Makalenin eleştirel okunması için J. Vaughen&#39;e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, JSPS KAKENHI Grant Numaraları 26891025, 15H01500 ve YT&#39;ye Takeda Bilim Vakfı Araştırma Yardımı hibeleri tarafından desteklenmiştir.

1. Fly Haçlar ve Klon İndüksiyonu <ol><li> Bakire flies toplamadan önce flakona 12 saat boyunca tüm sinekler çıkarın. </li><li> Şişe içindeki sinekleri CO 2 gazı enjekte ederek anestezi altına alın ve CO 2 sineklik pedi üzerine sinek yerleştirin. </li><li> 10 - 20 bakire dişiyi ve 10 erkek, CO 2 sineklik pedinden yeni bir tüp içine aktarın ve 1 gün süreyle 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bu sinekleri yeni bir flakona aktarın ve 12 saat 25 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: Bakire dişiler ilk gün yeterli miktarda yumurta bırakmadığı için ilk flakonu atın. </li><li> Geliştirici-GAL4 hatları için, yetişkin sinekleri çıkarın ve diseksiyona kadar 25 ° C&#39;de flakonu inkübe edin. </li><li> Mozaik klonların flip-out-GAL4 ile indüksiyonu için, yetişkin sinekleri çıkarın ve 25 ° C&#39;de 2-4 gün inkübe edin. Isı şoku öncesi inkübasyon süresi deneysel amaca bağlıdır. Yumurta tortulaştırmasından 2 gün sonra bir ısı şoku (AED) olgunlaşmamış ikinci mozaik klonlar üretirInstar imaginal epitel. 3 veya 4 gün sonra bir ısı şoku AED, erken-orta üçüncül instar imaginal epitelyumda ayırt edilen mozaik klonlar üretir. NOT: Değiştirilmiş ısı şoku zamanlamasının tümöre özgü fenotipler üzerindeki etkisini incelemek önemlidir. </li><li> Mozaik klonların flip-out-GAL4 ile indüksiyonu için flakonu, 37 ° C&#39;lik bir su banyosuna 10-45 dakika batırın, ardından 25 ° C&#39;de 2 - 3 gün inkübe edin. NOT: Her bir deneydeki ısı şoku zamanı, zamanlaması ve kuluçka süresi bilgileri şekil şekillerinde gösterilmiştir. </li></ol> 2. Larvaların Diseksiyonu <ol><li> Bir flüoresan stereoskopik mikroskop altında uygun floresan işaretleyiciler ( örn. , EGFP) tarafından genotip onları ahşap bir sopa veya künt forseps ile dolaşıp üçüncü instar larvaları toplayın ve onları PBS (fosfat tamponlu salin) ile bir diseksiyon çanak yerleştirin. </li><li> 2 mL plastik transfer pipet ile pipetleme PBS içinde larvaları yıkayın. </li><li>Bir forsepsle larva merkezini sıkıştırın ve diğer forsepslerle vücudunuzu yarısı kadar yırtın. </li><li> Ön yarımın ağız kancasını bir forsepsle sıkıştırın ve vücudu içeri doğru dışarı çevirmek için ağzı diğer forsepslerle vücuda doğru itin. </li><li> Tükrük bezleri veya yağ cisimleri gibi gereksiz malzemeleri forsepsle çıkarın. </li></ol> 3. Fiksasyon ve Antikor Boyama <ol><li> 1.5 mL&#39;lik bir plastik tübün içine larval gövdenin (yarı kanat diskleri dahil) disseke edilmiş ön yarısını aktarın ve yumuşak rotasyon ile karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca Fix çözeltisinin 1 mL&#39;sinde (PBS&#39;de% 4 formaldehid) sabitleyin. DİKKAT: Formaldehit zehirlidir ve kanserojen potansiyeline sahiptir. Cilt ile temasını önlemek için koruyucu eldiven ve kıyafetler giyin. NOT: Bu bölümde, aksi belirtilmediği sürece, tüm basamaklar karanlıkta oda ısısında bir besleyicide gerçekleşir. </li><li> Fix çözümünü çıkarın ve atın. Dokuları 1 mL PBT (% 0.3 TritPBS&#39;de X-100 üzerinde) üç kez üç kez 15 dakika boyunca uygulandı. </li><li> PBT&#39;yi çıkarın ve 1 saat süreyle oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C&#39;de 1 saat süre ile bloke edip 1 saat süreyle bekletin. PBTG (PBT&#39;de% 0,2 sığır serumu albumin ve% 5 normal keçi serumu) 1 mL ekleyin. </li><li> PBTG&#39;yi çıkarın ve PBTG ile uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve gece boyunca 4 ° C&#39;de hafifçe kavrayın. </li><li> Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile üç kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> PBT&#39;yi çıkarın ve PBTG (1: 400) ile uygun şekilde seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca veya 4 ° C&#39;de gece boyunca nutatlayın. </li><li> İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> F-aktin lekesi için, PBT&#39;yi çıkarın ve PBS (1:40) içinde uygun şekilde seyreltilmiş Phalloidin çözeltisi ekleyin. Sonra 20 dakika boyunca kestirin. Phalloidin çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Nükleer DNA&#39;yı kontrast haline getirmek için PBT&#39;yi çıkarın ve DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisini ekleyin (PBS içerisinde 0.5 μg / mL DAPI). Sonra 10 dk. DİKKAT: DAPI kanserojen potansiyele sahiptir. Cilt ile temasını önlemek için koruyucu eldiven ve kıyafetler giyin. </li><li> DAPI çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> 1 mL PBS&#39;de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir kez yıkayın. </li><li> PBS&#39;yi çıkarın ve ön montaj ortamı olarak 500 μL% 100 gliserol ekleyin. </li></ol> 4. Mikroskop Slaytlarına Monte Edilmesi <ol><li> 2 mL plastik transfer pipet kullanarak mikroskop lamı üzerine lekelenmiş dokuları yerleştirin. </li><li> Dokuları, forseps ile başka bir mikroskop slayt üzerinde montaj orta damla için aktarın. </li><li> Diseksiyon dokusunun ucunu bir forsepsle basılı tutun ve diğer forsepslerle beyin ve göz antennal disklerini çekin. NOT: Parçalanmış beyinleri kanat görüntü disklerine yakın konumda tutun. Beyin, lamellerin kanat imgesel disklerini ezmesini engelleyen bir platform gibi hareket eder. </li><li> Kanat imaginal disklerini izole etmek için diseksiyon yapılan dokunun ucunu bir forsepsle tutun ve vücut duvarını hafifçe çizin ve diğer forsepslerle diskleri yırtın. NOT: Kanat imaginal diskleri bulmak zorsa, trakeayı posteriordan anteriora doğru soyun. Kanat imaginal diskleri trakeaya yapışır. </li><li> Düşünceli diskleri bir lamel ve nail polisaj ile hafifçe örtün; 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 5. Konfokal Mikroskopi <ol><li> Bir konfokal mikroskop kullanarak konfokal görüntüler elde etmek için emisyon dalga boyu aralığı, lazer yoğunluğu, kazanç, ofset, tarama hızı ve görüntü boyutu dahil olmak üzere görüntü toplama parametreleri ayarlayın 24 . NOT: Görüntü elde etme ayarlarının ayrıntılı prosedürü için, her mikroskop üreticisinin verdiği kullanım kılavuzuna bakın. </li><li> Tek bir ortak yakalamak içinTüm kanat imgesel diskinin nfokal bölümleri, 20X nesnel bir lens kullanın. </li><li> 40X veya 60X mercekleri kullanarak 0,5 - 1,0 μm adım boyutunda z-yığın taraması ile 3 boyutlu görüntüler elde edin. NOT: Yüksek çözünürlükte hücresel fenotipleri analiz etmek için bir görüntü boyutu 512 x 512 pikselden daha büyük olmalıdır. </li></ol> 6. ImageJ kullanarak Görüntü Analizi <ol><li> Konfokal z-yığın görüntülerini elde etmek ve analiz etmek için biyolojik görüntü analizine (https://fiji.sc/) 25 odaklanmış açık kaynaklı ImageJ yazılımı olan Fiji&#39;yi kullanın. </li><li> Dikey bölümler elde etmek için, ImageJ&#39;deki z-yığın görüntülerini açın ve &quot;Image / Stacks / Reslice&quot; menü öğesini seçin. NOT: Reslice menüsünde XZ ekseni veya YZ ekseni seçilebilir. Düşey kesit, z-yığın resmine düz bir çizgi veya dikdörtgen çizerek keyfi bir yönde de elde edilebilir. </li></ol> 7. Neoplastik Fenotiplerin Teşhisi <ol><li> Dikey açmaBir dizi z-yığın görüntüsünden elde edilen kesitler (XZ veya YZ ekseni) ve morfolojik fenotipleri ve antikor boyamasını analiz eder. </li><li> Tümör fenotiplerinin teşhisi için, esas olarak aşağıdaki üç noktaya odaklanmak: (1) knockdown klonları da dahil olmak üzere bir hücre kitlesi ana epitel tabakasından saparsa, (2) junctional proteinlerin subselüler lokalizasyonu bu hücre kütlesi içinde değişirse Ve (3) eğer bu hücre kütlesinin çapı 4 hücreden büyükse. </li><li> Şekil 1&#39;de açıklanan akış şemasına göre tümör fenotiplerini kategorize edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila.">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li><li>Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+in+cancer+research.+An+expanding+role.">Drosophila in cancer research. An expanding role.</a> Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).</li><li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila.">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li><li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis.">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).</li><li>Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+proliferation+control:+links+from+the+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressors.">Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors.</a> Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).</li><li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble/Dlg/Lgl+polarity+module.">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).</li><li>Huang, L., Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+alterations+in+carcinoma:+a+focus+on+emerging+roles+for+polarity+regulators.">Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).</li><li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila.">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li><li>Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+tumor+suppression+and+epithelial+maintenance+by+endocytic+activation+of+Eiger/TNF+signaling+in+Drosophila.">Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).</li><li>Tamori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Lgl+and+Mahjong/VprBP+in+cell+competition.">Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition.</a> PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).</li><li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+diverts+a+host+TNF+tumor+suppressor+activity+into+tumor+promoter.">Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li><li>Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+Sas+and+its+receptor+PTP10D+drive+tumour-suppressive+cell+competition.">The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition.</a> Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).</li><li>Vaughen, J., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit-Robo+Repulsive+Signaling+Extrudes+Tumorigenic+Cells+from+Epithelia.">Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia.</a> Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).</li><li>Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Tumors+Originate+in+Tumor+Hotspots,+a+Tissue-Intrinsic+Microenvironment.">Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment.</a> PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).</li><li>Ohsawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oncogenic+neighbors+by+JNK-mediated+engulfment+in+Drosophila.">Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila.</a> Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).</li><li>Men&#233;ndez, J., P&#233;rez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tumor-suppressing+mechanism+in+Drosophila+involving+cell+competition+and+the+Hippo+pathway.">A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).</li><li>Hogan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+interface+between+normal+and+transformed+epithelial+cells.">Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells.</a> Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).</li><li>Kajita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+surrounding+normal+epithelial+cells+influences+signalling+pathways+and+behaviour+of+Src-transformed+cells.">Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).</li><li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Scribble+causes+cell+competition+in+mammalian+cells.">Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells.</a> J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).</li><li>Wagstaff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+cell+competition+kills+cells+via+induction+of+lethal+p53+levels.">Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels.</a> Nat Commun. 7, 1-14 (2016).</li><li>Kajita, M., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDAC:+Epithelial+defence+against+cancer-cell+competition+between+normal+and+transformed+epithelial+cells+in+mammals.">EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals.</a> J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Jory, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+6,300+genomic+fragments+for+cis-regulatory+activity+in+the+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster.">A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).</li><li>Rodrigues, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+STAT+regulates+growth+and+induces+competitive+interactions+independently+of+Myc,+Yorkie,+Wingless+and+ribosome+biogenesis.">Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis.</a> Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).</li><li>Khan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+neoplasia+in+Drosophila+entails+switch+to+primitive+cell+states.">Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).</li><li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior.">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li><li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics.">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li><li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+design:+how+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood.">Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li><li>Nakajima, Y. -. I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+junctions+maintain+tissue+architecture+by+directing+planar+spindle+orientation.">Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation.</a> Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).</li><li>Colombani, J., Andersen, D. S., L&#233;opold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+peptide+Dilp8+coordinates+Drosophila+tissue+growth+with+developmental+timing.">Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing.</a> Science. 336 (6081), 582-585 (2012).</li><li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation.">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

GAL4-UAS sistemi, Drosophila 26&#39;da hedef gen ekspresyonu için en güçlü genetik araçlardan biridir ve in vivo tümör hücresi indüksiyonu ve analizini büyük ölçüde kolaylaştırır 4 . Bu sistem, transforme edilmiş pro-tümör hücrelerinin normal epitel hücreleri tarafından çevrelendiği insan kanserinin başlangıç ​​aşamalarına oldukça benzer bir durum olan, vahşi tipli epitel dokusunda tümör baskılayıcı genlerin dökü...

Epitel dokuları, gelişim ve hücre döngüsü yoluyla organizasyonlarını sürdürmek için olağanüstü homeostatik kabiliyet gösteren oldukça organize sistemlerdir. Bununla birlikte, bu sağlam kendi kendini düzenleyen sistem, tümör gelişiminde aşamalı olarak bozulmaktadır. Tümör gelişiminin başlangıcında, bir onkojen aktivasyonundan ya da tümör süpresör geni inaktivasyonundan kaynaklanan mütasyona uğramış hücreler epitel tabakasında ortaya çıkar. Bu &quot;tümör öncesi hücre&quot;, baskılanmış bir ortamdan kaçınır, epitelin düzenlenmesini bozar ve kontrolsüz çoğalmaya başlar, tümörojenez oluşur 1 . Son birkaç on yıl içinde, genetik ve moleküler biyolojideki olağanüstü teknolojik gelişmeler kanser araştırmaları konusunda kayda değer ilerlemeler kaydetti. Özellikle, Drosophila melanogasterinde genetik olarak mozaik analiz araçlarını kullanan, FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase hedefi) mitoz rekombinası gibi son çalışmalarAtion 2 ve flip-out-GAL4-UAS (upstream aktivasyon dizisi) sistemleri 3 , tümörler 4 , 5 , 6&#39;nın oluşumu ve metastazında rol oynayan genetik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına büyük katkı sağladı. Korunmuş Drosophila tümör süpresör genleri, ölümcül dev larvalar ( lgl ), büyük diskler ( dlg ) ve karalamalı ( scribble ) bir grup üzerinde yapılan çalışmalar, bu genlerin önemli rol oynadığı için epitel organizasyonu kaybı ile tümör gelişimi arasındaki kritik ilişkiyi vurguladı Epitelyal dokularda apikal-bazal hücre polaritesi ve hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde 7 . Drosophila imaginal diskleri normal olarak tek tabaka epiteliyken, bu üç genin herhangi birindeki homozigot mutasyonlar, hücrelerin yapısını ve polaritesini kaybetmesine neden olur, farklılık oluşturmazlarKirletir, aşırı yayar ve nihayetinde komşu dokularla kaynaşan çok tabakalı amorf kütleler oluşturur 7 . Benzer bir şekilde, memelilerde, bu genlerin bozulması, kötü huylu tümörlerin 8, 9 gelişiminde ilgilenmektedir. Mutant dokular tarafından sergilenen neoplastik fenotipler, bu üç genin korunmuş, neoplastik tümör baskılayıcı genler (nTSG&#39;ler) 7 , 8 olarak sınıflandırılmasına yol açtı. Homozigot nTSG mutant hücrelerinin düzensiz FLP FRT aracılı mitotik rekombinasyon kullanılarak vahşi tip hayali diskler geliştirilmesinde oluşturulur Bununla birlikte, mutant hücreler, c-Jun N-terminal kinazın (JNK) bağlı apoptoz 10, 11 aracılığıyla dokunun elenir , 12 , 13 , 14 , ekstrüzyon 15 </suP&gt; , 16 veya komşular tarafından yutkunma ve fagositoz 17 . Bu genetik olarak mozaik epitelyumda, apoptoz çoğunlukla klon sınırında yer alan nTSG mutant hücrelerinde saptanır ve bitişik normal hücrelerin nTSG mutant hücrelerinin apoptozunu tetiklediğini düşündürür. Bu , 10 , 11 , 12 , 18 . Memeli hücrelerinde yapılan son çalışmalar bu tümör öncesi hücrelerin hücre rekabetine bağlı eliminasyonunun kansere karşı evrimsel olarak korunmuş epitelyal bir kendini savunma mekanizması olduğunu doğruladı 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Bununla birlikte, Drosophila imaginal disklerinde yapılan yeni bir çalışmada, mozaik nTSG knockdown klonlarının spesifik olarak neoplastik tümörleri indüklediği gösterilmiştirKanat imgesel disklerin buz bölgeleri 16 . Başlangıçtaki tümör oluşumu periferik &quot;menteşe&quot; bölgesinde daima bulundu ve kanat disk epitelinin merkezi &quot;kese&quot; bölgesinde asla gözlenmedi, bu, nTSG knockdown hücrelerinin tümörojenik potansiyelinin yerel ortama bağlı olduğunu düşündürdü. Merkezi kese bölgesi, pro-tümör hücrelerinin displastik aşırı büyüme göstermediği bir &quot;tümör soğuk noktası&quot; olarak işlev görürken, çevresel menteşe bölgesi &quot;tümör sıcak noktası&quot; olarak davranır 16 . &quot;Soğuk nokta&quot; kese bölgelerinde, nTSG knockdown hücreleri bazal taraftan laminatlaşır ve apoptozise girer. Aksine, &quot;sıcak nokta&quot; menteşe hücreleri, bazal yanlarında sağlam bir sitokkelet yapıları ağı bulunduğundan, nTSG knockdown hücreleri epitelin apikal yanından kat katlanır ve tümöre özgü aşırı büyümeyi başlatır 16 . Bu nedenle, imgesel disklerdeki tümör fenotiplerinin analizi dikkatli bir şekilde yapılmasını gerektirirTümöre özgü uyarılara bölgeye spesifik yatkınlığın azalması. Burada, normal kanat disk epitelinde nTSG knockdown hücrelerinin üretildiği GAL4-UAS- RNAi sistemini kullanan Drosophila kanat imaginal disklerinde neoplastik tümör oluşumunu indükleyen bir protokolü açıkladık. Bu deneysel sistemler kanserin erken safhalarını incelemek için yararlı olsa da, imaginal disk epitelyumundaki tümör progresyon evrelerini değerlendirmek için açık bir sınıflandırma yöntemi daha önce açıklanamamıştır. Bu nedenle, kanat diski epitelyumunda indüklenen tümör öncesi klonal fenotipleri üç kategoriye ayırmak için bir teşhis metodu öneriyoruz: Hiperplazi (artmış proliferasyonu olan aşırı miktarda normal görünen hücrelerin birikimi), displazi (anormal olarak görülen premalign doku Hücreler) ve neoplazi (benign veya malign tümör, anormal görünüm ve anormal proliferasyon paternine sahip hücrelerden oluşur).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>162-19321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-11805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Wako</td>
			<td>064-00406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mounting medium, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-Dlg 4F3</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3A6B4, RRID:AB_579780</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3B8D12, RRID:AB_579781</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>5H7B11, RRID:AB_579779</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-atubulin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AA4.3, RRID:AB_579793</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A22283</td>
			<td>dilute in PBS, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11030</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sd-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#8609</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upd-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#26796</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-lgl-RNAi</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi center</td>
			<td>#51247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-scrib-RNAi</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi center</td>
			<td>#105412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-RasV12</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#64196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Yki3SA</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#28817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsFLP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act&#62;CD2&#62;GAL4 (flip-out GAL4)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#4780</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-EGFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#5428</td>
			<td>X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-EGFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#6658</td>
			<td>third chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Dicer2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#24650</td>
			<td>second chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Dicer2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#24651</td>
			<td>third chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vkg-GFP</td>
			<td>Morin et al. 2001</td>
			<td></td>
			<td>GFP protein trap</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia

Kanserin erken evrelerinde, dönüştürülmüş mutant hücreler sitolojik anormallik gösterir, kontrolsüz aşırı büyümeye başlar ve doku organizasyonunu giderek bozmaktadır. Drosophila melanogaster , tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için kanser biyolojisinde popüler bir deneysel model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, Drosophila imaginal diskler için genetik araçlar (larvalarda gelişen epitel), insan kanserinin başlangıç ​​evrelerine benzer bir durum olan normal bir epitel dokusunda dönüştürülmüş pro-tümör hücrelerinin oluşturulmasını sağlar. Bununla birlikte, Drosophila kanat imaginal disklerinde yapılan tümörigenez üzerine yakın tarihli bir çalışmada, tümör başlangıcının doku intrensek sitolojik mimarisine ve yerel mikro çevreye bağlı olduğunu göstermiştir; bu, imaginal olarak tümör fenotiplerini değerlendirmede tümöre özgü uyarılara bölgeye spesifik duyarlılığın göz önüne alınmasının önemli olduğunu düşündürmektedir diskler. Tümör gelişiminin fenotipik analizini kolaylaştırmakİmaj disklerinde, burada, kanat imgesel disklerinde neoplastik tümörleri indüklemek için GAL4-UAS sistemini kullanan genetik deneyler için bir protokolü açıklıyoruz. Daha önce tarif edilmemiş olan, tümör progresyonunun çeşitli aşamalarını (hiperplazi, displazi veya neoplazi gibi) ayırt etmek için net bir sınıflandırma yöntemi olduğu için, imaginal epitelde indüklenen klonal lezyonların fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi daha sunuyoruz. Bu yöntemler, Drosophila&#39;daki çeşitli organlarda tümör fenotiplerinin klonal analizi için geniş çapta uygulanabilir.

Drosophila kanat imaginal disklerinde RNAi aracılı nTSG-knockdown ile deneysel olarak indüklenen neoplastik tümör oluşumunu göstermek için lgl veya scrib için UAS-RNAi ifade etmek için üç farklı GAL4 sürücüsü kullanılmıştır: (1) sd-GAL4, güçlü UAS ekspresyonunu Kanat çantası ve menteşe bölgelerinde hafif ifade ( Şekil 2 ve Şekil 3A ); (2) dorsal ...

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia at JoVE.com

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Drosophila imaginal disk epitelyumunda mozaik klon analizi, tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir model sistemidir. Burada, GAL4-UAS sistemini kullanarak Drosophila kanat imaginal disklerinde tümörleri indüklemek için bir protokolü tarif eder ve tümör fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi sunmaktayız.

Tümörlerin İndüksiyon ve Teşhisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disk Epiteli

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

14.8K Görüntüleme.  SOKENDAI.  Drosophila imaginal disk epitelyumunda mozaik klon analizi, tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir model sistemidir. Burada, GAL4-UAS sistemini kullanarak Drosophila kanat imaginal disklerinde tümörleri indüklemek için bir protokolü tarif eder ve tümör fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi sunmaktayız. 

Video: Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Kanser Araştırmaları

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

Hasta elde edilen yumuşak doku sarkomu birincil kültürünün kurulması

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for immunotherapies. Recent clinical advances in immunotherapy highlight the need for reproducible methods to accurately and thoroughly characterize the tumor and its associated immune infiltrate. Tumor enzymatic digestion and flow cytometric analysis allow broad characterization of numerous immune cell subsets and phenotypes; however, depth of analysis is often limited by fluorophore restrictions on panel design and the need to acquire large tumor samples to observe rare immune populations of interest. Thus, we have developed an effective and high throughput method for separating and enriching the tumor immune infiltrate from the non-immune tumor components. The described tumor digestion and centrifugal density-based separation technique allows separate characterization of tumor and tumor immune infiltrate fractions and preserves cellular viability, and thus, provides a broad characterization of the tumor immunologic state. This method was used to characterize the extensive spatial immune heterogeneity in solid tumors, which further demonstrates the need for consistent whole tumor immunologic profiling techniques. Overall, this method provides an effective and adaptable technique for the immunologic characterization of subcutaneous solid murine tumors; as such, this tool can be used to better characterize the tumoral immunologic features and in the preclinical evaluation of novel immunotherapeutic strategies.

