אנו מודים לג &#39;ואוגן על קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ JSPS KAKENHI מענק מספרים 26891025, 15H01500 ו Takeda מדע הקרן מענק מחקר YT

1. לטוס צלבים ואינדוקציה משובטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הזבובים בבקבוקון 12 שעות לפני איסוף זבובים בתולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבובים בבקבוקון על ידי הזרקת גז CO 2 ומקום עף על גבי כרית זבוב CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 10 - 20 נשים בתולה ו -10 גברים מן CO 2 לטוס כרית לתוך בקבוקון טרי דגירה ליום 1 ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים אלה לתוך בקבוקון טרי דגירה במשך 12 שעות ב 25 ° C. הערה: להשליך את הבקבוקון הראשון כמו נקבות בתולה לא להניח מספיק ביצים ביום הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור משפר- GAL4 שורות, להסיר את הזבובים למבוגרים דגירה בקבוקון על 25 מעלות צלזיוס עד לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אינדוקציה של שיבוטים פסיפס על ידי להעיף החוצה- GAL4, להסיר את הזבובים המבוגרים דגירה בקבוקון עבור 2 - 4 ימים על 25 מעלות צלזיוס. זמן דגירה לפני הלם חום תלויה המטרה הניסויית. הלם חום 2 ימים לאחר הביצה בתצהיר (א.ד.) מייצר שיבוטי פסיפס בשנייה לא בוגר- אפיתיל דמיוני. הלם חום לאחר 3 או 4 ימים א.ד. מייצר שיבוטים פסיפס ב מובחן מוקדם עד אמצע השלישי epithelia הדמיון. הערה: חשוב לבחון את ההשפעה של תזמון חום שהשתנה על פנוטיפים טומוריגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אינדוקציה של שיבוטים פסיפס על ידי להעיף החוצה- GAL4, הלם חום הבקבוקון על ידי טבילה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 - 45 דקות ואחריו הדגירה של 2-3 ימים על 25 מעלות צלזיוס. הערה: מידע על זמן הזעזוע החום, העיתוי וזמן הדגירה בכל ניסוי מוצג באיור האגדות. </li></ol> 2. דיסקציה של הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נודדים instar השלישי עם מקל עץ או מלקחיים קהה, גנוטיפ אותם על ידי סמנים ניאון המתאים ( למשל , EGFP) תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצנטי ומניחים אותם צלחת לנתיחה עם PBS (פוספט שנאגרו מלוחים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הזחלים PBS ידי pipetting עם 2 מ&quot;ל pipettes העברת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">צבוט את מרכז הזחל עם מלקחיים אחת ולקרוע את הגוף לשניים עם מלקחיים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קמצוץ את הפה של החצי הקדמי עם מלקחיים אחד לדחוף את הפה לכיוון הגוף עם מלקחיים אחרים כדי להפוך את הגוף פנימה החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חומרים מיותרים כגון בלוטות הרוק או גופים שומן עם מלקחיים. </li></ol> 3. קיבוע נוגדן מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החלק הקדמי גזור של הגוף הזחל (כולל דיסקים כנפיים דמיוני) כדי צינור פלסטיק 1.5 מ&quot;ל לתקן 1 מ&quot;ל של פתרון תקן (פורמלדהיד 4% ב PBS) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך עם סיבוב עדין. זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל ויש לו פוטנציאל מסרטן. ללבוש כפפות מגן ובגדים כדי למנוע מגע עם העור. הערה: בחלק זה, כל השלבים מתרחשים על נוטאטור בטמפרטורת החדר בחושך, אלא אם צוין אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון תקן וזורקים. לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT (0.3% Tritב X-100 ב PBS) שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBT ולהוסיף 1 מ&quot;ל של PBTG (0.2% אלבומין בסרום שור 5% בסרום עירום נורמלי PBT) לחסימת ו nutate 1 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBTG ולהוסיף פתרון נוגדן ראשוני בדילול נאות עם PBTG (ראה טבלה חומרים ) ו nutate לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון נוגדן ראשוני לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל PBT שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBT ולהוסיף פתרון נוגדנים משני כראוי בדילול מלא עם PBTG (1: 400). Nutate עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון נוגדנים משני לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הכתם F- אקטין, להסיר PBT ולהוסיף פתרון Phalloidin בדילול נאותה PBS (1:40). ואז nutate במשך 20 דקות. הסר את הפתרון Phalloidin לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להדוף DNA גרעיני, להסיר PBT ולהוסיף DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) פתרון (0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של DAPI ב PBS). ואז nutate 10 דקות. זהירות: DAPI יש פוטנציאל מסרטן. ללבוש כפפות מגן ובגדים כדי למנוע מגע עם העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון DAPI לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעם 1 מ&quot;ל של PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 500 μL של גליצרול 100% כמו המדיום מראש הרכבה. </li></ol> 4. הרכבה על גבי שקופיות מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרקמות המוכתמות בשקופית מיקרוסקופ באמצעות פיפטה העברת פלסטיק 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמות טיפות של המדיום גובר על שקופית מיקרוסקופ אחר עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את קצה הרקמה גזור עם מלקחיים אחת ולמשוך משם דיסקים antennal העין עם מלקחיים אחרים. הערה: לשמור על המוח גזור למקום אותם ליד הדיסק דימיון כנף. המוח לפעול כפלטפורמה המונעת את coverslip מ מוחצת את האגף דיסקים דמיוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד את הדיסק כנפיים הדימיון להחזיק בקצה של רקמה גזור עם מלקחיים אחד בעדינות לגרד את קיר הגוף ולקרוע את הדיסקים עם מלקחיים אחרים. הערה: אם קשה למצוא דיסקיות דימויים כנפיים, לקלף את קנה הנשימה מן האחורי אל הצד הקדמי. כנפיים דיגיטליות כנפיים מקל על קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לכסות את הדיסקים הדמיוניים עם coverslip וחותמת עם לק. חנות ב 4 ° C. </li></ol> 5. מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכוש תמונות confocal באמצעות מיקרוסקופ confocal להגדיר תמונה פרמטרים הרכישה כולל טווח של גל פליטה, עוצמת לייזר, רווח, היסט, מהירות סריקה גודל התמונה 24 . הערה: לקבלת הליך מפורט של הגדרות רכישת תמונות, עיין במדריך ההוראות המצורף על ידי כל יצרן מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ללכוד שיתוף יחידקטעים nfocal של דיסק שלם אגף כולו, להשתמש בעדשה אובייקטיבית 20X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש 3-ממדי תמונות על ידי Z- מחסנית סריקה בגודל צעד של 0.5 - 1.0 מיקרומטר באמצעות עדשות 40X או 60X. הערה: כדי לנתח פנוטיפים סלולריים ברזולוציה גבוהה, גודל התמונה צריך להיות גדול מ 512 x 512 פיקסלים. </li></ol> 6. ניתוח תמונה באמצעות ImageJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיג &#39;י, קוד פתוח ImageJ התוכנה התמקדה ביולוגי ניתוח התמונה (https://fiji.sc/) 25 , לרכוש ולנתח confocal z- מחסנית תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכוש חלקים אנכיים, לפתוח את z- ערימת תמונות ImageJ ובחר פריט בתפריט &quot;תמונה / ערימות / Reslice.&quot; הערה: ניתן לבחור בציר XZ או בציר YZ בתפריט Reslice. סעיף אנכי ניתן להשיג גם בכיוון שרירותי על ידי ציור קו ישר או מלבן על התמונה z- מחסנית. </li></ol> 7. אבחון פנוטיפים ניאופלסטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את האנכימקטעים (XZ או ציר YZ) המתקבל קבוצה אחת של z- מחסנית תמונות ולנתח פנוטיפים מורפולוגיים מכתים נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אבחון של פנוטיפים הגידול, בעיקר להתמקד בשלוש נקודות הבאות: (1) אם מסה התא, כולל שיבוטים מציאה, סוטה מן השכבה אפיתל הראשי, (2) אם לוקליזציה subcellular של חלבונים jnctional משתנה מסה זו התא , ו (3) אם הקוטר של מסת התא הזה הוא גדול מ 4 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיווג פנוטיפים הגידול לפי תרשים זרימה המתואר בתרשים 1 . </li></ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila.">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li><li>Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+in+cancer+research.+An+expanding+role.">Drosophila in cancer research. An expanding role.</a> Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).</li><li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila.">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li><li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis.">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).</li><li>Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+proliferation+control:+links+from+the+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressors.">Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors.</a> Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).</li><li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble/Dlg/Lgl+polarity+module.">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).</li><li>Huang, L., Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+alterations+in+carcinoma:+a+focus+on+emerging+roles+for+polarity+regulators.">Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).</li><li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila.">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li><li>Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+tumor+suppression+and+epithelial+maintenance+by+endocytic+activation+of+Eiger/TNF+signaling+in+Drosophila.">Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).</li><li>Tamori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Lgl+and+Mahjong/VprBP+in+cell+competition.">Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition.</a> PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).</li><li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+diverts+a+host+TNF+tumor+suppressor+activity+into+tumor+promoter.">Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li><li>Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+Sas+and+its+receptor+PTP10D+drive+tumour-suppressive+cell+competition.">The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition.</a> Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).</li><li>Vaughen, J., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit-Robo+Repulsive+Signaling+Extrudes+Tumorigenic+Cells+from+Epithelia.">Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia.</a> Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).</li><li>Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Tumors+Originate+in+Tumor+Hotspots,+a+Tissue-Intrinsic+Microenvironment.">Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment.</a> PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).</li><li>Ohsawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oncogenic+neighbors+by+JNK-mediated+engulfment+in+Drosophila.">Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila.</a> Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).</li><li>Men&#233;ndez, J., P&#233;rez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tumor-suppressing+mechanism+in+Drosophila+involving+cell+competition+and+the+Hippo+pathway.">A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).</li><li>Hogan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+interface+between+normal+and+transformed+epithelial+cells.">Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells.</a> Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).</li><li>Kajita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+surrounding+normal+epithelial+cells+influences+signalling+pathways+and+behaviour+of+Src-transformed+cells.">Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).</li><li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Scribble+causes+cell+competition+in+mammalian+cells.">Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells.</a> J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).</li><li>Wagstaff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+cell+competition+kills+cells+via+induction+of+lethal+p53+levels.">Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels.</a> Nat Commun. 7, 1-14 (2016).</li><li>Kajita, M., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDAC:+Epithelial+defence+against+cancer-cell+competition+between+normal+and+transformed+epithelial+cells+in+mammals.">EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals.</a> J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Jory, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+6,300+genomic+fragments+for+cis-regulatory+activity+in+the+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster.">A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).</li><li>Rodrigues, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+STAT+regulates+growth+and+induces+competitive+interactions+independently+of+Myc,+Yorkie,+Wingless+and+ribosome+biogenesis.">Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis.</a> Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).</li><li>Khan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+neoplasia+in+Drosophila+entails+switch+to+primitive+cell+states.">Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).</li><li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior.">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li><li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics.">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li><li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+design:+how+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood.">Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li><li>Nakajima, Y. -. I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+junctions+maintain+tissue+architecture+by+directing+planar+spindle+orientation.">Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation.</a> Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).</li><li>Colombani, J., Andersen, D. S., L&#233;opold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+peptide+Dilp8+coordinates+Drosophila+tissue+growth+with+developmental+timing.">Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing.</a> Science. 336 (6081), 582-585 (2012).</li><li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation.">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מערכת GAL4-UAS הוא אחד הכלים הגנטיים החזקים ביותר עבור ביטוי גנים ממוקד תסיסנית 26 ומאפשר מאוד אינדוקציה תא הגידול וניתוח ב vivo 4 . מערכת זו מאפשרת את הדור של שיבוטים נושאת מציאה של גנים מדכאי גידול או overexpression של אונקוגנים בתוך רקמת אפיתל...

רקמות אפיתל הן מערכות מאורגנות מאוד, כי יש יכולת הומיאוסטית יוצאת דופן לשמור על הארגון שלהם באמצעות פיתוח מחזור התא. מערכת זו עצמית מאורגנת, עם זאת, הוא שיבשו בהדרגה במהלך התפתחות הגידול. בתחילת התפתחות הגידול, תאים מוטציה בודדים הנובעים הפעלה אונקוגן או גידולים סרטניים inactivation להתגלות בתוך שכבת אפיתל. כאשר זה השתנה &quot;Pro-הגידול התא&quot; מתחמק בסביבה מדכאת, משבש ארגון אפיתל, ומתחיל התפשטות בלתי מבוקרת, tumorigenesis מתרחשת 1 . במהלך העשורים האחרונים, התקדמות טכנולוגית יוצאת דופן בגנטיקה וביולוגיה מולקולרית עשו התקדמות מדהימה על מחקר הסרטן. במיוחד, מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות כלי ניתוח פסיפס גנטית ב תסיסנית melanogaster , כגון FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase היעד) recombin מיטוטיAtion 2 ו flip-out-GAL4-UAS (במעלה מפעיל רצף) מערכות 3 , תרמו רבות להבנה טובה יותר של המנגנונים הגנטיים המעורבים היווצרות גרורות של גידולים 4 , 5 , 6 . מחקרים של קבוצת גני תסיסנית גידול משתיק משומרים, זחלי ענק קטלניים (LGL), דיסקים גדולים (dlg), ולקשקש (scrib), הדגישו את הקשר הקריטי בין הפסד של ארגון אפיתל התפתחות גידולים, כמו גנים אלה ממלאים תפקידים מרכזיים ב ויסות קוטביות תא אפית, ותאי תאים ברקמות אפיתל 7 . בעוד שדיסקופיית הדיסקופיליה היא בדרך כלל אפיתיל מונוליר, מוטציות הומוזיגיות בכל אחד משלושת הגנים האלה גורמים לתאים לאבד מבנה וקוטביות,לשכור, overproliferate, ובסופו של דבר להרכיב multorayered המוני אמורפיים כי הפתיל עם רקמות סמוכות 7 . כמו כן, הפרעה של גנים אלה יונקים מעורב בפיתוח של גידולים ממאירים 8 , 9 . הפנוטיפים הניאופלסטיים המוצגים על ידי הרקמות המוטנטיות הובילו לסיווגם של שלושה גנים אלה כגנים משמרים, נויפלסטיים, מדכאי גידולים (nTSG) 7 , 8 . עם זאת, כאשר תאים הומוזיגיים nTSG מוטציה הם שנוצר באופן ספורדי בפיתוח wild-type דימויים דמיוניים באמצעות רקומבינציה מיטבית FLP-FRT בתיווך, תאים מוטציה מסולקות מן הרקמה דרך אפקטוזיס C- יוני K- מסוף (JNK), אפופטוזיס תלויים 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , שחול 15 , 16 , או engulfment ו phagocytosis על ידי השכנים 17 . ב אפיתל זה מוזאיקה גנטית, אפופטוזיס הוא זוהה בעיקר בתאי מוטציה nTSG הממוקם בגבול שיבוט, דבר המצביע על כך תאים נורמליים סמוכים מפעילה אפופטוזיס של תאים nTSG מוטציה 10 , 11 , 12 , 18 . מחקרים שנערכו לאחרונה בתאי יונקים אישרו כי חיסונים אלה התומכים בתאי גזע של תאים פרו-סרטניים הם מנגנון הגנה עצמית אפיתלי משומר מבחינה אבולוציונית נגד סרטן 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . מחקר שנערך לאחרונה תסיסנית דיסקים דמיוניים, לעומת זאת, הראה כי פסיפס nTSG-knockdown שיבוט גורם גידולים ניאופלסטיים specifאיזורים של כנפיים דימויים דימויים 16 . היווצרות ראשונית של הגידול נמצאה תמיד באזור &quot;ציר&quot; הפריפריאלי ולא נצפתה באזור המרכזי של &quot;שקיק&quot; של אפיתל הדיסק של האגף, דבר המצביע על כך שהפוטנציאל הטומוריגני של תאי NTSG-knockdown תלוי בסביבה המקומית. אזור שקיק מרכזי פונקציות כמו &quot;coldspot הגידול&quot; שבו תאים Pro הגידול אינם מראים overgroastic דיספלסטי, ואילו באזור ציר ההיקפי מתנהג כמו &quot;נקודה חמה&quot; 16 . ב &quot;coldspot&quot; אזורים שקיק, תאים nTSG-knockdown delaminate מן הצד הבסיסי ועוברים אפופטוזיס. לעומת זאת, כמו &quot;נקודה חמה&quot; תאים הציר להחזיק רשת של מבנים cytoskeletal חזקים על הצדדים הבסיסיים שלהם, תאים nTSG-knockdown delaminate מן הצד האפי של אפיתל וליזום צמיחת יתר של טומוריגנית 16 . לכן, ניתוח של פנוטיפים הגידול בדיסקים דמיוניים דורש consi זהירשל רגישות ספציפית לאזור לגירויים טומוריגניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לעורר היווצרות הגידול neoplastic בתקליטורים כנף תסיסנית הדיסק באמצעות מערכת GAL4-UAS- RNAi שבו תאים nTSG-knockdown נוצרים epithelia דיסק epaghelia רגיל. למרות אלו מערכות ניסיוניות שימושיים ללמוד את השלבים המוקדמים של סרטן, שיטה סיווג ברור להעריך את השלבים של התקדמות הגידול ב epithelia דיסק דמיוני לא תוארה בבירור לפני. לכן, אנו מציעים גם שיטת אבחון לסווג פנוטיפים המשובטים הגידול המושרה epithelia דיסק האגף לשלוש קטגוריות: hyperplasia (הצטברות של מספר מופרז של תאים מופיעים נורמלי עם התפשטות מוגברת), דיספלסיה (רקמה prealignant מורכב להופיע באופן חריג תאים), ו neoplasia (גידול שפיר או ממאיר המורכב של תאים בעלי מראה חריג דפוס התפשטות לא נורמלי).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>162-19321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-11805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Wako</td>
			<td>064-00406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mounting medium, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-Dlg 4F3</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3A6B4, RRID:AB_579780</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3B8D12, RRID:AB_579781</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>5H7B11, RRID:AB_579779</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-atubulin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AA4.3, RRID:AB_579793</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A22283</td>
			<td>dilute in PBS, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11030</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sd-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#8609</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upd-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#26796</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-lgl-RNAi</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi center</td>
			<td>#51247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-scrib-RNAi</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi center</td>
			<td>#105412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-RasV12</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#64196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Yki3SA</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#28817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsFLP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act&#62;CD2&#62;GAL4 (flip-out GAL4)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#4780</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-EGFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#5428</td>
			<td>X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-EGFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#6658</td>
			<td>third chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Dicer2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#24650</td>
			<td>second chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Dicer2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#24651</td>
			<td>third chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vkg-GFP</td>
			<td>Morin et al. 2001</td>
			<td></td>
			<td>GFP protein trap</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia

בשלבים המוקדמים של הסרטן, תאים מוטנטיים שהשתנו מראים תקלות ציטולוגיות, מתחילים בשגשוג בלתי מבוקר, ומפריעים בהדרגה לארגון הרקמות. תסיסנית melanogaster התפתחה כמערכת מודל ניסיוני פופולרי ביולוגיה של סרטן ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. בפרט, כלים גנטיים עבור דיסוזופיל דימיוני דיסקים (לפתח epithelia בזחלים) לאפשר יצירת תאים Pro- הגידול הופכים ברקמה אפיתל רגיל, מצב דומה לשלבים הראשונים של סרטן האדם. מחקר שנערך לאחרונה על tumorigenesis בדיסקופיית כנפיים תסיסנית , לעומת זאת, הראה כי ייזום הגידול תלוי cytoarchitecture המהותית ואת הסביבה microenviron המקומית, דבר המצביע על כך חשוב לשקול את האזור ספציפי רגישות לגירויים tumorigenic בהערכת פנוטיפים הגידול בדמיון דיסקים. כדי להקל על ניתוח פנוטיפי של הגידול progressiב דיסקים דמיוני, כאן אנו מתארים פרוטוקול ניסויים גנטיים באמצעות מערכת GAL4-UAS כדי לגרום לגידולים ניאופלסטיים בדיסקים דמיון כנף. בנוסף, אנו מציגים שיטת אבחון כדי לסווג את פנוטיפים של נגעים משובצים המושרה epithelia דמיוני, כמו שיטת סיווג ברור להפלות בשלבים שונים של התקדמות הגידול (כגון היפרפלזיה, דיספלזיה, או neoplasia) לא תוארה קודם לכן. שיטות אלה עשויים להיות חלים באופן נרחב על ניתוח המשוב של פנוטיפים הגידול באיברים שונים תסיסנית .

