Wir danken J. Vaughen für kritisches Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 und The Takeda Science Foundation Research Grant zu YT

1. Fliegen Sie Kreuze und Klon Induktion <ol><li> Entfernen Sie alle Fliegen in der Durchstechflasche 12 h, bevor Sie Jungfliegen sammeln. </li><li> Anästhesieren Sie die Fliegen in der Durchstechflasche, indem Sie CO 2 -Gas injizieren und Fliegen auf ein CO 2 -Flugpad legen. </li><li> Übertragen Sie 10 - 20 Jungfrauen und 10 Männer aus dem CO 2 Fliegenkissen in eine frische Ampulle und inkubieren für 1 Tag bei 25 ° C. </li><li> Übertragen Sie diese Fliegen in eine frische Ampulle und inkubieren für 12 h bei 25 ° C. HINWEIS: Verwerfe die erste Durchstechflasche als Jungfrau Weibchen legen nicht genug Eier am ersten Tag. </li><li> Für Enhancer-GAL4-Linien entfernen Sie die erwachsenen Fliegen und inkubieren die Durchstechflasche bei 25 ° C bis zur Dissektion. </li><li> Zur Induktion von Mosaikklonen durch Flip-out-GAL4, entfernen Sie die erwachsenen Fliegen und inkubieren Sie die Durchstechflasche für 2 - 4 Tage bei 25 ° C. Die Inkubationszeit vor Hitzeschock ist abhängig vom experimentellen Zweck. Ein Hitzeschock 2 Tage nach Eiablagerung (AED) erzeugt Mosaikklone in unreifer SekundeImagin imaginale epithelien Ein Hitzeschock nach 3 oder 4 Tagen AED erzeugt Mosaikklone im differenzierten frühen bis mittleren Drittel der imaginären Epithelien. HINWEIS: Es ist wichtig, die Wirkung eines veränderten Hitzeschock-Timings auf tumorigene Phänotypen zu untersuchen. </li><li> Zur Induktion von Mosaikklonen durch Flip-out-GAL4 wird die Durchstechflasche durch Eintauchen in ein 37 ° C-Wasserbad für 10 - 45 min erhitzt, gefolgt von einer Inkubation für 2 - 3 Tage bei 25 ° C. HINWEIS: Die Informationen über die Hitzeschockzeit, das Timing und die Inkubationszeit in jedem Experiment sind in den Figuren der Legenden dargestellt. </li></ol> 2. Dissektion von Larven <ol><li> Sammeln Sie wandernde dritte Larven mit einem Holzstab oder einer stumpfen Pinzette, indem Sie sie durch geeignete fluoreszierende Marker ( z. B. EGFP) unter einem fluoreszierenden stereoskopischen Mikroskop herotypisieren und in eine Dissektion mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) geben. </li><li> Die Larven in PBS durch Pipettieren mit 2 ml Plastikübertragungspipetten waschen. </li><li>Klemmen Sie die Mitte der Larve mit einer Pinzette und reißen den Körper in der Hälfte mit der anderen Pinzette. </li><li> Klemmen Sie den Mundhaken der vorderen Hälfte mit einer Pinzette und schieben Sie den Mund in Richtung des Körpers mit der anderen Pinzette, um den Körper von innen nach außen zu drehen. </li><li> Entfernen Sie unnötige Materialien wie Speicheldrüsen oder Fettkörper mit Pinzette. </li></ol> 3. Fixierung und Antikörperfärbung <ol><li> Übertragen Sie die seziertes vordere Hälfte des Larvenkörpers (einschließlich der imaginären Flügelscheiben) auf ein 1,5 ml Plastikrohr und fixieren Sie in 1 ml Fixlösung (4% Formaldehyd in PBS) für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln unter leichter Rotation. ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig und hat krebserzeugendes Potential. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Kleidung, um den Hautkontakt zu vermeiden. ANMERKUNG: In diesem Teil finden alle Schritte auf einem Nutator bei Raumtemperatur im Dunkeln statt, wenn nicht anders angegeben. </li><li> Entfernen Sie die Fix-Lösung und entsorgen Sie sie. Waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT (0,3% TritAuf X-100 in PBS) dreimal für jeweils 15 min. </li><li> Entfernen Sie die PBT und fügen Sie 1 ml PBTG (0,2% Rinderserumalbumin und 5% normales Ziegenserum in PBT) zum Blockieren und Nähren von 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C hinzu. </li><li> Entfernen Sie PBTG und fügen Sie eine primäre Antikörperlösung hinzu, die in geeigneter Weise mit PBTG verdünnt ist (siehe Materialtabelle ) und über Nacht bei 4 ° C nähren. </li><li> Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT dreimal für jeweils 15 min. </li><li> PBT entfernen und sekundäre Antikörperlösung entsprechend mit PBTG (1: 400) verdünnen lassen. Für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Sekundäre Antikörperlösung entfernen und das Gewebe mit je 1 mL PBT zweimal für jeweils 15 min waschen. </li><li> Um F-Aktin zu färben, PBT zu entfernen und Phalloidin-Lösung zuzugeben, die in PBS (1:40) in geeigneter Weise verdünnt ist. Dann für 20 min nähren. Entfernen Sie die Phalloidin-Lösung und waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT zweimal für jeweils 15 min. </li><li> Um Nuklear-DNA zu bekämpfen, PBT zu entfernen und DAPI (4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol) -Lösung (0,5 μg / ml DAPI in PBS) zuzugeben. Dann 10 min nähren. ACHTUNG: DAPI hat krebserzeugendes Potential. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Kleidung, um den Hautkontakt zu vermeiden. </li><li> DAPI-Lösung entfernen und das Gewebe mit je 1 mL PBT zweimal für jeweils 15 min waschen. </li><li> Spülen Sie einmal in 1 ml PBS für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie PBS und fügen Sie 500 μl 100% Glycerin als Vormontagemedium hinzu. </li></ol> 4. Montage auf Mikroskop-Objektträger <ol><li> Legen Sie die gefärbten Gewebe auf eine Objektträger mit einer 2 ml Plastik-Transferpipette. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe auf Tropfen des Montagemediums auf einem anderen Mikroskop-Objektträger mit Pinzette. </li><li> Halten Sie das Ende des zerlegten Gewebes mit einer Pinzette und ziehen Sie Gehirn und Augen Antenne Scheiben mit der anderen Pinzette. HINWEIS: Halten Sie die zerlegten Gehirne, um sie in der Nähe der Flügel imaginären Discs zu platzieren. Die Gehirne fungieren als Plattform, die verhindert, dass das Deckglas die Flügel-Imagialscheiben zermalmt. </li><li> Um die Flügel-imaginären Scheiben zu isolieren, halten Sie das Ende des zerlegten Gewebes mit einer Pinzette fest und kratzen sanft die Körperwand und reißen die Scheiben mit der anderen Pinzette ab. HINWEIS: Wenn es schwierig ist, Flügel imaginäre Scheiben zu finden, schälen Sie die Trachea von der hinteren zur vorderen Seite. Flügel-imaginäre Scheiben bleiben an der Trachea. </li><li> Die imaginären Scheiben vorsichtig mit einem Deckglas und einer Dichtung mit Nagellack bedecken; Bei 4 ° C aufbewahren. </li></ol> 5. Konfokale Mikroskopie <ol><li> Um konfokale Bilder unter Verwendung eines konfokalen Mikroskopsatz-Bilderfassungsparameters einschließlich des Bereichs der Emissionswellenlänge, der Laserintensität, des Verstärkungsfaktors, des Versatzes, der Abtastgeschwindigkeit und der Bildgröße 24 zu erhalten, HINWEIS: Detaillierte Vorgehensweise bei der Einstellung der Bildaufnahme finden Sie in der Bedienungsanleitung des jeweiligen Mikroskopherstellers. </li><li> Um einzelne co zu erfassenNfocal Abschnitte einer ganzen Flügel imaginären Scheibe, verwenden Sie ein 20X Objektiv Objektiv. </li><li> Erfassen Sie dreidimensionale Bilder durch z-Stapel-Scannen bei Schrittgröße von 0,5 - 1,0 μm mit 40X- oder 60X-Linsen. HINWEIS: Um zelluläre Phänotypen in hoher Auflösung zu analysieren, sollte eine Bildgröße größer als 512 x 512 Pixel sein. </li></ol> 6. Bildanalyse mit ImageJ <ol><li> Verwenden Sie Fidschi, eine Open-Source-ImageJ-Software, die sich auf die biologische Bildanalyse (https://fiji.sc/) 25 konzentriert , um konfokale z-Stack-Bilder zu erfassen und zu analysieren. </li><li> Um vertikale Abschnitte zu erwerben, öffnen Sie die Z-Stack-Bilder in ImageJ und wählen den Menüpunkt &quot;Image / Stacks / Reslice&quot;. HINWEIS: Im Menü Reslice sind entweder die XZ-Achse oder die YZ-Achse wählbar. Der vertikale Abschnitt kann auch in einer beliebigen Richtung erhalten werden, indem eine gerade Linie oder ein Rechteck auf das z-Stapelbild gezeichnet wird. </li></ol> 7. Diagnose von neoplastischen Phänotypen <ol><li> Öffnen Sie die Vertikale(XZ- oder YZ-Achse), die aus einem Satz von Z-Stack-Bildern erhalten wurden und morphologische Phänotypen und Antikörper-Färbung analysieren. </li><li> Für die Diagnose von Tumor-Phänotypen konzentrieren sich vor allem auf die folgenden drei Punkte: (1) Wenn eine Zellmasse, einschließlich Knockdown-Klone, von der Hauptepithelschicht abweicht, (2) wenn die subzelluläre Lokalisation von junctionalen Proteinen in dieser Zellmasse verändert wird , Und (3) wenn der Durchmesser dieser Zellmasse größer als 4 Zellen ist. </li><li> Kategorisieren Sie Tumor-Phänotypen gemäß dem in Abbildung 1 beschriebenen Flussdiagramm. </li></ol>

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	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila.">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li><li>Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+in+cancer+research.+An+expanding+role.">Drosophila in cancer research. An expanding role.</a> Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).</li><li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila.">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li><li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis.">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).</li><li>Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+proliferation+control:+links+from+the+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressors.">Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors.</a> Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).</li><li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble/Dlg/Lgl+polarity+module.">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).</li><li>Huang, L., Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+alterations+in+carcinoma:+a+focus+on+emerging+roles+for+polarity+regulators.">Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).</li><li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila.">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li><li>Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+tumor+suppression+and+epithelial+maintenance+by+endocytic+activation+of+Eiger/TNF+signaling+in+Drosophila.">Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).</li><li>Tamori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Lgl+and+Mahjong/VprBP+in+cell+competition.">Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition.</a> PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).</li><li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+diverts+a+host+TNF+tumor+suppressor+activity+into+tumor+promoter.">Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li><li>Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+Sas+and+its+receptor+PTP10D+drive+tumour-suppressive+cell+competition.">The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition.</a> Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).</li><li>Vaughen, J., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit-Robo+Repulsive+Signaling+Extrudes+Tumorigenic+Cells+from+Epithelia.">Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia.</a> Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).</li><li>Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Tumors+Originate+in+Tumor+Hotspots,+a+Tissue-Intrinsic+Microenvironment.">Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment.</a> PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).</li><li>Ohsawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oncogenic+neighbors+by+JNK-mediated+engulfment+in+Drosophila.">Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila.</a> Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).</li><li>Men&#233;ndez, J., P&#233;rez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tumor-suppressing+mechanism+in+Drosophila+involving+cell+competition+and+the+Hippo+pathway.">A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).</li><li>Hogan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+interface+between+normal+and+transformed+epithelial+cells.">Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells.</a> Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).</li><li>Kajita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+surrounding+normal+epithelial+cells+influences+signalling+pathways+and+behaviour+of+Src-transformed+cells.">Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).</li><li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Scribble+causes+cell+competition+in+mammalian+cells.">Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells.</a> J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).</li><li>Wagstaff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+cell+competition+kills+cells+via+induction+of+lethal+p53+levels.">Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels.</a> Nat Commun. 7, 1-14 (2016).</li><li>Kajita, M., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDAC:+Epithelial+defence+against+cancer-cell+competition+between+normal+and+transformed+epithelial+cells+in+mammals.">EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals.</a> J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Jory, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+6,300+genomic+fragments+for+cis-regulatory+activity+in+the+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster.">A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).</li><li>Rodrigues, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+STAT+regulates+growth+and+induces+competitive+interactions+independently+of+Myc,+Yorkie,+Wingless+and+ribosome+biogenesis.">Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis.</a> Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).</li><li>Khan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+neoplasia+in+Drosophila+entails+switch+to+primitive+cell+states.">Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).</li><li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior.">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li><li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics.">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li><li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+design:+how+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood.">Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li><li>Nakajima, Y. -. I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+junctions+maintain+tissue+architecture+by+directing+planar+spindle+orientation.">Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation.</a> Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).</li><li>Colombani, J., Andersen, D. S., L&#233;opold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+peptide+Dilp8+coordinates+Drosophila+tissue+growth+with+developmental+timing.">Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing.</a> Science. 336 (6081), 582-585 (2012).</li><li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation.">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das GAL4-UAS-System ist eines der leistungsstärksten genetischen Werkzeuge für die gezielte Genexpression in Drosophila 26 und erleichtert die Injektion und Analyse von Tumorzellen in vivo 4 . Dieses System ermöglicht die Erzeugung von Klonen, die den Knockdown von Tumorsuppressorgenen oder die Überexpression von Onkogenen im Wildtyp-Epithelgewebe tragen, eine Situation, die den Anfangsstadien des menschlichen Krebses sehr ähnlich ist, wo transformie...

Epithelgewebe sind hoch organisierte Systeme, die die bemerkenswerte homöostatische Fähigkeit haben, ihre Organisation durch Entwicklung und Zellumsatz zu erhalten. Dieses robuste Selbstorganisationssystem wird jedoch während der Tumorentwicklung zunehmend unterbrochen. Zu Beginn der Tumorentwicklung treten einzelne Mutantenzellen aus der Onkogenaktivierung oder der Tumor-Suppressor-Gen-Inaktivierung innerhalb einer Epithelschicht auf. Wenn diese transformierte &quot;Pro-Tumor-Zelle&quot; einer unterdrückenden Umgebung entzieht, die Epithelorganisation stört und unkontrollierte Proliferation beginnt, tritt die Tumorentstehung auf 1 . In den vergangenen Jahrzehnten haben herausragende technologische Fortschritte in der Genetik und Molekularbiologie bemerkenswerte Fortschritte bei der Krebsforschung gemacht. Insbesondere wurden neuere Studien unter Verwendung der genetischen Mosaikanalyse-Werkzeuge in Drosophila melanogaster , wie FLP-FRT (Flippase-Rekombinase / Flippase-Rekombinase-Target) mitotisches RekombinatAtion 2 und Flip-out-GAL4-UAS (Upstream-Aktivierungssequenz) -Systeme 3 haben wesentlich dazu beigetragen, die genetischen Mechanismen der Bildung und Metastasierung der Tumore 4 , 5 , 6 besser zu verstehen. Untersuchungen einer Gruppe konservierter Drosophila- Tumor-Suppressor-Gene, tödlicher Riesen-Larven ( lgl ), Scheiben groß ( dlg ) und Scribble ( Scrib ), unterstrichen die kritische Beziehung zwischen dem Verlust der Epithelorganisation und der Tumorentwicklung, da diese Gene eine Schlüsselrolle spielen In Regulation der apikalen Basalzellpolarität und Zellproliferation in Epithelgeweben 7 . Während Drosophila- Imagialscheiben normalerweise monolayered Epithelien sind, verursachen homozygote Mutationen in einem dieser drei Gene Zellen zu verlieren Struktur und Polarität, nicht zu unterscheidenVermietung, überproliferieren und letztlich mehrschichtige amorphe Massen bilden, die mit angrenzenden Geweben verschmelzen 7 . Ebenso ist die Störung dieser Gene bei Säugetieren an der Entwicklung von bösartigen Tumoren beteiligt 8 , 9 . Die neoplastischen Phänotypen, die von den mutierten Geweben gezeigt wurden, führten zur Klassifizierung dieser drei Gene als konservierte, neoplastische Tumorsuppressorgene (nTSGs) 7 , 8 . Wenn jedoch homozygote nTSG-Mutantenzellen sporadisch bei der Entwicklung von Wildtyp-Imagialscheiben unter Verwendung von FLP-FRT-vermittelter mitotischer Rekombination erzeugt werden, werden mutierte Zellen aus dem Gewebe durch c-Jun-N-terminale Kinase (JNK) -abhängige Apoptose 10 , 11 eliminiert , 12 , 13 , 14 , Extrusion 15 </suP&gt; , 16 oder Engagierung und Phagozytose durch Nachbarn 17 . In diesen genetisch mosaischen Epithelien wird die Apoptose meist in nTSG-Mutantenzellen, die sich an der Klongrenze befinden, nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass benachbarte normale Zellen die Apoptose der nTSG-Mutantenzellen 10 , 11 , 12 , 18 auslösen. Jüngste Studien in Säugetierzellen haben bestätigt, dass diese zellwettbewerbsabhängige Eliminierung von Pro-Tumor-Zellen ein evolutionär konservierter epithelialer Selbstverteidigungsmechanismus gegen Krebs ist. 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Eine neuere Studie in Drosophila- Imagialscheiben zeigte jedoch, dass Mosaik-NTSG-Knockdown-Klone neoplastische Tumore induzierenIc Bereiche von Flügel imaginären Scheiben 16 . Die anfängliche Tumorbildung fand sich immer in der peripheren &quot;Scharnierregion&quot; und wurde niemals im zentralen &quot;Beutel&quot; -Bereich des Flügelscheibenepithels beobachtet, was darauf hindeutet, dass das tumorigene Potential der nTSG-Knockdown-Zellen von der lokalen Umgebung abhängt. Der zentrale Beutelbereich fungiert als &quot;Tumor-Kaltfleck&quot;, wo Pro-Tumor-Zellen keine dysplastische Überwucherung zeigen, während sich die periphere Scharnierregion wie ein &quot;Tumor-Hotspot&quot; 16 verhält. In &quot;Kaltfleck&quot; Beutelregionen delaminieren nTSG-Knockdown-Zellen von der Basalseite und unterziehen sich der Apoptose. Im Gegensatz dazu, als &quot;Hotspot&quot; Scharnierzellen besitzen ein Netzwerk von robusten zytoskeletalen Strukturen auf ihren basalen Seiten, nTSG-Knockdown-Zellen delaminieren von der apikalen Seite des Epithels und initiieren tumorigene Überwucherung 16 . Daher erfordert die Analyse von Tumor-Phänotypen in imaginären Scheiben sorgfältige consiVerringerung der regionsspezifischen Anfälligkeit für tumorigene Reize. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion der neoplastischen Tumorbildung in den Drosophila- Flügel-Imaginalscheiben unter Verwendung des GAL4-UAS- RNAi- Systems, durch das nTSG-Knockdown-Zellen in normalen Flügelscheibenepithelien erzeugt werden. Obwohl diese experimentellen Systeme nützlich sind, um die frühen Stadien von Krebs zu untersuchen, wurde eine eindeutige Klassifizierungsmethode zur Bewertung der Stadien der Tumorprogression in imaginären Scheibenepithelien bisher nicht klar beschrieben. Daher schlagen wir auch eine Diagnosemethode vor, um pro-Tumor-Klon-Phänotypen, die in den Flügelscheibenepithelien induziert werden, in drei Kategorien zu klassifizieren: Hyperplasie (Akkumulation einer übermäßigen Anzahl von normal erscheinenden Zellen mit erhöhter Proliferation), Dysplasie (prämalignes Gewebe, das aus ungewöhnlich erscheinendem zusammengesetzt ist Zellen) und Neoplasien (gutartiger oder bösartiger Tumor aus Zellen mit abnormalem Aussehen und abnormalem Proliferationsmuster).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>162-19321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-11805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Wako</td>
			<td>064-00406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mounting medium, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-Dlg 4F3</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3A6B4, RRID:AB_579780</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3B8D12, RRID:AB_579781</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>5H7B11, RRID:AB_579779</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-atubulin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AA4.3, RRID:AB_579793</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A22283</td>
			<td>dilute in PBS, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11030</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sd-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#8609</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upd-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#26796</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-lgl-RNAi</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi center</td>
			<td>#51247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-scrib-RNAi</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi center</td>
			<td>#105412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-RasV12</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#64196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Yki3SA</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#28817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsFLP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act&#62;CD2&#62;GAL4 (flip-out GAL4)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#4780</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-EGFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#5428</td>
			<td>X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-EGFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#6658</td>
			<td>third chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Dicer2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#24650</td>
			<td>second chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Dicer2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#24651</td>
			<td>third chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vkg-GFP</td>
			<td>Morin et al. 2001</td>
			<td></td>
			<td>GFP protein trap</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia

In den frühen Stadien des Krebses zeigen transformierte mutierte Zellen zytologische Anomalien, beginnen unkontrollierte Überwucherung und zerstören die Gewebeorganisation schrittweise. Drosophila melanogaster hat sich als ein populäres experimentelles Modellsystem in der Krebsbiologie entwickelt, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu untersuchen. Insbesondere genetische Werkzeuge für Drosophila- Imagialscheiben (Entwicklung von Epithelien in Larven) ermöglichen die Entstehung von transformierten Pro-Tumor-Zellen innerhalb eines normalen Epithelgewebes, eine Situation ähnlich der Anfangsphase des menschlichen Krebses. Eine neuere Studie der Tumorentstehung in Drosophila- Flügel-Imaginalscheiben zeigte jedoch, dass die Tumorinitiierung von der gewebe-intrinsischen Cytoarchitektur und der lokalen Mikroumgebung abhängt, was darauf hindeutet, dass es wichtig ist, die regionsspezifische Anfälligkeit für tumorigene Reize bei der Bewertung von Tumor-Phänotypen im imaginären Bereich zu berücksichtigen Scheiben Zur Erleichterung der phänotypischen Analyse von Tumor progressiIn imaginären Scheiben beschreiben wir hier ein Protokoll für genetische Experimente mit dem GAL4-UAS-System, um neoplastische Tumore in Flügel-imaginären Scheiben zu induzieren. Wir stellen ferner eine Diagnosemethode vor, um die Phänotypen von in imaginären Epithelien induzierten klonalen Läsionen zu klassifizieren, da eine klare Klassifizierungsmethode zur Unterscheidung verschiedener Stadien der Tumorprogression (wie Hyperplasie, Dysplasie oder Neoplasie) bisher nicht beschrieben wurde. Diese Methoden können weitgehend auf die Klonanalyse von Tumor-Phänotypen in verschiedenen Organen in Drosophila anwendbar sein.

