mature DCs and a high sialic acid content, which further dampens their maturation level. This downregulates the ability of immature DCs to activate T-cells, leading to a compromised immune response. Consequently, removing sialic acid from the cell surface of human DCs induces their maturation, thus increasing the expression of MHC molecules and antigen presentation. In addition, it can restore the expression of co-stimulatory molecules and IL-12, resulting in DCs having a higher ability to polarize T-cells toward a Th1 phenotype and specifically activate cytotoxic T-cells to kill tumor cells. Therefore, sialic acid has emerged as a key modulator of DCs and is being used as a novel target to advance their therapeutic use. This study provides a unique approach to treat in vitro monocyte-derived DCs with sialidase, aimed at generating DC populations with different cell surface sialic acid phenotypes and tailored maturation and co-stimulatory profiles.

Yazar Spotlight: Hücre Yüzeyinin Sialidaz Bazlı Enzimatik İşlemi Kullanılarak Dendritik Hücrelerin Olgunlaşması 

A unique, comprehensive protocol to generate de-sialylated human monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a sialidase treatment is presented. Further, methods to assess the phenotypic and functional characterization of mo-DCs and evaluate how sialidase treatment improves the maturation level of mo-DCs are described.

Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST