פרויקט זה היה תמיכה חלקית על ידי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, משרד פרווסט דרך שער מתווה.

הערה: ה-DNA Metagenomic מטוהר מן האדמה (במחוז בולטימור, מרילנד) באמצעות בידוד גנומית של קרקע זמינים מסחרית קיט (ראה טבלה של חומרים). שימוש ספקטרופוטומטרים UV (ראה טבלה של חומרים), ה-DNA גנומי מטוהרים צריך להיות יחס (ננומטר) 260/280 &#62; 1.8 ו- 260/230 יחס בין 2.0-2.2 להבטיח כי המדגם הינו ללא מזהמים. כמות ה-DNA גנומי הדרושות NS נע בין 200 ng כדי 2 µg.
1. שיטת הכנה מהירה ספריה (פרוטוקול קצר)
הערה: הוא זה פרוטוקול קצר. ראה טבלה של חומרים עבור ערכת רצף מהיר.
<ol>
	<li>ב- mL 0.2 צינור דק עם קירות (ראה טבלה של חומרים) להוסיף 200 ng של משקל מולקולרי גבוה ה-DNA הגמר נפח של 7.5 µL של מים מזוקקים.</li>
	<li>להוסיף 2.5 µL של פיצול מיקס (FM) ערכת הכנה מהירה לספריה, לערבב בעדינות על-ידי היפוך. הדופק צנטריפוגה ספין למטה (1,000 x g עבור 5 s).</li>
	<li>הכנס את הדגימה thermocycler (ראה טבלה של חומרים) עבור סיבוב אחד ב 30 ° C עבור 1 דקות ולאחריה 75 ° C עבור מינימלית 1 להסיר לצנטריפוגה צינור ודופק על תוצאה לדגימה.</li>
	<li>הוסף µL 1 של מתאם מהירה ו- 0.2 µL של בלאנט/ת א ליגאז מיקס מאסטר ולאחר מכן לאחסן בספריה מותאמת, קשור בקרח. הערה: אם באמצעות פרוטוקול קצר והמשך לשלב 8</li>
</ol>
2. מצדו רצף פרוטוקול (פרוטוקול ארוך): Metagenomic DNA פיצול
הערה: ראה טבלה של חומרים עבור ערכת רצף מצדו.
<ol>
	<li>למהול 1 µg של דנ א גנומי מטוהרים נפח סופי של 46 µL במים יונים.</li>
	<li>העברת הדגימה כדי פיצול ה-DNA צינור (ראה טבלה של חומרים), צנטריפוגה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר ב 8000 g x באמצעות microcentrifuge (ראה טבלה של חומרים) כדי לייצר שברי גנומית ~ 8 kb. ודא כי כל הנוזל עבר לתוך הצינור אוסף.</li>
	<li>היפוך הצינור פיצול, לחזור צנטריפוגה ולאחר צנטריפוגה עבור 1 דקות לאסוף את הדנ א הגנומי מפוצלים אל החדר התחתון.</li>
	<li>להעביר את ה-DNA גנומי מפוצלים צינור 1.5 מ ל איגוד נמוך-DNA סטרילי, ולנתח חלק על ג'ל agarose אחוזים נמוכים (0.6%) כדי לאשר פיצול כדי &#62; 30 kb.</li>
</ol>
3. מפוצלים הדנ א סוף-אופן ההכנה
<ol>
	<li>באמצעות 800 ng של דנ א גנומי מפוצלים ב 45 µL של מים יונים, להוסיף תגובה סוף-פרפ ' µL 7 ' מאגר (ראה טבלה של חומרים), 3 µL אנזימים מיקס (ראה טבלה של חומרים), ו- 5 µL של נוקלאז ללא מים.</li>
	<li>מיקס על ידי צנטריפוגה היפוך ודופק (1,000 x g עבור 5 s).</li>
	<li>להעביר מדגם צינור דק עם קירות 0.2 מ"ל, דגירה דוגמת עבור 5 דקות ב- 20 ° C, ואחריו דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה הדופק להביא תוכן לתחתית הצינור.</li>
	<li>העברה מדגם צינור 1.5 מ ל נמוכה-DNA איגוד microcentrifuge.</li>
	<li>להכין beads מגנטי (ראה טבלה של חומרים). להוסיף 60 µL של חרוזים resuspended התגובה הכנה סוף שלב 3.5, לערבב על-ידי pipetting.</li>
	<li>דגירה על מערבל מסובב ב 100 סל"ד (ראה טבלה של חומרים) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דופק centrifuge המדגם הצניפה החרוזים, ולאחר מכן למקם את הדגימה ליד מגנט.</li>
	<li>פיפטה ברגע החרוזים הם דבקו המגנט, תגובת שיקוע, להשליך.</li>
	<li>הסר הצינור החרוזים מגנט ושטוף עם 200 µL של אתנול 70% שזה עתה הוכנו על ידי בעדינות pipetting שיהיה המדגם.</li>
	<li>צנטריפוגה הדופק הצניפה החרוזים ולחזור המגנט.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע וזורקים. חזור על השלב כביסה שוב באמצעות µL 200 של 70% אתנול.</li>
	<li>דופק centrifuge ברכבת התחתית, לחזור המגנט ולהסיר כל בכביסה אתנול 70%.</li>
	<li>עם המכסה צינור microcentrifuge פתוחה, לאפשר את החרוזים מהאוויר להתייבש במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הצינורית של מגנט, להשעות את צניפה ב µL 31 סטרילי, נטולת נוקלאז מים. תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להחזיר את הצינור המגנט עד כל החרוזים יש מגורען, eluate ברור.</li>
	<li>להעביר את eluate צינור microcentrifuge 1.5 mL. שימוש µL 1 מדגם, לכמת את הדנ א. נכין קצה באמצעות ספקטרופוטומטרים UV ב-260 nm (ראה טבלה של חומרים). הערה: אחוז ההחלמה צריך להיות ~ 70% (700 ng) של ריכוז ההתחלתי של µg 1 של הדנ א.</li>
</ol>
4. מתאם, בנוסף הקשר שברי DNA גנומי מוכנה סוף
<ol>
	<li>לערבב את כל ליגאז בלאנט/ת צינורות מיקס מאסטר על ידי היפוך ולאחר מכן דופק צנטריפוגה כדי להביא תוכן התחתון.</li>
	<li>באמצעות 30 µL של DNA מוכנה סוף, להוסיף 20 µL של מתאם שילוב, µL 50 של בלאנט/ת א מצדו מיקס מאסטר.</li>
	<li>לערבב על-ידי היפוך, הדופק צנטריפוגה, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>
5. מגנטי Bלראש הכנה
<ol>
	<li>מערבולת החרוזים, ואז העברת µL 50 של חרוזים על תנאי כדי microfuge 1.5 mL צינור.</li>
	<li>מניחים את הצינורית על המגנט על גלולה החרוזים עד eluate.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע וזורקים.</li>
	<li>להוסיף 100 µL חרוז איגוד מאגר (ראה טבלה של חומרים עבור ערכת חרוז) החרוזים, מערבולת כדי resuspend את החרוזים, גלולה החרוזים על המגנט, להסיר את תגובת שיקוע ולמחוק. חזור על השטיפה עם 100 µL מחייב המאגר.</li>
	<li>להוסיף 100 µL חרוז איגוד המאגר החרוזים שטף. מערבולת כדי resuspend את החרוזים.</li>
</ol>
6. ספריית טיהור
<ol>
	<li>שימוש micropipette P200, להוסיף µL 40 של חרוזים מהשלב הקודם גנומית הותאם/קשור לדנ א. מערבבים את הדגימה בקפידה על-ידי pipetting.</li>
	<li>דגירה המדגם על מערבל מסובב ב 100 סל"ד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שים המדגם על המגנט ולאפשר את החרוזים להתיישב. פיפטה הנחה תגובת שיקוע וזורקים.</li>
	<li>Resuspend את החרוזים ב 140 µL חרוז איגוד מאגר על-ידי pipetting. מקם את הדגימות המגנט, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר לשטוף שוב עם עוד 140 µL חרוז איגוד מאגר.</li>
	<li>דופק centrifuge ברכבת התחתית, במקום את הצינורית על המגנט עבור 2 דק. להסיר את המאגר איגוד חרוז נותרת בגדר.</li>
</ol>
7. • תנאי של ספריה של חרוזי מגנט
<ol>
	<li>Resuspend את החרוזים מגנטי ב 15 µL • תנאי מאגר על-ידי pipetting. דגירה המדגם 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מקום ברכבת התחתית נגד המגנט הצניפה החרוזים.</li></ol>כאשר הפתרון מנקה, להסיר את µL 15 eluate, העברת צינור microfuge 1.5 mL, ולמקם את הדגימה על קרח.
	<li>לכמת הספרייה באמצעות ספקטרופוטומטרים UV. הערה: אחוז ההחלמה צריך להיות ~ 25% (250 ng) של ריכוז ההתחלתי של µg 1 של הדנ א.</li>

8. החל פקד בניהול/איכות
<ol>
	<li>להסיר את התא זרימה אריזה ולצרף את התא זרימה הרצפים נייד, בזמן אמת (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לצרף את הרצפים (sequencer) למחשב באמצעות כבל USB ולהתחיל את התוכנה רצף (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לחץ על "התחבר" התקן דרך התוכנה רצף, בחר "NC_Platform_QC.py" ולאחר לחץ על "התחל".</li>
	<li>בקרת איכות (QC) אורכת כ 6-7 דקות כדי להשלים; חפשו 'ים של ירוק' (שטחים גדולים של פלט) על הנתונים QC כדי לאשר כי ישנם מספיק נקבוביות פעילה (&#62; 800) עבור רצפי DNA.</li>
</ol>
9. מתחיל רצף ריצה
<ol>
	<li>פתח את התוכנית רצף; תיבת דו-שיח תופיע. בתיבה מזהה לדוגמה, שם את הדגימה.</li>
	<li>לחץ על התיבה "זרימה Cell ID" והזן את הקוד נמצא על-גבי המדבקה על גג התא זרימה.</li>
	<li>פותחים את המכסה תא זרימה והחלק ואז את המכסה מדגם ימינה (בכיוון השעון) כך שגלוי הנמל הדגימה. ברגע היציאה פתוח, בדוק בועה קטנה. הסר microliters כמה המאגר כולל את הבועה.</li>
	<li>בדוק כדי לוודא כי יש מאגר על פני מערך חיישן. להפוך את המאגר לקרקע על ידי ערבוב 480 µL של הפעלת מאגר עם תערובת דלק (RBF-1, ראה את הטבלה של חומרים) (יש להקפיד לערבב ביסודיות הראשון) עם מים ללא נוקלאז µL 520.</li>
	<li>להוסיף µL 800 המאגר לקרקע הנמל לקרקע. בזהירות הרימו את המכסה "" כדי להפוך אותו לנגיש.</li>
	<li>לאחר 5 דקות, להוסיף µL 200 נוספים של מאגר לקרקע הנמל לקרקע.</li>
</ol>
10. טעינת הספריה
<ol>
	<li>לפני הכנת המקום בספריה של ריאגנטים הבאים על הקרח: RBF-1 (מתוך ערכת רצף), הותאם ו קשורה ספריה, ספריה טעינת חרוזים (LLB; הערכה רצף).</li>
	<li>כדי שפופרת צנטרפוגה 0.2 מ"ל, להוסיף µL 25.5 של RBF ו 12 µL של מים נטולי נוקלאז לשמור בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מערבבים את תואר ראשון במשפטים מאת pipetting שיהיה. להוסיף µL 26.5 של LLB הצינור 0.2 µL. מערבבים את ריאגנטים מאת pipetting שיהיה. הערה: LLB נוטה הסדר מחוץ התערובת.</li>
	<li>להוסיף µL 11 של הספריה מותאם, קשור הצינור 0.2 µL. לערבב על-ידי היפוך ו ספין על ידי צנטריפוגה דופק.</li>
	<li>הוסף µL 75 מדגם מהשלב 9.4 ליציאת ה-"" dropwise. ודא כי כל טיפה זורם לתוך הנמל לפני הוספת הבא.</li>
	<li>בזהירות להחליף את הדגימה המכסה כך bung מזין את היציאה, ולהחליף את המכסה התקן.</li>
</ol>
11. הפעלת קובץ Script פרוטוקול תוכנה רצף
<ol>
	<li>פתח את התפריט הנפתח תחת "בחר תוכנית" ובחר "רצף של 48 שעות."</li>
	<li>לחץ על "לבצע" כפתור כדי להפעיל את קובץ ה-script.</li>
	<li>בדקו את התוצאות של Mux לסרוק דיווח בזרם ההודעות עבור מספר הנקבוביות פעיל ב MUX לסרוק. הערה: מספר זה עשוי להיות שונה מספר הנקבוביות ב- QC לרוץ, הבדל גדול עשוי להצביע על בעיה.<ol>
		<li>אם יש ירידה משמעותית של הנקבוביות פעיל רץ QC, להפעיל מחדש את התוכנה, אם עדיין יש הבדל משמעותי, לאתחל מחדש את המחשב.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בדוק טמפרטורת הקירור היא 34 מעלות צלזיוס כפי שדווח על ידי סקריפט תוכנה רצף. הערה: אם הטמפרטורה היא לא ב 34 ° C ואז לא יהיו מספיק נקבוביות פעיל לריצה.</li>
	<li>בדוק ההיסטוגרמה באורכים קריאה כדי לקבוע אם המרחק רצף הצפוי ומתאימה הנבחנים.</li>
	<li>סגור את הסוכן בשולחן העבודה באמצעות 'סגור x.' להפסיק תוכנת עריכה ברצף על ידי סוגר את אינטרנט GUI. לנתק את המכשיר מהמחשב.</li>
</ol>
12. ניתוח של ריצה ותוצאות
הערה: במהלך רצף ההפעלה, הנתונים ניתן לנטר שימוש בתוכנית "תצוגה ח באמצעות הסוכן של שולחן העבודה. במהלך או לאחר ההפעלה הושלמה, קבצים זמינים ב FAST5 קובץ בפורמט ה ← נתונים קורא ← להעביר תיקיה (ברירת המחדל). אם תיקיה זו פתוחה כאשר רצף פעילה, המחשב עשוי להקפיא.
<ol>
	<li>כדי להציג ולטפל רצפים, להוריד "HDFViewer".</li>
	<li>כדי להציג את הקבצים רצף, ישירות פתוח HDF הצופה ← פתוח נתונים בתיקיה ← בחר שכל הקבצים סוגי ← בחר c: כונן (ברירת מחדל) ← בבחירת נתונים ← בחר קריאות ← בחר לעבור.</li>
	<li>בחר את הקובץ FASTQ בתפריט הנפתח השמאלי; קבצים יפתח, ניתן לשמור בפורמט FASTQ. הערה: לצורך הניסוי התלמיד, רצפים של נוקלאוטידים 350 או יותר נבחרו לצורך ניתוח נוסף. פלט הטלפונים הבסיס מאפשר למשתמש למיין רצף פעולות הקריאה בהתאם לגודל. FASTQ קבצים ניתן לנתח באמצעות פיצוץ (NCBI) או תוכניות אחרות ביואינפורמטיקה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomics+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99 (2015).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella.">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114 (2015).</li><li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island.">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li><li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data.">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization.">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).</li><li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li><li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore.">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li><li>Shendure, J., Hanlee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+DNA+sequencing.">Next generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Metagenomics+of+Soil.">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li></ol>

המחברים יש אין גילויים.

שיטות רצף הדור הבא רבות נוצרו כל אחד תלוי רצף על ידי סינתזה אבל הפלטפורמות זיהוי לזיהוי נוקלאוטידים שונים. NS, התוספת האחרונה לשוק, משתמש בשיטה שונה לחלוטין, אשר אינה דורשת תגובה רצף או תווית נוקלאוטידים. שיטה זו מנצלת תשלום דיפרנציאלי של נוקלאוטידים כבר incorporated כפי שהם עוברים הנקבובית מחושמלת. הזיהוי של כל נוקלאוטיד מתרחשת על ידי אפנון של הזרם החשמלי על ידי היסודות השונים כפי שהם עוברים nanopore. מערכת מרובבת זו מאפשר למשתמש רצף קטעים רבים בכל פעם. על ידי קביעת רצף שני גדילי ה-dna, גדל באופן משמעותי הדיוק של הרצף, התוכנה רצף, אשר ניתן לטעון על גבי מחשב נייד, מעבד את האותות, מספק את המידע רצף מסוגל לנתח.
ב- pyrosequencing, רצף לפי שיטת סינתזה (SBS), זיהוי של בסיס ספציפי שולבו התבנית תלוי וזמינותו לוציפראז הדור של אותות chemiluminescent8. ב רצף מוליכים למחצה יון, יון מימן שפורסמו, אשר מפחית את רמת החומציות מזוהה על ידי חיישן יון9. מולקולה בודדת רצף בזמן אמת תלויה אפס במצב גל מדריך (ZMW)10, אשר מאירה לגילוי מולקולה נמכרות מתויג נוקלאוטיד incorporated. SBS משתמש בשיטה ייחודית כדי להגביר את המטרה DNA כך אשכולות הרצפים הייחודיים הם שנוצר13. זיהוי של נוקלאוטיד הוסיף מושגת כאשר זריחה של נוקלאוטיד מתויג נרשם. NS מאידך גיסא יש יתרון ייחודי על פני שיטות אחרות בכך שזה דורש משאבים טכניים מוגבל, נייד, מייצרת קריאות רצף ארוך, דורש אין הגברה DNA מוקדמת, יכול להיות מופעל עם עלות מופחתת בהשוואה לשיטות אחרות. התלמידים שלנו למצוא פרוטוקול הכנה ספריה חדשה, מהירה פשוטה, נוטה שיעור מעבדה 3 שעות. בחלק מן הנושאים נתקלנו היו בועות בתא זרימה אשר היו קשה להסיר, זה נדרש כוח משמעותי המחשב (טראבייט אחד של אחסון), הפלט הנוכחי של הנתונים בקובץ FAST5, רצף זרימה התא יש חיי מדף מוגבלים לפני זה מתדרדר. בנוסף, חסרונות אחרים של פרוטוקול רצף מצדו NS (פרוטוקול ארוך) הוא כי זה דורש מספר צעדים הכנה ספריה, דורש התמחות בטכניקות ביולוגיה מולקולרית, יוצר נאמנות רצף מופחתת בהשוואה לחלק רצף מתודולוגיות3. אולם, ההתקדמות האחרונה עם ערכת הכנה מהירה ספריה חדשה דורשת רק 10 דקות הכנה ספריה, הוכיח שיעור שגיאה רצף מופחת. השיטה החדשה של הכנת ספריה לא התקשה מאוד לשימוש בכיתה במעבדה.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, בפרט QC של התא זרימה. זה כולל ביצוע של QC הראשונית תוך חמישה ימים של קבלת של התא זרימה ושימוש בהם בתוך 8 שבועות. למרות השתמשנו תאים זרימה שהיו מעבר 8 שבועות, הקטינה באופן משמעותי מספר הנקבוביות פתוח/פעיל. חשוב כי ניסויים מתוכננים כדי להתאים ציר זמן שבו שימוש מרבי של תאי זרימה מושגת. יש להשתמש בפרוטוקול ניקוי ואנו תאי זרימה עם הצלחה לעשות בה שימוש חוזר.
חוקרים את metagenomics של אדמת מייצגים מאגר גנטי עצום של גיוון מיקרוביאלי. כך למשל, גרם אחד של אדמת מוערך מכילים בין 107 -9 10 תאים prokaryotic14. יתר על כן, אדמת אורגניזמים הם המקור העיקרי של מוצרים טבעיים חדשניים, אנזימים אנטיביוטיקה. לפיכך, ניתוח רצף הדנ א metagenomics אדמה מייצגת כלי הדרכה חשוב לסטודנטים בכל רמה של חינוך. של הטכנולוגיה NS להקל של שימוש ולהפוך בעלות נמוכה זו מערכת כלי הוראה יעילה מאוד. סטודנטים יכולים רצף דגימות סביבתי ולאחר עם סיומו של הרצף להשתמש בכלים לביואינפורמטיקה זמין כדי לזהות ולאפיין רצפי חיידקים, metagenomics הבדיקה דוגמאות. באמצעות הטכנולוגיה NS, סטודנטים יש התנסות אמיתית, יש עד עכשיו היה מתוך להגיע לשימוש בקורסים מעבדה בשל מומחיות טכנית מתקדמת עלויות גבוהות ריאגנט, ציוד ותחזוקה של פלטפורמות אחרות רצף. לאחרונה, אחד הסטודנטים שלנו (הריסון ג', תקשורת אישית) דיווחו על השימוש בטכנולוגיה זו בפרוייקט ניטור סביבתי של החווה קרקעות. אנו מצפים כי יהיו הרבה יותר יישומים לטכנולוגיה הזו במרחב החינוך.

המטרה של הליך זה הוא להדגים את השלבים הדרושים עבור הכנה של ספריית ה-DNA סביבתיים רצף, ניצול של nanopore זרימה תא רצף התקן, וכדי לבצע אנליזה של רצפי דנ א שנוצר באמצעות מערכת תוכנה, המרכז הלאומי לביוטכנולוגיה מידע (NCBI) ושפור לזהות מינים מיקרוביאלית בקרקע. כיום, רוב פלטפורמות רצפי DNA דורשות השקעה גדולה ב מכשור מורכב, שאינו ריאלי בסביבות המסכן משאבים או ביישומים שדה והדרכה טכנית. פלטפורמת רצף (NS) nanopore מבטלת נושאים אלה עם העלות האפקטיבית, פשוט להשתמש ספריית הכנת פרוטוקול, ואת מכשיר נייד רצף ולנתח מגוון רחב של סוגים שונים של חומצות גרעין1,3. לנו יש שולבו פלטפורמת NS בכמה כיתות המעבדה לתלמידי תואר שני.
Nanopore טכנולוגיה עבור רצפי מולקולות הוכיחה יישומים רחב במדעי החיים, כולל זיהוי של פתוגנים בקטריאליים וויראליים1,2,6, המגוון הביולוגי סביבתיים מחקרים, ניטור בטיחות מזון, אנליזה גנומית3,5, ואפיון של חיידקים עמידות לאנטיביוטיקה4. NS היא שיטה מהירה ומדויקת על רצף חומצות גרעין המבוסס על העיקרון של "לנטישה רצף" על ידי גילוי הפרעות חשמל על ידי בסיסים נוקלאוטיד בודד כאשר יחיד DNA נטוש עוברת דרך nanopore מוכנס לתוך חשמלית ממברנות פולימר סינתטי. השלבים הכרוכים בהכנת DNA NS כוללות פיצול הגנום, ותיקון קצה 3' דה-עוקב של שברי גנומית, מתאם, הקשר חישול ל- DNA, טיהור ספריית DNA ולאחר טעינת הספריה לתוך המכשיר הסלולרי זרימה nanopore. פיצול של הגנום ~ 8 kb מידות מושגת על ידי צריך שתוציאו µg 1-2 של ה-DNA גנומי דרך צינור פיצול גרם-צינור. הקצוות המפוצלים גנומית מכן תוקן, זנב עם dA פוליפוני באמצעות ערכת זמינים מסחרית. רצפים במתאם יחיד נטושים, אשר תואמים עם החלבון מנוע nanopore, מתווספים לקצוות דנ א אשר משמשים כדי להנחות את רצף ה-DNA דרך nanopore (איור 1). רצפי הקשר נדרשים עבור טיהור DNA, לוקליזציה מולקולות DNA קרום הנקבובית. הסיכה נוצר על ידי נבדק מתאם סיכת ראש בקצה אחד של הספרייה זנב dA. המבנים מכבנה בקצוות ה-DNA מאפשר קריאה הגדילים antisense על תבונה כמו ה-DNA עובר nanopore (איור 2). בספרייה גנומית מוכן ואז מטוהרים מן התגובה באמצעות חרוזים streptavidin באמצעות שדה מגנטי, ואחריה טעינה הדגימה לתוך התא זרימת nanopore לניתוח.
ברצף הדנ א שקובעת איכות, קריאות רצף המקובלות לניתוח. ואז נתונים מספר כלים ביואינפורמטיקה לזהות חיידקים. הרצף "מתורגמים" לתוך FASTQ של תבנית FAST5. בפורמט FASTQ, רצפי ואז ניתן להשתמש בניתוח הפיצוץ.

<table><tbody><tr><td>Thermal Cycler</td><td>LifeECO</td><td>BTC42096</td><td></td></tr><tr><td>Covaris g-TUBE</td><td>Covaris</td><td>520079</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext End Repair Module</td><td>New England BioLab</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>MyOne C1 Strepavidin Beads</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Model 5420</td></tr><tr><td>Nanodrop UV spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Model 2000</td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z768499</td><td></td></tr><tr><td>Power Soil DNA Isolation Kit</td><td>MO BIO</td><td>12888-50</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Sequencing Kit 2D</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-LSK208</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td></td></tr><tr><td>End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>AmPure XP Magnetic Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Basic Starter Pack&amp;nbsp;</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td>Includes MinION&amp;nbsp; Sequencing Device and Flow Cell</td></tr><tr><td>MinKNOW software</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td>Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)</td></tr></tbody></table>

nanopore dna sequencing for metagenomic soil analysis

מאמר זה מתאר את השלבים להקמת ספרייה דנ א אדמה, הכנה, השימוש התא זרימה nanopore, וניתוח של רצפי דנ א מזוהה באמצעות תוכנת מחשב. רצפי Nanopore DNA היא טכניקה גמיש המאפשר רצף הגנום מיקרוביאלי מהירה לזהות מינים בקטריאליים וויראליים, כדי לאפיין את זני חיידקים, וכדי לזהות מוטציות גנטיות המקנים עמידות לאנטיביוטיקה. היתרונות של nanopore רצף (NS) עבור מדעי החיים כוללים שלו מורכבות נמוכה, עלות מופחתת, ורצף מהיר בזמן אמת של דנ א גנומי מטוהרים, PCR amplicons, דגימות cDNA או RNA. NS הוא דוגמה "רצף strand" הכוללת רצף ה-DNA על ידי המנחה מולקולה בודדת DNA נטושים דרך nanopore זה מוכנס לתוך קרום פולימר סינתטי. הקרום יש זרם חשמלי להחילה אז בסיסי בודדות עוברים דרך nanopore הזרם החשמלי מופרת בדרגות על ידי היסודות נוקלאוטיד ארבע. הזיהוי של כל נוקלאוטיד מתרחשת על ידי גילוי של אפנון האופיינית של הזרם החשמלי על ידי היסודות השונים כפי שהם עוברים nanopore. מערכת NS מורכב כף יד, USB מופעל התקן נייד, תא זרימה חד פעמיות המכיל מגוון nanopore. המכשיר הנייד מחובר מחשב נייד סטנדרטי קורא ומתעדת את רצף ה-DNA באמצעות תוכנת מחשב.

הטכנולוגיה nanopore ועיצוב ניסיוני מספק שיטה מהירה וזולה עבור תלמידים על רצף אדמה דנ א. הפעל נציג עבר את הפרמטרים בקרת איכות עם יותר מ-800 נקבוביות זמין עבור רצף. הפעל כתוצאה מ 125,000 קריאות זמינה למחקר באורך רצף החציוני של 5.38 kb. רצפים מקבלים ניקוד האיכות, רק אלה רצפים עם ציונים מקובל מכן נותחו. כמו הפלט של הרצף התגובה הוא בתבנית FAST5, שאינה מקובלת על-ידי תוכניות כגון הפיצוץ (NCBI), רצפי נתפסו במציג HDF אשר ממירה את רצפי לתבנית FASTQ, אשר תואם לניתוח הפיצוץ. בעתיד חזרות של התוכנה, הנתונים יהיה זמין כתבנית FASTQ, ומבטלת את הצורך עבור הצופה HDF. לראות משלים המספרים 1, 2 ו- 3-
חמישים רצף נוקלאוטידים מעל 350 אורך נידונו ניתוח לפי BLASTN (נוקלאוטידים נגד נוקלאוטיד מסד הנתונים) או BLASTX (מתורגם חומצת אמינו לרצף נוקלאוטידים) (NCBI) כדי לזהות אורגניזמים במדגם קרקע. בהתחשב בתקופה אילוצים של המחלקה, כי המוקד של הקורס הוא על שיטות מעבדה, לא ביואינפורמטיקה, יש לנו את התלמידים לנתח את רצפי בתוך הפרמטרים האלה. מחלקות ביואינפורמטיקה שלנו יכול להשתמש בנתונים לפיתוח של כלי ניתוח צינור. רמה זו של ביואינפורמטיקה ניתוח אינו מכוסה בכיתה מבוסס מעבדה. טבלה 1 היא רשימה של האורגניזמים שזוהו עם הערכים e של פחות מ-4 e-04. באופן כללי, ערכי e-פחות מ- 4 e-04 מצביעים על דמיון חזק בין הרצף בהתאמה לרצף הקלט (שאילתת). האורגניזמים המזוהה על-ידי BLASTN (נגד מסד הנתונים לא יתיר (ע נ)) מתוך מגוון רחב של מינים, זמינים גנומית נוסף וניתוחים חלבון. דוגמה זו של האדמה, אשר באו גן במחוז בולטימור, MD היה מעולם לא נוסה, כך היו נתונים קודמים כדי לקבוע מה יהיה האורגניזמים בקרקע. BLASTN ניתוח (נגד מסד הנתונים nr) ניתוח גם ציין היו רצפי עם אין התאמה במסד הנתונים של נאט ו. כדי לקבוע אם אלו באמת הרומן רצפים, נדרש מחקר נוסף. ניתוח של מספר רצפי מאת BLASTX גילה חלבונים שונים של אורגניזמים אינו מיוצג בניתוח BLASTN. בטבלה 2 פירוט מספר חלבונים אפשרי כולל endopeptidases ו- ATPases כמו חלבונים. שימוש בספריה זו של רצפים, תלמידים יש ההזדמנות להשתמש בכלים לביואינפורמטיקה מתוחכמים יותר לבצע ניתוח נוסף, אם בבימויו של המדריך.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
איור 1 : הכנה ספרייה גנומית. פעולות עבור הכנה של ספריית דנ א גנומי רצף באמצעות טכנולוגיית nanopore. איור זה השתנה עם ההרשאות הדרושות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
איור 2 . סכמטי של רצפי DNA באמצעות nanopore. DNA עובר דרך קרום nanopore בזיהוי הדור ובסיס האות החשמלי. איור זה השתנה עם ההרשאות הדרושות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>אורגניזם</td>
			<td>ערך e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomyces sp.</td>
			<td>3.00E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>גורדוניה sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium nitrativorens</td>
			<td>1.00E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>נובלה Starkeya</td>
			<td>1.00E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium denitrificans</td>
			<td>1.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp.</td>
			<td>5.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מרינוס Rhodothemus</td>
			<td>1.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella parva</td>
			<td>2.00E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>0.00E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sp מקבעי חנקן ופטריות.</td>
			<td>3.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomonas sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp.</td>
			<td>6.00E-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: נבחר את התוצאות של ניתוח BLASTN. אדמה רצפי DNA metagenomics נתון BLASTN דמיון חיפוש במסד הנתונים של נוקלאוטיד יתירים NCBI. המידע המדווח להיות e-ערכי של 4x e-4 או פחות.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>חלבון</td>
			<td>אורגניזם</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>חלבון היפותטי</td>
			<td>חיידק Acidobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyltransferase תלויים סאם</td>
			<td>ה denitrificans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPase</td>
			<td>Jannaschia sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endopeptidase</td>
			<td>שיגלה sonnei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פירוק חלבונים</td>
			<td>E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
בטבלה 2: נבחר את התוצאות של ניתוח BLASTX. אדמה רצפי DNA metagenomics נתון BLASTX חיפוש דמיון נגד המאגר חלבון לא יתיר NCBI.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
משלימה איור 1: התוצאה היא פלטפורמה QC. התוצאות של פלטפורמת QC מוצגים. בפינה הימנית העליונה הן התוצאות של QC של הנקבוביות פעיל. כל רביע של התא זרימה נבחנה על הנקבוביות פעיל. הדף הראשי הוא דינמי ומשתנה כמו כל רביע נבדק. בהפעלה זו, אותרו 1,414 נקבוביות יחיד.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
משלימה איור 2: FAST5 המרת קבצים לקבצים FASTQ. מצד ימין, הנה הפלט של נתונים מ הפעל רצף. כל שורה מייצגת מרצף בודדים. הצד השמאלי של האיור מציג את רצף המסומן מצד ימין, הצופה HDF הממירה את הרצף בקובץ FASTQ אשר יכול לשמש לצורך ניתוח נוסף. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
משלימה איור 3: דוגמה של FASTQ רצף במציג HDF. רצף זה (קריאה 803) הוא בקובץ FASTQ אשר ממירה את נתוני FAST5 נוקלאוטידים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis at JoVE.com

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Nanopore טכנולוגיה עבור רצפי מולקולות יש אפליקציות רחב במדעי החיים, כולל זיהוי של פתוגנים, ניטור בטיחות מזון, אנליזה גנומית, ניטור סביבתי metagenomic אפיון בקטריאלי עמידות לאנטיביוטיקה. במאמר זה, הוכח נוהל metagenomic אדמה רצפי DNA לצורך זיהוי מינים בטכנולוגיה רצף nanopore.

Nanopore רצפי DNA לניתוח Metagenomic אדמה

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

nanopore-dna-sequencing-for-metagenomic-soil-analysis

Research

JoVE Journal

Environment

30.2K Views.  Johns Hopkins University. Nanopore טכנולוגיה עבור רצפי מולקולות יש אפליקציות רחב במדעי החיים, כולל זיהוי של פתוגנים, ניטור בטיחות מזון, אנליזה גנומית, ניטור סביבתי metagenomic אפיון בקטריאלי עמידות לאנטיביוטיקה. במאמר זה, הוכח נוהל metagenomic אדמה רצפי DNA לצורך זיהוי מינים בטכנולוגיה רצף nanopore.

Video: Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Genetics

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

זיהוי מולקולרי באתר של קרקע בתפו Phytopathogens באמצעות מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and characterize microbial communities in environmental and biological systems. These measurements are even enabling enhanced analyses of complex soil microbial communities, which are the most complex microbial systems known to date. Multi-omic analyses, however, do have sample preparation challenges, since separate extractions are typically needed for each omic study, thereby greatly amplifying the preparation time and amount of sample required. To address this limitation, a 3-in-1 method for the simultaneous extraction of metabolites, proteins, and lipids (MPLEx) from the same soil sample was created by adapting a solvent-based approach. This MPLEx protocol has proven to be both simple and robust for many sample types, even when utilized for limited quantities of complex soil samples. The MPLEx method also greatly enabled the rapid multi-omic measurements needed to gain a better understanding of the members of each microbial community, while evaluating the changes taking place upon biological and environmental perturbations.

A protocol is presented for simultaneously extracting metabolites, proteins, and lipids from a single soil sample, allowing reduced sample preparation times and enabling multi-omic mass spectrometry analyses of samples with limited quantities.

פרוטוקול MPLEx עבור ניתוחים מולטי-omic של דגימות אדמה

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

Chemistry

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Biology

Visualizing Methane-Cycling Microbial Dynamics in Coastal Wetlands

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus playing a critical role in regulating the methane cycle. The wetlands in South Texas, which are subject to frequent weather events, fluctuating salinity levels, and anthropogenic activities due to climate change, influence methane cycling. Despite the ecological importance of these processes, methane cycling in South Texas coastal wetlands remains insufficiently explored. To address this gap, we developed and optimized a method for detecting genes related to methanogens and methanotrophs, including mcrA as a biomarker for methanogens and pmoA1, pmoA2, and mmoX as biomarkers for methanotrophs. Additionally, this study aimed to visualize the spatial and temporal distribution patterns of methanogen and methanotroph abundance utilizing the geographic information system (GIS) software ArcGIS Pro. The integration of these molecular techniques with advanced geospatial visualization provided critical insights into the spatial and temporal distribution of methanogen and methanotroph communities across South Texas wetlands. Thus, the methodology established in this study offers a robust framework for mapping microbial dynamics in wetlands, enhancing our understanding of methane cycling under varying environmental conditions, and supporting broader ecological and environmental change studies.

The protocol detects key methane-cycling genes in South Texas coastal wetlands and visualizes their spatial distribution to enhance understanding of methane regulation and its environmental impacts in these dynamic ecosystems.

הדמיה של דינמיקה מיקרוביאלית של מחזור מתאן בביצות חוף

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Bioengineering

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.