Um die neoplastische Tumorbildung, die experimentell durch RNAi- vermittelte NTSG-Knockdown in Drosophila- Flügel-Imagialscheiben induziert wurde, zu demonstrieren, wurden drei verschiedene GAL4-Treiber verwendet, um UAS-RNAi für lgl oder scrib auszudrücken : (1) sd-GAL4, das eine starke UAS-Expression in der Flügelbeutel und milde Expression in den Scharnierbereichen ( Fig. 2 und <strong class="xfig"...

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Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Mosaik Klonanalyse in Drosophila imaginären Scheibenepithelien ist ein leistungsfähiges Modellsystem, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von Tumoren in Drosophila Flügel imaginären Scheiben mit dem GAL4-UAS-System, und führen Sie eine Diagnose-Methode, um die Tumor-Phänotypen zu klassifizieren.

Induktion und Diagnose von Tumoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

14.8K Aufrufe.  SOKENDAI.  Mosaik Klonanalyse in Drosophila imaginären Scheibenepithelien ist ein leistungsfähiges Modellsystem, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von Tumoren in Drosophila Flügel imaginären Scheiben mit dem GAL4-UAS-System, und führen Sie eine Diagnose-Methode, um die Tumor-Phänotypen zu klassifizieren. 

Serie: Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Forschung

Krebsforschung

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Entwicklung eines menschlichen präklinischen Modell der Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten Co mit Brustkrebszelllinien kultiviert

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for immunotherapies. Recent clinical advances in immunotherapy highlight the need for reproducible methods to accurately and thoroughly characterize the tumor and its associated immune infiltrate. Tumor enzymatic digestion and flow cytometric analysis allow broad characterization of numerous immune cell subsets and phenotypes; however, depth of analysis is often limited by fluorophore restrictions on panel design and the need to acquire large tumor samples to observe rare immune populations of interest. Thus, we have developed an effective and high throughput method for separating and enriching the tumor immune infiltrate from the non-immune tumor components. The described tumor digestion and centrifugal density-based separation technique allows separate characterization of tumor and tumor immune infiltrate fractions and preserves cellular viability, and thus, provides a broad characterization of the tumor immunologic state. This method was used to characterize the extensive spatial immune heterogeneity in solid tumors, which further demonstrates the need for consistent whole tumor immunologic profiling techniques. Overall, this method provides an effective and adaptable technique for the immunologic characterization of subcutaneous solid murine tumors; as such, this tool can be used to better characterize the tumoral immunologic features and in the preclinical evaluation of novel immunotherapeutic strategies.

Here we describe a method to separate and enrich components of the tumor immune and non-immune microenvironment in established subcutaneous tumors. This technique allows for the separate analysis of tumor immune infiltrate and non-immune tumor fractions which can permit comprehensive characterization of the tumor immune microenvironment.

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

Murine Modell der metastasierenden Lebertumoren in der Einstellung der Ischämie Reperfusionsverletzung

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Beschaffung von Krebsstammzellkugeln aus gynäkologischen und Brustkrebstumoren

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties make it an excellent in vivo experimental model to study angiogenesis, tumor growth, drug delivery systems, or photodynamic diagnosis (PDD) and photodynamic therapy (PDT). At the same time, this model addresses the requirement for the replacement of experimental animals with a suitable alternative. Ex ovo cultivated embryo allows easy substance application, access, monitoring, and documentation. The most frequently used is chick CAM; however, this article describes the advantages of the Japanese quail CAM as a low-cost and high-throughput model. Another advantage is the shorter embryonic development, which allows higher experimental turnover. The suitability of quail CAM for PDD and PDT of cancer and microbial infections is explored here. As an example, the use of the photosensitizer hypericin in combination with lipoproteins or nanoparticles as a delivery system is described. The damage score from images in white light and changes in fluorescence intensity of the CAM tissue under violet light (405 nm) was determined, together with analysis of histological sections. The quail CAM clearly showed the effect of PDT on the vasculature and tissue. Moreover, changes like capillary hemorrhage, thrombosis, lysis of small vessels, and bleeding of larger vessels could be observed. Japanese quail CAM is a promising in vivo model for photodynamic diagnosis and therapy research, with applications in studies of tumor angiogenesis, as well as antivascular and antimicrobial therapy.

The chorioallantoic membrane (CAM) of the avian embryo is a very useful and applicable tool for various areas of research. A special ex ovo model of Japanese quail CAM is suitable for photodynamic treatment investigation.

Wachtel-Chorioallanto-Membran - ein Werkzeug für die photodynamische Diagnose und Therapie

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes significantly. Genetically engineered murine models that mimic ATC&#39;s progression may help researchers to study treatments for this disease. Crossing three different genotypes of mice, a TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53&#916;ex2-10/&#916;ex2-10&#160;transgenic ATC model was developed. The ATC murine model was induced by an intraperitoneal injection of tamoxifen with overexpression of BrafV600E and deletion of Trp53, and the tumors were generated within about 1 month. High-resolution ultrasound was applied to investigate the tumor initiation and progression, and the dynamic growth curve was obtained by measuring the tumor sizes. Compared to magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography scanning, ultrasound has advantages in observing the ATC murine model, such as being noninvasive, portable, in real-time, and without radiation exposure. High-resolution ultrasound is suitable for dynamic and multiple measurements. However, ultrasonographic examination of the thyroid in mice requires relevant anatomical knowledge and experience. This article provides a detailed procedure for utilizing high-resolution ultrasound to scan tumors in the transgenic ATC model. Meanwhile, ultrasonic parameter adjustment, ultrasound scanning skills, anesthesia and recovery of the animals, and other elements that need attention during the process are listed.

The present protocol describes high-frequency ultrasonography for visualizing the entire mouse thyroid gland and monitoring the growth of anaplastic thyroid carcinoma.

Hochauflösende Sonographie zur Analyse orthotoper ATC-Tumoren in einem gentechnisch veränderten Mausmodell

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...