כדי להדגים היווצרות הגידול נאופלסטיות המושרה בניסוי ידי RNAi בתיווך nTSG-מציאה ב דיסקים דמותי תסיסנית הכנף, שלושה נהגים GAL4 שונים שימשו להביע כטב&quot;מ RNAi עבור LGL או scrib: (1) SD-GAL4, אשר מניע ביטוי כטב&quot;מ חזקה כיס כנף והבעה קלה באז?...

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia at JoVE.com

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

ניתוח פסיפס משוכפל ב תסיסנית הדיסק epithelia הדימוי הוא מודל מודל חזק ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום לגידולים בדיסקופיית כנף תסיסנית באמצעות מערכת GAL4-UAS, ולהציג שיטת אבחון לסווג את פנוטיפים הגידול.

אינדוקציה ואבחון של גידולים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; אפיתלציה דיסק Imaginalia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

14.8K Views.  SOKENDAI.  ניתוח פסיפס משוכפל ב תסיסנית הדיסק epithelia הדימוי הוא מודל מודל חזק ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום לגידולים בדיסקופיית כנף תסיסנית באמצעות מערכת GAL4-UAS, ולהציג שיטת אבחון לסווג את...

Video: Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

התפתחות מודל פרה האנושית של Osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי משותף עם שורות תאים של סרטן השד

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for immunotherapies. Recent clinical advances in immunotherapy highlight the need for reproducible methods to accurately and thoroughly characterize the tumor and its associated immune infiltrate. Tumor enzymatic digestion and flow cytometric analysis allow broad characterization of numerous immune cell subsets and phenotypes; however, depth of analysis is often limited by fluorophore restrictions on panel design and the need to acquire large tumor samples to observe rare immune populations of interest. Thus, we have developed an effective and high throughput method for separating and enriching the tumor immune infiltrate from the non-immune tumor components. The described tumor digestion and centrifugal density-based separation technique allows separate characterization of tumor and tumor immune infiltrate fractions and preserves cellular viability, and thus, provides a broad characterization of the tumor immunologic state. This method was used to characterize the extensive spatial immune heterogeneity in solid tumors, which further demonstrates the need for consistent whole tumor immunologic profiling techniques. Overall, this method provides an effective and adaptable technique for the immunologic characterization of subcutaneous solid murine tumors; as such, this tool can be used to better characterize the tumoral immunologic features and in the preclinical evaluation of novel immunotherapeutic strategies.

Here we describe a method to separate and enrich components of the tumor immune and non-immune microenvironment in established subcutaneous tumors. This technique allows for the separate analysis of tumor immune infiltrate and non-immune tumor fractions which can permit comprehensive characterization of the tumor immune microenvironment.

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

מודל מורנה של גידולים גרורות בכבד בהגדרה של איסכמיה Reperfusion פציעה

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

קבלת סרטן גזע כדורים מגינקולוגית סרטן השד גידולים

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties make it an excellent in vivo experimental model to study angiogenesis, tumor growth, drug delivery systems, or photodynamic diagnosis (PDD) and photodynamic therapy (PDT). At the same time, this model addresses the requirement for the replacement of experimental animals with a suitable alternative. Ex ovo cultivated embryo allows easy substance application, access, monitoring, and documentation. The most frequently used is chick CAM; however, this article describes the advantages of the Japanese quail CAM as a low-cost and high-throughput model. Another advantage is the shorter embryonic development, which allows higher experimental turnover. The suitability of quail CAM for PDD and PDT of cancer and microbial infections is explored here. As an example, the use of the photosensitizer hypericin in combination with lipoproteins or nanoparticles as a delivery system is described. The damage score from images in white light and changes in fluorescence intensity of the CAM tissue under violet light (405 nm) was determined, together with analysis of histological sections. The quail CAM clearly showed the effect of PDT on the vasculature and tissue. Moreover, changes like capillary hemorrhage, thrombosis, lysis of small vessels, and bleeding of larger vessels could be observed. Japanese quail CAM is a promising in vivo model for photodynamic diagnosis and therapy research, with applications in studies of tumor angiogenesis, as well as antivascular and antimicrobial therapy.

The chorioallantoic membrane (CAM) of the avian embryo is a very useful and applicable tool for various areas of research. A special ex ovo model of Japanese quail CAM is suitable for photodynamic treatment investigation.

ממברנת שליו כוריואלנטואית - כלי לאבחון וטיפול פוטודינמי

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes significantly. Genetically engineered murine models that mimic ATC&#39;s progression may help researchers to study treatments for this disease. Crossing three different genotypes of mice, a TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53&#916;ex2-10/&#916;ex2-10&#160;transgenic ATC model was developed. The ATC murine model was induced by an intraperitoneal injection of tamoxifen with overexpression of BrafV600E and deletion of Trp53, and the tumors were generated within about 1 month. High-resolution ultrasound was applied to investigate the tumor initiation and progression, and the dynamic growth curve was obtained by measuring the tumor sizes. Compared to magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography scanning, ultrasound has advantages in observing the ATC murine model, such as being noninvasive, portable, in real-time, and without radiation exposure. High-resolution ultrasound is suitable for dynamic and multiple measurements. However, ultrasonographic examination of the thyroid in mice requires relevant anatomical knowledge and experience. This article provides a detailed procedure for utilizing high-resolution ultrasound to scan tumors in the transgenic ATC model. Meanwhile, ultrasonic parameter adjustment, ultrasound scanning skills, anesthesia and recovery of the animals, and other elements that need attention during the process are listed.

The present protocol describes high-frequency ultrasonography for visualizing the entire mouse thyroid gland and monitoring the growth of anaplastic thyroid carcinoma.

אולטרה-סאונד ברזולוציה גבוהה לניתוח גידולי ATC אורתוטופיים במודל עכבר מהונדס גנטית

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...