Here we describe a method to separate and enrich components of the tumor immune and non-immune microenvironment in established subcutaneous tumors. This technique allows for the separate analysis of tumor immune infiltrate and non-immune tumor fractions which can permit comprehensive characterization of the tumor immune microenvironment.

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

İskemi Reperfüzyon Hasarı Ayarında Metastatik Karaciğer Tümörlerinin Murine Modeli

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Meme Kanseri için Preklinik Modeller Olarak Meme Tümörlerinin Ortopedik Transplantasyonu

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties make it an excellent in vivo experimental model to study angiogenesis, tumor growth, drug delivery systems, or photodynamic diagnosis (PDD) and photodynamic therapy (PDT). At the same time, this model addresses the requirement for the replacement of experimental animals with a suitable alternative. Ex ovo cultivated embryo allows easy substance application, access, monitoring, and documentation. The most frequently used is chick CAM; however, this article describes the advantages of the Japanese quail CAM as a low-cost and high-throughput model. Another advantage is the shorter embryonic development, which allows higher experimental turnover. The suitability of quail CAM for PDD and PDT of cancer and microbial infections is explored here. As an example, the use of the photosensitizer hypericin in combination with lipoproteins or nanoparticles as a delivery system is described. The damage score from images in white light and changes in fluorescence intensity of the CAM tissue under violet light (405 nm) was determined, together with analysis of histological sections. The quail CAM clearly showed the effect of PDT on the vasculature and tissue. Moreover, changes like capillary hemorrhage, thrombosis, lysis of small vessels, and bleeding of larger vessels could be observed. Japanese quail CAM is a promising in vivo model for photodynamic diagnosis and therapy research, with applications in studies of tumor angiogenesis, as well as antivascular and antimicrobial therapy.

The chorioallantoic membrane (CAM) of the avian embryo is a very useful and applicable tool for various areas of research. A special ex ovo model of Japanese quail CAM is suitable for photodynamic treatment investigation.

Bıldırcın Korioallantoik Membran - Fotodinamik Tanı ve Tedavi için Bir Araç

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes significantly. Genetically engineered murine models that mimic ATC&#39;s progression may help researchers to study treatments for this disease. Crossing three different genotypes of mice, a TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53&#916;ex2-10/&#916;ex2-10&#160;transgenic ATC model was developed. The ATC murine model was induced by an intraperitoneal injection of tamoxifen with overexpression of BrafV600E and deletion of Trp53, and the tumors were generated within about 1 month. High-resolution ultrasound was applied to investigate the tumor initiation and progression, and the dynamic growth curve was obtained by measuring the tumor sizes. Compared to magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography scanning, ultrasound has advantages in observing the ATC murine model, such as being noninvasive, portable, in real-time, and without radiation exposure. High-resolution ultrasound is suitable for dynamic and multiple measurements. However, ultrasonographic examination of the thyroid in mice requires relevant anatomical knowledge and experience. This article provides a detailed procedure for utilizing high-resolution ultrasound to scan tumors in the transgenic ATC model. Meanwhile, ultrasonic parameter adjustment, ultrasound scanning skills, anesthesia and recovery of the animals, and other elements that need attention during the process are listed.

The present protocol describes high-frequency ultrasonography for visualizing the entire mouse thyroid gland and monitoring the growth of anaplastic thyroid carcinoma.

Genetiği Değiştirilmiş Bir Fare Modelinde Ortotopik ATC Tümörlerinin Analizi için Yüksek Çözünürlüklü Ultrasonografi

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...