הערכת תגובות חיסוניות נשימתיות לשפעת המופילוס

שפעת המופילוס היא גורם מרכזי לדלקת במחלות ריאה כרוניות שונות, כולל COPD ודלקת ריאות. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת ההשפעה של המופילוס על דלקת ריאות. היתרונות של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת הערכה מקיפה של תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות.

דגירה של 450 מיקרוליטר של דם היקפי עם 50 מיקרוליטר של פרופילידיום יודיד פעיל שכותרתו H influenzae בצינור של חמישה מיליליטר למשך 20 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הסר את הדגימה מאמבט המים, הוסף חמישה מיקרוליטרים של DHR ומערבולת במשך 10 שניות. לאחר מכן החזירו אותו לאמבטיית המים למשך 10 דקות נוספות.

לאחר הסרת הדגימה מאמבט המים, lyse את אריתרוציטים עם חמישה מיליליטר של 0.8% אמוניום כלוריד פתרון ולנתח את הדגימות על ציטומטר זרימה כמתואר בטקסט. חלק את דגימת הדם ההיקפית ל- aliquots לבקרה וגירוי אנטיגן. הוסיפו נוגדנים קוסטימולטוריים לשתי הדגימות.

לאחר מכן הוסיפו את שפעת H שאינה ניתנת להקלדה לדגימת האנטיגן ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה. לאחר מכן, הוסף את סוכן החסימה של גולג'י, ברפלדין A, לדגימות ודגירה שלהן במשך חמש שעות נוספות. לאחר lysing אריתרוציטים כפי שהוכח קודם לכן, לתקן את leukocytes באמצעות 500 microliters של אחד עד 2% para-פורמלדהיד במשך שעה אחת.

ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר, ואז חלחלו למיליון תאים עם 100 מיקרוליטרים של 0.1% ספונין למשך 15 דקות. לאחר מכן, לדגום את התאים עם נוגדנים מתאימים המסומנים פלואורסצנטיים. לשטוף את התאים, ולאחר מכן לנתח אותם באמצעות ציטומטר זרימה.

קבע את שיעור התאים המגיבים לאנטיגן על ידי קבלת אוכלוסיות הלימפוציטים הרלוונטיות. בצע צביעת רקע על תאים שאינם מגורה כדי לנתח את כל הציטוקינים. פורסים כ-20 עד 40 גרם מדגימת האובקטומיה לשלושה עד חמישה חלקים מילימטריים.

מניחים אותם בתוך תא סטרילי של 50 מיקרוליטר וקוטעים מכנית את הרקמה באמצעות דיס-צובר מתאים. לאחר פירוק הרקמות, lyse את תאי הדם האדומים כפי שהודגם ולהשהות את התאים RPMI סטרילי. לאחר מכן לסנן את התאים דרך רשת ניילון סטרילית בגודל 100 מיקרומטר ולספור את התאים בני קיימא באמצעות שיטת ההרחקה הכחולה טריפאן.

לצורך בדיקת הזיהום, יש להשעות את תאי הריאה ב-RPMI לריכוז סופי של 4 מיליון תאים למיליליטר לצינור. לאחר מכן מדביקים את התאים ב-MOI של 100 חיידקים לתא. שחררו את המכסה חצי סיבוב כדי לאפשר מעבר גז בצינורות.

מניחים את התאים במסובב הצינור ודוגרים אותם ב 37 מעלות צלזיוס תוך סיבוב ב 12 סל"ד. שעה לאחר הגירוי, הוסיפו גרפלדין A כדי למנוע ייצוא חוץ-תאי של ציטוקינים ודגרה על מתלי התאים למשך 16 עד 22 שעות נוספות עם סיבוב. למחרת, לשטוף את תרחיף התא עם 500 microliters של PBS המכיל 1% אלבומין בסרום בקר ו 0.01% נתרן אזיד.

לאחר מכן, מכתים את תרחיף התא עבור סמני פני השטח של תאי לימפוציטים אנושיים ספציפיים למשך שעה אחת. לאחר מכן לשטוף את התאים עם PBS ולתקן ולחדור אותם כפי שהוכח בעבר. לאחר מכן, לדגור על התאים עם נוגדנים מכתימים ציטוקינים תוך תאיים למשך שעה אחת.

לאחר מכן לשטוף את התאים ולתלות אותם מחדש ב 100 microliters של PBS לפני רכישת נתונים על ציטומטר זרימה. למדוד פרוטאוליזה באמצעות פעולה של metalloproteinases, להוסיף פלואורסצין שכותרתו מצע ג'לטין ישירות על שקופיות רקמת הריאה. הניחו את המגלשות בצורה אופקית ודגרו אותן בתא לחות מוגן אור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

כדי להכין בקרות שליליות, הוסף מאגר תגובה x אחד ללא ג'לטין פלואורסצנטי למקטעים לניתוח נוסף. תאי דם חד-גרעיניים היקפיים היו מגודרים באמצעות פיזור קדימה וצד כדי להגדיר את אוכלוסיית הפאגוציטים. אוכלוסיית הפאגוציטים הוגדרה עוד יותר על ידי ביטוי CD14 כדי לסמן את המונוציטים.

מדידת ROS בוצעה באמצעות חמצון של DHR 123 כדי לייצר פלואורסצנציה. הפלואורסצנטיות החציונית של המדגם המגורה הושוותה לבקרה. ייצור ציטוקינים תוך תאיים על ידי לימפוציטים נמדד באמצעות ציטומטריה של זרימה.

התאים נותחו תחילה לביטוי שלהם של סמן לויקוציטים CD45 ולאחר מכן עבור CD שלוש ו- CD ארבע, CD 8. שלושת ה-CD, ארבעת התאים החיוביים של CD הוערכו לייצור ציטוקינים תוך-תאיים בבקרה ודגימות מגורה. פעילות הפרוטאז נמדדה על ידי NC שתי זימוגרפיה במקטעי רקמת ריאה לא מנוקדת.

צביעה פלואורסצנטית הצביעה על נוכחות של פעילות MMP, שגם היא הייתה מתואמת עם ביטוי הכרומטין. הוספת נוגדנים לדגימות רקמת הריאה דורשת ריכוז והכתמה של התאים תדרוש אופטימיזציה בניסויים ראשוניים. ניתן לנתח עוד יותר את הסופרנאטנט של דגימות רקמת הריאה עבור מתווכי דלקת אחרים באמצעות טכניקות כגון ELISA וטכניקות אלה יכולות לשמש כדי להעריך את ההשפעה של טיפולים פוטנציאליים על דלקת ריאות.